Summary
这里提出了猪分裂角膜纽扣的制备和培养的分步方案。由于这种通常培养的器官培养模型显示细胞死亡率在15天内，相当于人类捐赠角膜，它代表了第一个模型，允许长期种植非人类角膜，而不添加有毒的dextran。
Abstract
角膜内皮细胞的实验研究与几个困难有关。供体角膜很少，很少可用于实验性调查，因为通常移植需要角膜。内皮细胞培养物往往不能很好地翻译到体内的情况。由于非人类角膜的生物结构特征，栽培过程中的基质肿胀会导致角膜内皮细胞大量流失，长期难以进行栽培。脱毛剂（如 dextran）用于抵消此响应。然而，它们也导致显著的内皮细胞损失。因此，建立了不需要脱肿剂的体外器官培养模型。当地屠宰场的猪眼被用来准备分裂的角膜纽扣。局部角膜发角膜后，角膜的外层（表皮、弓形层、频闪部分）被移除。这大大减少了角膜内皮细胞损失引起的大规模基质肿胀和Descemet膜折叠在较长的培养期，并改善内皮细胞层的一般保存。随后，完全角膜裂解，然后从剩余的眼球和培养中去除分裂的角膜按钮。使用光显微镜在制备后长达15天的随访时间（即第1天、第8天、第15天）评估内皮细胞密度。使用制备技术可以更好地保存内皮细胞层，通过较少的基质组织肿胀实现，从而导致分裂角膜按钮与人类供体角膜相媲美的缓慢和线性下降率。由于这种标准化的有机体典型栽培研究模式首次允许稳定种植至少两周，它是人类供体角膜的宝贵替代品，用于今后研究各种外部因素，对角膜内皮的影响。
Introduction
角膜移植手术是全世界最常见的移植之一。由于人类供体角膜严重短缺，人类角膜内皮细胞的实验研究难以进行。然而，引进灌溉溶液和眼睛内使用的其他物质，眼科粘弹性装置，以及手术器械和技术（例如，乳化仪器和技术，超声波能量）需要临床使用前，对角膜内皮药的影响进行有效和广泛的调查。
除了人类供体角膜之外，几乎没有其他选择可供研究。动物研究模型是非常有价值的，但与此同时，非常耗费资源，并越来越质疑伦理。体外细胞培养的一个主要缺点是它们对人眼的翻译有限。从细胞培养得到的结果可能与体内条件不协调，因为细胞可能经历内皮性等位体过渡（EMT），导致细胞极性丧失和细胞形状和基因变化引起的成纤维细胞样形态表达式2.
而以前的前体模型报告培育期只有120小时，一种新的制备技术，以建立猪角膜内皮器官培养模型，通过培育新鲜猪角膜至少15天最近推出3 ，4，5，6.如果在种植前从角膜上皮和频闪部分（总计约300 μm）去除角膜，则角质的肿胀在分裂的角膜按钮中减少，从而减少内皮细胞损失，并维持良好的内皮细胞层后长达15天，而非分裂的角膜按钮显示显着的内皮细胞损失，由于不均匀的基质肿胀和德塞梅特的褶皱的形成。眼库通常使用渗透消肿剂，如dextran，以减少在移植前角膜肿胀。然而，这些制剂被证明诱导增加的内皮细胞损失7，8，9。
本文旨在以详细的分步协议来可视化这种标准化的体外研究模型，以便未来的研究者能够使用分割角膜按钮对角膜内皮进行研究。该模型代表一种简单的方法来测试眼睛中使用的物质和技术，如眼粘弹性装置、灌溉溶液和超声波能量，或角膜内皮感兴趣的其他程序。
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Protocol
本协议遵循我们机构的道德准则。根据我们机构道德审查委员会的章程，在实验之前无需获得道德批准，因为所有猪角膜都是从当地屠宰场获得的。
1. 器官文化
- 准备猪眼。
- 从当地的屠宰场，获得猪眼，在验尸后，但在热处理之前被摘除。将眼睛转移到实验室，并在几个小时内处理它们。在运输过程中，在加工前将眼睛保持在室温（约21°C） 下。
- 使用眼剪刀和大肠杆菌进行消毒之前，去除所有轨道腺体（眼肌、结膜、脂肪组织）。分离并丢弃所有有明显创伤、外部损伤（如刀切）或可见角膜不整的眼睛。
- 在无菌杯中制备 5% 碘-PBS 溶液 （1：20），在磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 溶液中加入 3 mL 的 7.5% 波维多碘。还准备一个单独的无菌杯，包含60 mL纯PBS。
注：使用的碘-PBS溶液总量和杯的大小取决于要解剖的角膜数量。五至六只眼睛需要大约 60 mL 的 5%碘-PBS 溶液进行适当消毒。 - 将五至六只眼睛放入5%碘-PBS溶液中，共5分钟，对眼睛表面进行适当消毒。小心搅拌每一分钟，以确保眼睛的表面完全浸没，并在碘溶液中完全消毒。
- 5分钟后，将消毒的眼睛转移到装满纯PBS的准备好杯子。再次，小心搅拌，以确保碘-PBS溶液从眼睛表面洗去。
注：在干净的长凳上执行此步骤，以防止消毒的眼睛受到污染。
- 准备细胞培养板。
注：在具有恒定层气流的清洁工作台上执行以下步骤。- 解冻2 mL的胎儿小牛血清（FCS）。使用钝管将注射器 （5 mL） 填充 FCS。通过注射器过滤器（0.22 μm）将注射器倒入，以防止FCS可能细菌污染至80 mL的无dextran培养基I（最低必需介质[MEM]，含Earle的盐、青霉素/链霉素、L-谷氨酰胺[200 mM]，五氯二苯甲酸B[250μg/mL]，海带缓冲液[1 M] [50x]，NaHCO3和蒸馏水。搅拌混合物，确保基板均匀分布。
- 用3 mL的基板混合物填充12孔细胞培养板的每个孔。
- 进行解剖和孵育。
注：在干净的长凳上执行此步骤。请勿用任何仪器触摸角膜内皮。- 将一个眼球从杯与PBS转移到眼球持有人与角膜朝上，并将其放在眼科手术显微镜下。使用装有 0.9% NaCl 的注射器，在眼球支架上稍微对眼睛施加一些吸力，将眼睛固定到位进行解剖。
- 使用含有标准化镶嵌的三角（± 7.5 mm），确保颤音深度不超过300μm，表面切入中央角膜（图1A）。
- 使用大肠杆菌钳和一次性手术刀与三角刀片切割和删除部分角膜部分水平通过频闪。丢弃由角膜上皮、弓手层和频闪部分组成的分离角膜部分。
注：严格保持水平切割方向，以获得剩余频闪的均匀厚度。 - 在实验中将10-0缝合（10-0聚酰胺6）放入频闪中，以便能够在实验中区分内皮和基质侧（图1B）。防止角膜内皮的渗透。如果内皮球被穿透，请丢弃眼球。
注：角膜内皮与缝合针的渗透是可见的，因为前眼室的液体会通过缝合通道泄漏。 - 使用没有镶嵌的颤音将颤动切割推进到全深度，直到达到前眼室（图1C）。角膜完全穿透后，可以看到前眼室的抵抗力和液体泄漏的明显下降。
注：如果裂角膜按钮在裂口后仍固定在分裂的角膜按钮的一侧，请使用曲棍球刀。 - 将获得的分割角膜按钮，现在由频闪的一部分（图2），Descemet的膜和角膜内皮，转移到培养基（培养基I +FCS，见第1.2节）到12孔细胞培养板与标记侧朝下，使角膜内皮朝上。
注：如果内皮侧朝下，内皮可能受损。 - 在后续过程中为每个分裂的角膜按钮分配一个单个编号，以便进行识别，并在细胞培养板上相应地标记孔。
- 在37°C、5%CO2和95%的相对空气湿度下，在标准条件下在培养箱中孵育填充细胞培养板。如果超过 7 天的潜伏期，则在第 8 天更改培养基（培养基 I + FCS）。
注：使用分割角膜按钮的孵育程序已验证长达15天。
图1：解剖猪角膜，获得角膜分割按钮。（A） 在角膜的颤变后，使用带镶嵌的颤音切割成300 μm的深度，并去除上皮和基质组织的某些部分，（B）缝合线表面地放入频闪，而不穿透角膜内皮，用于以后鉴定基质侧。（C） 剩余角膜完全裂开后，D） 从眼球上去除获得的裂角膜按钮.请点击此处查看此图的较大版本。
2. 内皮的显微镜和检查
- 执行无染色检查。
注：无污点检查可以多次执行（例如，在第 1 天、第 8 天和第 15 天的每周随访中）。然而，未染色计数只允许评估内皮细胞密度，而不是形态参数。- 在12孔细胞培养板的每口井中填充3 mL的亚通平衡盐溶液（hBSS，见材料表中的成分）。小心地在 hBSS 中放置单个分裂的角膜按钮，以诱导角膜内皮细胞肿胀，并提高细胞的可见性，以便进行细胞计数。
注：确保内皮侧朝向显微镜的方向。如果使用倒置相对比显微镜，内皮侧需要朝下。在就位时，培养板不应移动，以防止内皮细胞损伤。 - 让细胞膨胀1-2分钟，然后用相机连接到显微镜拍摄内皮。至少拍摄三张至少三个不同区域的照片，以便对角膜内皮的实际状况有代表性。添加一个比例尺，其真度到刻度长度为100μm，以便以后分析角膜内皮细胞密度和形态参数。
- 为了防止渗透损伤，在最多 5 分钟后从 hBSS 上取下分裂的角膜按钮，并将其移回培养基3。
- 在12孔细胞培养板的每口井中填充3 mL的亚通平衡盐溶液（hBSS，见材料表中的成分）。小心地在 hBSS 中放置单个分裂的角膜按钮，以诱导角膜内皮细胞肿胀，并提高细胞的可见性，以便进行细胞计数。
- 执行染色检查。
注：染色终止实验，因为所使用的染色物质是细胞毒性的。因此，染色只能在观察期结束时进行，以评估形态参数（改造数字、玫瑰花层、阿里扎林红染色细胞）。- 为染色程序准备 0.25% 试盘蓝色溶液和 0.2% 阿利扎林红色 S 溶液。
- 对于 0.25% 锥蓝色溶液，用 0.9% NaCl 溶液稀释 0.4% 的锥型蓝色溶液。
注：例如，要获得20 mL的0.25%锥蓝色溶液，用0.9%NaCl溶液的7.5 mL稀释0.4%锥蓝色溶液的12.5 mL。试青蓝溶液可在室温下储存数周或数月。 - 为了获得0.2%的阿利扎林红S溶液，在具有加热功能的磁体搅拌板上，在具有加热功能的磁搅拌板上，在50mL的0.9%NaCl溶液中溶解100mg的阿利扎林红S粉。要去除可能的沉淀物，请过滤所得溶液。通过相应地添加氢氧化钠或盐酸，将阿利扎林红S溶液的pH量调整至pH 4.2。
注：在每次应用 alizarin 红色 S 溶液之前，请确保 pH 被校正为 4.2，并且溶液中没有沉淀物。溶液可储存在室温下。请勿将溶液存放超过 4 周。
- 对于 0.25% 锥蓝色溶液，用 0.9% NaCl 溶液稀释 0.4% 的锥型蓝色溶液。
- 将分裂的角膜纽扣放在培养皿中，内皮侧朝上，以染色内皮细胞。使用移液器缓慢地将 0.25% 的锥形蓝色溶液滴入角膜内皮，90s。
注：Trypan蓝色允许识别受损的角膜细胞与渗透膜，因为它污渍其核。 - 小心地在小玻璃杯中冲洗分割角膜纽扣 3x，在 0.9% NaCl 中冲洗。再次，使用移液器缓慢地将0.2%的阿利扎林红S溶液滴入角膜内皮，90s。
注：Alizarin 红色 S 染色 Descemet 的膜，这有助于突出显示未受损的角膜内皮细胞中的细胞边界，并在底层 Descemet 膜可见时突出显示被破坏的细胞。此外，它可以很容易地识别更大的破坏区域。 - 为了检查染色角膜内皮，请按照第2.1节中解释的无染色计数的步骤进行。
- 为染色程序准备 0.25% 试盘蓝色溶液和 0.2% 阿利扎林红色 S 溶液。
3. 角膜内皮细胞密度和形态参数分析
- 使用图形编辑软件（材料表）对图片进行投影计数。
- 通过选择"文件 " 打开软件并打开角膜内皮的图像|打开 |选择。
- 在图像上投影一个与比例为 100 μm 的正比例方长度的正方形。
注：如果查看软件允许在图片上投影计数方块，则可以忽略第 3.1.2 节的以下步骤。正方形的侧面长度取决于使用显微镜相机拍摄的图像的分辨率，并且可以使用比例尺进行计算。- 从显微镜拍摄的照片中裁剪比例尺：选择工具栏上的矩形选取框工具或按M，然后边框比例尺，然后选择"编辑" |裁剪或按Ctrl = X。
- 单击文件 |新建（或按Ctrl = N）。在即将发布的窗口中，在"文档类型"下拉列表中选择剪贴板。显示的像素数是计数方块的边长。请注意其他图片的相应像素，然后单击"确定"。
- 选择文件 |新建（或Ctrl = N）。根据比例尺的长度，在即将到来的窗口中插入计数正方形的宽度和长度（以像素为单位）。选择背景颜色白色，然后按"确定"。
- 单击"选择 " |选择全部（或Ctrl + A）。选择"编辑" |复制（或Ctrl + C）。
- 选择步骤 3.1.1 中打开的角膜内皮的图像。选择"编辑" |粘贴（或Ctrl + V） 以在角膜内皮的照片上插入正方形。
- 选择正方形的图层并调整透明度。选择图层 |图层样式 |混合选项 |将不集中率设置为 30% |好的。
- 将投影的正方形保存为 100 μm 的正比刻度侧长。对分析所需的其他图片重复上述步骤。
- 评估内皮细胞密度和形态参数。
- 打开图像J（版本1.50i）中投影的方块，并使用细胞计数器插件对方块内的单元格进行计数。打开 ImageJ，选择"文件" |打开（ 或Ctrl = O） |选择图像。
注：ImageJ和CellCounter插件是免费软件，可在线下载。 - 选择插件 |单元格_计数器 |细胞计数器 |初始化。计算内皮细胞并记录结果。在正方形的两侧，计算由正方形边缘切割的单元格。不要计算其他两侧的切单元格。
- 分析来自不同区域的角膜至少六平方（例如，三张图片，每张图片两个方块），并确定每平方（100 μm2）的平均角膜内皮细胞密度。将内皮细胞密度乘以100，将每100μm2至1 mm2外推。
- 打开图像J（版本1.50i）中投影的方块，并使用细胞计数器插件对方块内的单元格进行计数。打开 ImageJ，选择"文件" |打开（ 或Ctrl = O） |选择图像。
- 为了评估形态变化，计算改造数字（由+4细胞/细胞边界而不是3个细胞组成的联席会议）、玫瑰花层形成（特征玫瑰形外观、围绕被破坏细胞的5个或更多径向排列的细胞），或预测方块中的阿里扎林红色区域（破坏的细胞）。
注：或者，在保存完好的样品中使用较大的方块（例如，200 x 200 μm2）进行形态分析，以获得更具代表性的结果可能很有用。
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Representative Results
提出的解剖技术意味着部分去除基质组织，导致角膜样本更薄，从而减少基质肿胀（图1和图2）。较少基质肿胀诱导较少的剪切和捏力，对角膜内皮有负面影响，从而导致较低的内皮细胞损失率6。与非分裂的角膜纽扣和整个角膜样本相比，分离角膜按钮在15天的培养后明显具有更好的保存性内皮细胞层，这反映了内皮细胞损失较少，改革次数较少数字（= 4个细胞/细胞边界连在一起，而不是3个），玫瑰花层（5个或更多径向排列的细胞在一个单一点会议），和阿利扎林红色（被摧毁）细胞后15天6。
在15天期间，裂角膜按钮显示内皮细胞密度稳步下降，平均每周百分比内皮细胞损失4.90%（n = 40，图3）。从第 1 天开始，内皮细胞密度为 4，033 ± 146/163 细胞/mm2（中位数 = 25%/75% 四分位数），第 8 天细胞密度降至 3，850 = 167/233 细胞/mm2，第 15 天为 3，650 ± 200/233 细胞/mm2。第一周和第二周的确定细胞损失相似。在第 1 天 -8 天，4.00 = 2.17/1.93%（中位数 = 25%/75% 四分位数）;第8天~15天，4.88~5.52/4.42%;第 1 天 -15 天，8.64 = 4.32/2.71%。因此，给定的下降率与先前研究10、11、12中人类供体角膜在种植时报告的速率相似。
形态参数在第15天染色后对内皮细胞层进行染色（n = 28，图4）。改革数字占合并单元边界的7.18 ±2.36/2.90%（中位数=25%/75%）。被调查的样本中存在1.11± 1.11± 1.11/15.56玫瑰花层/mm2（中位数 = 25%/75%四分位数）的中位数，而13.33 ± 4.44/11.67 阿利扎林红染色细胞/mm2（中位数 = 25%/75% 四分位数）标记准时细胞损失。
图5在hBSS（图5A）的微观评估期间和用锥形蓝和阿利扎林红色S染色后（图5B）提供了角膜内皮的代表性图像。hBSS 中内皮细胞密度的评估可以多次执行（例如，在第 1 天、第 8 天和第 15 天），而染色样品可用于评估形态参数（改造数字、玫瑰花层、阿利扎林红色染色由于大多数染色物质的细胞毒性，在实验结束时确定内皮细胞密度。
如果分割角膜按钮被放置和培养，内皮侧意外地朝下，预计会造成广泛的内皮细胞损伤（图6A）。非裂角膜纽扣由于基质肿胀导致内皮细胞损失显著增加，导致Descemet的膜在15天的培养中折叠（图6B），而分裂的角膜按钮则显示基本保存完好角膜内皮经过15天的培养，由分散的准时的阿利扎林红染色区指示单细胞破坏（图6C）。
图2：非分割角膜按钮和角膜分割按钮的图解图。去除300μm的猪角膜，包括上皮和基质组织的主要部分后，分裂的角膜按钮的厚度减少，以利于更好地保护角膜内皮，因为在整个基质肿胀减少种植长达15天。请点击此处查看此图的较大版本。
图3：15天内分割角膜按钮的内皮细胞密度（ECD）。分割角膜纽扣（n = 40）呈稳步下降。第1天ECD = 146/163细胞/毫米2（中位数 = 25%/75%四分位数）;第8天， 3，850 = 167/233细胞/毫米2;第15天，3，650 ×200/233细胞/毫米2。数据表示为中位数 = 25%/75% 四分位数，胡须表示最小和最大值或 1.5 的四分位数范围 （IQR）。请点击此处查看此图的较大版本。
图4：细胞损伤和重排过程进一步评估的形态参数。角膜内皮的微观照片在400倍放大后，15天的培养和染色与锥形蓝色和阿利扎林红色S显示（A）改革数字（箭头，四个或更多细胞/细胞边界的联席会议，而不是三），（B）玫瑰花形成（虚圆，中央递减细胞与五个或更多相邻细胞的特征玫瑰花形成）和（C）阿利扎林红染色细胞（虚圆，破坏细胞）。数据 （n = 28） 表示为中位数 = 25%/75% 四分位数。威士忌表示最小和最大值或四分位数范围 （IQR） 的 1.5。圆圈表示不在 IQR 内的异常值。请点击此处查看此图的较大版本。
图5：无污和染色角膜内皮。在微观评估（400倍放大倍数）中（A）下同度平衡盐溶液（hBSS）中所看到的内皮细胞层会导致内皮细胞肿胀，从而改善细胞的可见性，以及（B）在用锥蓝色染色后和阿利扎林红色S.请点击这里查看这个数字的较大版本。
图6：角膜内皮的概述照片（A）一个分裂的角膜按钮倒置栽培，（B）一个非分裂的角膜按钮，和（C）染色后的裂角膜按钮。照片显示，角膜内皮染色后染色与锥形蓝色和阿利扎林红色S.（A）广泛的角膜内皮细胞损伤（红色区域）被观察到后，分裂的角膜按钮培养与内皮侧朝下后一周的栽培。（B） 由于 Descemet 的膜折叠和 15 天培养后的基质肿胀（红色条纹），非分裂的角膜按钮的内皮细胞损伤明显增加。（C） 分割角膜纽扣显示，经过15天的培养后，内皮细胞层保存完好，只显示在阿利扎林红染色区看到的准时破坏细胞。请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
该协议提供了一种制备猪分裂角膜纽扣的方法，它代表了一种标准化和低成本的外体角膜内皮器官培养模型，用于研究目的6。猪分裂角膜纽扣显示内皮细胞密度下降，与在眼库培养的人类供体角膜中观察到的内皮细胞损失相当，在两周内6，10，11， 12.
优于非分裂的角膜纽扣以及整个猪角膜样本之前显示了6。在这项研究中，对第1天、第8天和第15天对三组进行了比较。所有组的角膜内皮（角膜纽扣、非分裂的角膜纽扣、裂角膜纽扣）在第1天处于良好状态，由保存完好的内皮细胞层6表示。然而，由于基质肿胀，德塞梅特膜的折叠破坏了整个角膜样本的大面积内皮，因此无法对第8天和第15天的角膜内皮细胞密度进行有代表性的评估。虽然非裂角膜纽扣的内皮膜保存良好，直到第15天，一些Descemet的膜褶皱也存在。虽然与角膜样本相比，非裂角膜按钮的内皮细胞层状况较好，但裂角膜按钮的内皮细胞层状况要好得多。这可以从定量和定性参数中看，因为非裂角膜按钮（p = 0.041）在培养后15天内的内皮细胞损失明显高于分角膜按钮（-575 × 25/250细胞/mm 2）（-417 =138/179细胞/毫米2），这与在更常规的六边形细胞模式中明显的确定的形态特征一致，较少改造数字和玫瑰花纹形成，以及分裂中破坏的细胞（Alizarin 红色区域）较少角膜纽扣6.百分度内皮细胞损失证实了这些发现，因为非裂角膜和裂角膜按钮在15天内的百分比细胞损失分别为14.89%和10.2%（p = 0.032）6 。由于这种方法被验证长达15天，它允许更长的观察期比迄今发表的研究（72至120小时）3，4，5。
内皮细胞层的保存，应用常见的培养方案也用于眼库，改善，可以完全归因于角膜频闪肿的减少，因为在角质质之前去除了基质的主要部分（300μm）培养6，13.通常，频闪在培养过程中会膨胀，因为它的亲水特性和分子嵌入在基质组织14，15。肿胀，诱导剪切和挤压力和Descemet的膜折叠，这也导致机械应变角膜内皮和内皮细胞损失，在部分去除频闪6，10后减少。与眼库相反，它经常使用渗透剂，如dextran在移植前使人类供体角膜脱光，分裂的角膜纽扣不需要渗透消除16，17。由于培养基补充dextran已知被角膜内皮细胞吸收，并诱导增加细胞损失7，8，9，18，19 ，20，培养分裂的角膜纽扣没有dextran（或其他渗透剂）消除尽可能多的负面毒性因素，尽可能6。由于培养基在所呈现的方法中没有添加任何添加剂，因此预计不会受到任何添加物质的毒性影响，因此该模型对于研究新物质的生物相容性试验具有价值。
虽然角膜内皮是一个非常微妙的细胞层，而分割角膜按钮的制备需要适度的手术技巧和温和的处理，但该技术可以是一种标准化的方法，可以处理并取得可靠的结果。各种因素在非常合理的时间范围内对角膜内皮的影响。尽管如此，在这个协议中有几个步骤，角膜内皮存在风险。显然，损坏或不透明的眼睛需要仔细识别和丢弃在开始，以防止可能的偏差。此外，角膜内皮在裂角膜按钮的裂口、解剖、提取和处理过程中（例如，从眼睛转移到文化板、从文化板到培养板等）时必须始终保持不变，以防止任何机械损坏。当缝合线表面地放置在频闪中时，如果针头不小心插入深度太远，内皮可能穿透。如果是这样，来自前眼室的明显液体将穿过缝合通道，相应的眼睛需要被丢弃。为了防止这种情况，针头应表面上保持在频闪内。此外，必须小心使用手术刀严格分割角膜按钮水平。不均匀的切割会导致种植期间不均匀肿胀，可能导致内皮细胞损失增加。
hBSS中未染色角膜内皮细胞的检查通常发生在人类供体角膜中。在hBSS3中选择的角膜键的检测时间，没有证据表明内皮细胞的渗透肿胀导致细胞严重损伤。虽然染色提高了细胞边界的可见性，但无染色计数不会导致内皮细胞密度与染色计数21明显不同的结果。无染色计数的明显好处是，它允许在整个实验过程中进行多次后续检查，而染色物质通常是细胞毒性并终止观察期。然而，染色计数对于评估内皮的形态特征仍然很重要。Trypan 蓝色突出显示受损细胞的细胞核，这些细胞在未染色计数中通常看起来未损坏。Alizarin Red S 通过染色 Descemet 的膜，明显提高了细胞边界和受损细胞的可见性，从而有助于评估内皮细胞密度，并允许分析角膜内皮的形态特征，如改造数字、玫瑰花层和阿利扎林红染色细胞（图4）。
分离角膜按钮作为体外模型的一个主要限制是，就像体外模型一样，它们只适合研究对角膜内皮细胞的外部影响。因此，体内模型对于研究对眼睛和角膜内皮有影响的系统疾病和条件是不可替代的。无论如何，这种制备技术可以生成有效的数据来测试各种外部因素对角膜内皮的影响（例如，在新物质的生物相容性测试中）22。遵循3R原理（替换、减少、细化），以减少活体动物实验的数量，该方法提供了一个适当的研究模型，以进一步缩小体外细胞培养物之间的差距，结果往往与人类的活体状况和动物研究，这需要大量的努力，并日益引起伦理问题23。
由于其特性和可用性，猪眼似乎是唯一足以替代人眼的研究目的。由于伦理原因和可得性，非人类灵长类动物的角膜不是一个好的替代品，尽管这些动物是最接近人类的物种。另一方面，小动物的眼睛太小，无法有效去除角膜。猪眼在大小上可与人眼相媲美，并表现出角膜内皮细胞的类似特性，这也反映在有关转基因猪角膜未来可能的异种移植的研究24中。25，26.此外，作为屠宰场的副产品，它们很容易获得。
总之，使用猪角膜的方法提供了一种高度可重复的有机典型培养研究模型，从而能够对角膜内皮细胞进行具有成本效益的研究。未来的研究者可能使用分割角膜按钮来分析各种因素的影响，如新物质、手术技术、设备和其他可能的外部影响，其中角膜内皮是极大的兴趣。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
所提供的研究模型的建立得到了德国联邦教育和研究部的KMU-创新（FKZ：13GW0037F）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Subject | |||
| Pig eyes | local abbatoir | ||
| Substances | |||
| Alizarin red S | Sigma-Aldrich, USA | ||
| Culture Medium 1, #F9016 | Biochrom GmbH, Germany | ||
| Dulbecco's PBS (1x) | Gibco, USA | ||
| Fetal calf serum | Biochrom GmbH, Germany | ||
| Hydrochloric acid (HCl) solution | own production | ||
| Hypotonic balanced salt solution | own production | per 1 L of H2O: NaCl 4.9 g; KCl 0.75 g; CaCl x H2O 0.49 g; MgCl2 x H2O 0.3 g; Sodium Acetate x 3 H2O 3.9 g; Sodium Citrate x 2 H2O 1.7 g | |
| Povidon iodine 7.5%, Braunol | B. Braun Melsungen AG, Germany | ||
| Sodium chloride (NaCl) 0.9% | B. Braun Melsungen AG, Germany | ||
| Sodium hydroxide (NaOH) solution | own production | ||
| Trypan blue 0.4% | Sigma-Aldrich, USA | ||
| Materials & Instruments | |||
| Accu-jet pro | Brand GmbH, Germany | ||
| Beaker Glass 50 mL | Schott AG, Germany | ||
| Blunt cannula incl. Filter (5 µm) 18G | Becton Dickinson, USA | ||
| Cell culture plate (12 well) | Corning Inc., USA | ||
| Colibri forceps | Geuder AG, Germany | ||
| Corneal scissors | Geuder AG, Germany | ||
| Eppendorf pipette | Eppendorf AG, Germany | ||
| Eye Bulb Holder | L. Klein, Germany | ||
| Eye scissors | Geuder AG, Germany | ||
| Folded Filter ø 185 mm | Whatman, USA | ||
| Hockey knife | Geuder AG, Germany | ||
| Laboratory Glass Bottle with cap 100 mL | Schott AG, Germany | ||
| Magnetic stir bar | Carl Roth GmbH & Co. KG, Germany | ||
| MillexGV Filter (5 µm) | Merck Millopore Ltd., USA | ||
| Needler holder | Geuder AG, Germany | ||
| Petri dishes | VWR International, USA | ||
| Pipette tips | Sarstedt AG & Co., Germany | ||
| Scalpel (single use), triangular blade | Aesculap AG & Co. KG, Germany | ||
| Serological pipette 10 mL | Sarstedt AG & Co., Germany | ||
| Serological pipette 5 mL | Sarstedt AG & Co., Germany | ||
| Sterile cups | Greiner Bio-One, Österreich | ||
| Sterile gloves | Paul Hartmann AG, Germany | ||
| Sterile surgical drape | Paul Hartmann AG, Germany | ||
| Stitch scissors | Geuder AG, Germany | ||
| Suture Ethilon 10-0 Polyamid 6 | Ethicon Inc., USA | ||
| Syringe (5 mL) | Becton Dickinson, USA | ||
| trephine ø 7.5 mm | own production | ||
| Tying forceps | Geuder AG, Germany | ||
| Weighing paper | neoLab Migge GmbH, Germany | ||
| Equipment & Software | |||
| Binocular surgical microscope | Carl Zeiss AG, Germany | ||
| Camera mounted on microscope | Olympus, Japan | ||
| CellSens Entry (software) | Olympus, Japan | ||
| Cold-light source | Schott AG, Germany | ||
| Incubator | Heraeus GmbH, Germany | ||
| Inverted phase contrast microscope | Olympus GmbH, Germany | ||
| Magnetic stirrer with heating function | IKA-Werke GmbH & Co. KG, Germany | ||
| pH-meter pHenomenal | VWR International, USA | ||
| Photoshop CS2 | Adobe Systems, USA | ||
| Precision scale | Ohaus Europe GmbH, Switzerland |
References
- Gain, P., et al. Global Survey of Corneal Transplantation and Eye Banking. JAMA Ophthalmology. 134 (2), 167-173 (2016).
- Roy, O., et al. Understanding the process of corneal endothelial morphological change in vitro. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (2), 1228-1237 (2015).
- Meltendorf, C., Ohrloff, C., Rieck, P., Schroeter, J. Endothelial cell density in porcine corneas after exposure to hypotonic solutions. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 245 (1), 143-147 (2007).
- Schroeter, J., Meltendorf, C., Ohrloff, C., Rieck, P. Influence of temporary hypothermia on corneal endothelial cell density during organ culture preservation. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 246 (3), 369-372 (2008).
- Schroeter, J., Ruggeri, A., Thieme, H. Impact of temporary hyperthermia on corneal endothelial cell survival during organ culture preservation. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 253 (5), 753-758 (2015).
- Kunzmann, B. C., et al. Establishment Of A Porcine Corneal Endothelial Organ Culture Model For Research Purposes. Cell and Tissue Banking. 19 (3), 269-276 (2018).
- Redbrake, C., et al. A histochemical study of the distribution of dextran 500 in human corneas during organ culture. Current Eye Research. 16 (5), 405-411 (1997).
- Zhao, M., et al. Poloxamines for Deswelling of Organ-Cultured Corneas. Ophthalmic Research. 48 (2), 124-133 (2012).
- Filev, F., et al. Semi-quantitative assessments of dextran toxicity on corneal endothelium: conceptual design of a predictive algorithm. Cell and Tissue Banking. 18 (1), 91-98 (2017).
- Pels, E., Schuchard, Y. Organ-culture preservation of human corneas. Documenta Ophthalmologica. 56 (1-2), 147-153 (1983).
- Borderie, V. M., Kantelip, B. M., Delbosc, B. Y., Oppermann, M. T., Laroche, L. Morphology, Histology and Ultrastructure of Human C31 Organ-Cultured Corneas. Cornea. 14 (3), 300-310 (1995).
- Linke, S. J., et al. Thirty years of cornea cultivation: long-term experience in a single eye bank. Acta Opthalmologica. 91 (6), 571-578 (2013).
- Schroeter, J., et al. Arbeitsrichtlinien - Gute Fachliche Praxis für Hornhautbanken [Procedural guidelines. Good tissue practice for cornea banks]. Ophthalmologe. 106 (3), 265-276 (2009).
- Dohlman, C. H., Hedbys, B. O., Mishima, S. The swelling pressure of the corneal stroma. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 1, 158-162 (1962).
- Xuan, M., et al. Proteins of the corneal stroma: importance in visual function. Cell and Tissue Research. 364 (1), 9-16 (2016).
- Sperling, S. Human Corneal Endothelium in Organ Culture - The Influence of Temperature and Medium of Incubation. Acta Opthalmologica. 57 (2), 269-276 (1979).
- Schroeter, J. Endothelial Evaluation in the Cornea Bank. Developments in Ophthalmology. 43, 47-62 (2009).
- Pels, E., Schuchard, Y. The Effects of High Molecular Weight dextran on the Presevation of Human Corneas. Cornea. 3 (3), 219-227 (1985).
- van der Want, H. J. L., Pels, E., Schuchard, Y., Olesen, B., Sperling, S. Electron Microscopy of Cultured Human Corneas Osmotic Hydration and the Use of dextran Fraction (dextran T 500) in Organ Culture. Archives of Ophthalmology. 101 (12), 1920-1926 (1983).
- Thuret, G., Manissolle, C., Campos-Guyotat, L., Guyotat, D., Gain, P. Animal compound-free medium and poloxamer for human corneal organ culture and Deswelling. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 46 (3), 816-822 (2005).
- Wenzel, D. A., Kunzmann, B. C., Spitzer, M. S., Schultheiss, M. Staining of endothelial cells does not change the result of cell density. Cell and Tissue Banking. 20 (2), 327-328 (2019).
- Wenzel, D. A., Kunzmann, B. C., Hellwinkel, O., Druchkiv, V., Spitzer, M. S., Schultheiss, M. Effects of perfluorobutylpentane (F4H5) on corneal endothelial cells. Current Eye Research. , (2019).
- Olsson, I. A. S., Franco, N. H., Weary, D. M., Sandøe, P. The 3Rs principle - mind the ethical gap! ALTEX Proceedings, 1/12, Proceedings of WC8. , 333-336 (2012).
- Sanchez, I., Martin, R., Ussa, F., Fernandez-Bueno, I. The parameters of the porcine eyeball. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 249 (4), 475-482 (2011).
- Kim, M. K., Hara, H. Current status of corneal xenotransplantation. International Journal of Surgery. 23 (Pt B), 255-260 (2015).
- Fujita, M., et al. Comparison of Proliferative Capacity of Genetically-Engineered Pig and Human. Ophthalmic Research. 49 (3), 127-138 (2013).
