Summary
Här, en steg-för-steg-protokollet för beredning och odling av porcin Split hornhinnan knappar presenteras. Eftersom denna Organo-typiskt odlade organ kultur modell visar celldöd priser inom 15 dagar, jämförbar med mänsklig givare hornhinnor, det representerar den första modellen möjliggör långsiktig odling av icke-mänskliga hornhinnor utan att lägga giftiga dextran.
Abstract
Experimentell forskning på hornhinnan endotelceller är förknippad med flera svårigheter. Humana donator hornhinnor är knappa och sällan tillgängliga för experimentella undersökningar eftersom de normalt behövs för transplantation. Endoteliala cellkulturer översätter ofta inte väl till in vivo-situationer. På grund av de biostrukturella egenskaperna hos icke-mänskliga hornhinnor, stromacellstumörer svullnad under odling inducerar betydande hornhinnan endotelial cellförlust, vilket gör det svårt att utföra odling under en längre tid. Desvällning agenter såsom dextran används för att motverka detta svar. Emellertid, de orsakar också betydande endotelial cellförlust. Därför fastställdes en modell för ex vivo-organkultur som inte krävde desvällingsmedel. Svin ögon från ett lokalt slakteri användes för att förbereda Split hornhinnan knappar. Efter partiell hornhinnan trephination, de yttre lagren av hornhinnan (epitel, Bowman skikt, delar av stroma) avlägsnades. Detta minskar signifikant korneal endotelial cellförlust induceras av massiva stromacellstumörer svullnad och Descemet membran vikning under längre odlings perioder och förbättrar allmän bevarande av endotelceller lagret. Efterföljande fullständig korneal trephination följdes av avlägsnande av den delade hornhinnan knappen från kvarvarande ögat glödlampa och odling. Endotelcellernas densitet bedömdes vid uppföljnings tider på upp till 15 dagar efter beredning (dvs. dag 1, 8, 15) med hjälp av ljusmikroskopi. Den förberedelse teknik som används möjliggör en bättre bevarande av endotelceller lagret möjliggörs av mindre stromacellstumörer vävnad svullnad, vilket resulterar i långsam och linjär nedgång i Split hornhinnan knappar jämförbara med mänskliga donator hornhinnor. Eftersom denna standardiserade Organo-typiskt odlade forskningsmodell för första gången möjliggör en stabil odling i minst två veckor, det är ett värdefullt alternativ till mänsklig donator hornhinnor för framtida utredningar av olika externa faktorer när det gäller deras effekter på hornhinnan endotelet.
Introduction
Korneal transplantation förfaranden är bland de vanligast utförda transplantationer över hela världen1. Eftersom det finns en allvarlig brist på mänskliga donator hornhinnor, experimentell forskning adressering hornhinnan endotelceller i mänskliga hornhinnor är svårt att utföra1. Emellertid, införandet av bevattningslösningar och andra ämnen som används inom ögat, oftalmologiska viskoelastiska enheter, samt kirurgiska instrument och tekniker (t. ex., phacoemulfication instrument och tekniker, ultraljud energi) kräver giltiga och omfattande utredningar om deras effekter på hornhinnan endotelet innan klinisk användning.
Få alternativ till mänsklig donator hornhinnor finns för forskning. Djur forskningsmodeller är mycket värdefulla men samtidigt mycket resurskrävande och alltmer ifrågasatt etiskt. En stor nackdel med in vitro cellkulturer är deras begränsade översättning till det mänskliga ögat. Resultat från cellkulturer kan vara inkongruösa i in vivo villkor, eftersom celler kan genomgå endotelial mesenkymala övergång (EMT), vilket resulterar i fibroblast-liknande morfologi orsakad av förlusten av cellpolaritet och förändringar i cell form och gen uttryck2.
Tidigare ex vivo-modeller rapporterade odlings perioder på upp till endast 120 h, en ny berednings teknik för att upprätta en endotelial organ kultur modell av porcin som odlas på färska svin hornhinnor i minst 15 dagar infördes nyligen3 ,4,5,6. Om hornhinnan epitel och delar av stroma avlägsnas (ca 300 μm totalt) från hornhinnan före odling, svullnad av stroma reduceras i Split hornhinnan knappar resulterar i mindre endotelial cellförlust och en väl underhållna endoteliala cellskikt efter upp till 15 dagar, medan icke-Split hornhinnan knappar visar signifikant endotelial cellförlust på grund av ojämn stromalsvullnad och bildandet av Descemets veck. Eye banker använder vanligtvis osmotiska Avsvällning agenter såsom dextran att minska svullnad av hornhinnor före transplantation. Emellertid, dessa agenter visades inducera ökad endotelial cellförlust7,8,9.
Denna artikel syftar till att visualisera denna standardiserade ex vivo forskningsmodell i en detaljerad steg-för-steg-protokollet för att möjliggöra framtida utredare att utföra forskning på hornhinnan endotelet med delad hornhinnan knappar. Denna modell är en enkel metod för att testa ämnen och tekniker som används i ögat, såsom oftalmologiska viskoelastiska enheter, bevattningslösningar, och ultraljud energi, eller andra förfaranden där hornhinnan endotel är av intresse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Detta protokoll följer vår institutions etiska riktlinjer. I enlighet med stadgarna för vår institutions etiska prövnings kommitté behövde inget etiskt godkännande erhållas före experimenten, eftersom alla svin hornhinnor erhölls från det lokala slakteriet.
1. orgel kultur
- Förbered gris ögon.
- Från det lokala slakteriet, få svin ögon som avlägsnades strax efter döden men före termisk behandling. Transportera ögonen till labbet och bearbeta dem inom några timmar. Under transporten, håll ögonen vid rumstemperatur (ca 21 ° c) före bearbetning.
- Ta bort alla orbital adnexes (ögonmuskler, konjunktiva, fettvävnad) före desinfektion med hjälp av ögat sax och Colibri pinps. Separera och kassera alla ögon med uppenbara trauma, yttre skador (t. ex. kniv skuren), eller synliga hornhinnan opacities.
- Bered en 5% jod-PBS-lösning (1:20) i en steril kopp genom att tillsätta 3 mL 7,5% povidonjod till 57 mL av en fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Också förbereda en separat steril kopp innehållande 60 mL ren PBS.
Anmärkning: den totala mängden använda jod-PBS-lösning och storleken på koppen beror på antalet hornhinnor som skall dissekeras. Fem till sex ögon kräver cirka 60 mL av 5%-jod-PBS-lösning som skall desinficeras ordentligt. - Sätt fem till sex ögon i 5%-jod-PBS-lösning för totalt 5 min för att korrekt desinficera ögons yta. Rör försiktigt varje minut för att säkerställa att ögats yta är helt nedsänkt och desinficeras helt i jodlösningen.
- Efter 5 min, överföra desinficerade ögon till beredd kopp fylld med ren PBS. Återigen, försiktigt rör om för att säkerställa jod-PBS-lösningen tvättas bort från ögats yta.
Anmärkning: utför detta steg på en ren bänk för att förhindra kontaminering av de desinficerade ögonen.
- Förbered cellkultur plattorna.
Anmärkning: utför följande steg på en ren bänk med konstant laminärt luftflöde.- Tina 2 mL fetalt kalv serum (FCS). Fyll en spruta (5 mL) med FCS med en trubbig kanyl. Töm sprutan genom ett sprutfilter (0,22 μm) för att förhindra eventuell bakteriell förorening av FCS till 80 mL dextran-fritt odlingsmedium I (minsta viktiga medium [MEM] med Earle ' s salter, penicillin/streptomycin, L-glutamin [200 mM], amfotericin B [250 μg/mL], Hepes buffert [1 M] [50x], NaHCO3, och destillerat vatten). Skaka blandningen för att säkerställa jämn substrat fördelning.
- Fyll varje brunn av en 12 väl cellkultur tallrik med 3 mL av substrat blandningen.
- Utför dissektion och inkubering.
Obs: utför detta steg på en ren bänk. Vidrör inte hornhinnan endotelet med några instrument.- Överför en ögon lampa från koppen med PBS i ögat glödlampa hållaren med hornhinnan vänd uppåt och placera den under en oftalmologiska kirurgiska Mikroskop. Använd en spruta fylld med 0,9% NaCl att något Applicera en del sug till ögat över ögat glödlampa innehavaren att fixera ögat i läge för dissektion.
- Använd en trefin (ø 7,5 mm) som innehåller en standardiserad inlaga, vilket säkerställer att det treferade djupet inte överskrider 300 μm, för att skära ytligt i den centrala hornhinnan (figur 1a).
- Använd Colibri pincett och en engångsskalpell med ett triangulärt blad för att klippa och ta bort den delvis trefalined delen av hornhinnan horisontellt genom stroma. Kassera den separerade hornhinnan delen bestående av hornhinnan epitel, den Bowman skikt, och en del av stroma.
Obs: strikt bibehålla horisontell skär riktning för att få en jämn tjocklek av den kvarvarande stroma. - Placera ytligt en 10-0 sutur (10-0 polyamid 6) i stroma att kunna differentiera endotelceller från stromacellstumörer sidan under experimenten (figur 1B). Förhindra penetration av hornhinnan endotelet. Kassera ögon lampan om endotelet trängt in.
Anmärkning: penetration av hornhinnan endotelet med suturering nålen kommer att vara synlig, som vätska från den främre ögonkammaren kommer att läcka genom suturen kanalen. - Använd trefin utan inlaga för att föra det treferade snittet till fullt djup tills den främre ögonkammaren är nådd (figur 1C). En distinkt droppe i motståndet och vätska läcker från den främre ögonkammaren kan uppfattas efter fullständig penetration av hornhinnan.
Obs: Använd en hockey kniv om den delade hornhinnan knappen förblir fäst på ena sidan av den delade hornhinnan knappen efter trephination. - Överför den erhållna Split hornhinnan knappen, som nu består av en del av stroma (figur 2), den Descemet membran, och hornhinnan endotelet, i odlingsmediet (odlingsmedium i + FCS, se avsnitt 1,2) i 12 brunnen cellkultur plattan med märkt sida vänd nedåt, så att hornhinnan endotelet är vänd uppåt.
Anmärkning: om endotelsidan är vänd nedåt kan endotelet skadas. - Tilldela ett individuellt nummer till varje delad hornhinnans knapp för identifiering under uppföljningarna och märk brunnarna på cell odlingsplattan därefter.
- Inkubera de fyllda cell odlings plattorna i en inkubator under standardbetingelser vid en temperatur på 37 ° c, 5% CO2 och en relativ luftfuktighet på 95%. Ändra odlingsmediet (odlingsmedium I + FCS) dag 8 om en inkubationstid på 7 dagar överskrids.
Observera: inkubations proceduren med delade hornhinnan knappar har validerats i upp till 15 dagar.
Figur 1: dissektion av svin hornhinnan för att få delade hornhinnan knappar. (A) efter trephination av hornhinnan med hjälp av en trefin med en inlaga att skära i ett djup av 300 μm och avlägsnande av epitel och delar av stromacellstumörer vävnad, (B) en sutur placeras ytligt i stroma utan penetration av hornhinnan endotelet för senare identifiering av stromacellstumörer sidan. (C) fullständig trefaltning av den återstående hornhinnan följs av (D) avlägsnande av den erhållna Split hornhinnan knappen från ögat glödlampa. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
2. mikroskopi och undersökning av endotelet
- Utför ofärgade undersökningar.
Obs: ofärgade undersökningar kan utföras flera gånger (t. ex. vid veckovisa uppföljningar på dag 1, 8 och 15). Men, obefläckade räkning endast tillåter bedömning av endotelceller densitet, inte morfologiska parametrar.- Fyll 3 mL hypotonisk balanserad saltlösning (hBSS, se komposition i tabell över material) i varje brunn av en 12 väl cellkultur tallrik. Placera försiktigt en enda delad hornhinnan knapp i hBSS att framkalla svullnad av hornhinnan endotelceller och förbättra synligheten av cellerna för cellräkning.
Obs: se till att den endoteliala sidan är vänd mot mikroskopet. Om ett inverterat faskontrastmikroskop används måste endotelsidan vara vänd nedåt. Medan på plats, kultur plattan bör inte flyttas för att förhindra endotelceller skador. - Låt cellerna sväller för 1-2 min innan du tar en bild av endotelet med kameran ansluten till mikroskopet. Ta minst tre fotografier av minst tre olika områden för att få ett representativt intryck av det faktiska tillståndet hos hornhinnan endotelet. Lägg till en skalstapel med den sanna till skallängd på 100 μm för senare analys av hornhinnan endotelceller densitet och morfologiska parametrar.
- För att förhindra osmotiska skador, ta bort den delade hornhinnan knappen från hBSS efter högst 5 min och överföra den tillbaka till kultur mediet3.
- Fyll 3 mL hypotonisk balanserad saltlösning (hBSS, se komposition i tabell över material) i varje brunn av en 12 väl cellkultur tallrik. Placera försiktigt en enda delad hornhinnan knapp i hBSS att framkalla svullnad av hornhinnan endotelceller och förbättra synligheten av cellerna för cellräkning.
- Utföra målat undersökning.
Anmärkning: färgning avslutar experiment, eftersom färgning ämnen som används är cytotoxiska. Därför kan färgning endast utföras i slutet av observationsperioden för bedömning av morfologiska parametrar (reformationer, rosetter, alizarin röda färgade celler).- Förbered en 0,25% trypan blå lösning och 0,2% alizarin Röd S lösning för färgning förfarande.
- För 0,25% trypan blå lösning, späd 0,4% trypan blå lösning med en 0,9% NaCl-lösning.
Anmärkning: till exempel för att få 20 mL av en 0,25% trypan blå lösning, späd 12,5 mL av 0,4% trypan blå lösning med 7,5 mL av 0,9% NaCl lösning. Trypan Blue-lösningen kan förvaras i rumstemperatur i flera veckor eller månader. - För att erhålla en 0,2% alizarin Red S lösning Lös 100 mg av alizarin Red S pulver i 50 mL av en 0,9% NaCl-lösning under ständig omrörning och upphettning till 50 ° c på en magnet omrörnings platta med uppvärmningsfunktion. För att avlägsna eventuella fällar, filtrera den erhållna lösningen. Justera pH-värdet för alizarin Red S-lösningen till pH 4,2 genom att tillsätta natriumhydroxid eller saltsyra i enlighet med detta.
Anmärkning: före varje applicering av alizarin Red S lösning se till att pH korrigeras till 4,2 och att det inte finns några fällar i lösningen. Lösningen kan förvaras i rumstemperatur. Förvara inte lösningen längre än 4 veckor.
- För 0,25% trypan blå lösning, späd 0,4% trypan blå lösning med en 0,9% NaCl-lösning.
- Placera de delade hornhinnan knapparna i petriskålar med endoteliala sidan vänd uppåt för att färga endotelcellerna. Använd en pipett för att sakta droppa 0,25% trypan blå lösning droppe för droppe på hornhinnan endotelet för 90 s.
Obs: Trypan blå tillåter identifiering av skadade hornhinnan celler med en permeabel membran eftersom det fläckar deras kärnor. - Skölj försiktigt av den delade hornhinnan knappen 3x i 0,9% NaCl i en liten glasbägare. Återigen, Använd en pipett för att sakta droppa 0,2% alizarin Red S lösning droppe för droppe på hornhinnan endotelet för 90 S.
Anmärkning: alizarin Red S fläckar på Descemets membran, vilket hjälper till att markera cellkanter i oskadade hornhinnans endotelceller och att markera förstörda celler när underliggande Descemets membran blir synligt. Också, det möjliggör enkel identifiering av större förstörda områden. - För undersökning av färgade hornhinnan endotelet Följ stegen förklaras för obefläckade räkna i avsnitt 2,1.
- Förbered en 0,25% trypan blå lösning och 0,2% alizarin Röd S lösning för färgning förfarande.
3. analys av horn hinnens endotelcelldensitet och morfologiska parametrar
- Projicera kvadrater på bilderna med hjälp av ett grafikredigeringsprogram (tabell över material).
- Öppna programvaran och öppna en bild av hornhinnan endotelet genom att välja fil | Öppna | Välj.
- Projicera en kvadrat med en true to Scale-sidlängd på 100 μm på bilden.
Anmärkning: följande steg i avsnitt 3.1.2 kan ignoreras om visningsprogrammet möjliggör projicering av räknerutor på bilden. Kvadraten på sido längden beror på upplösningen på bilderna tagna med mikroskopet kamera och kan beräknas med skalstapeln.- Beskär skalstapeln från fotot som tagits med mikroskopet: Välj verktyget Rektangulärt markeringsram i verktygs fältet eller tryck på M, sedan på kantlinje i skalstapeln och välj sedan Redigera | Beskär eller tryck på CTRL + X.
- Klicka på Arkiv | Ny (eller tryck på CTRL + N). I det kommande fönstret väljer du Urklipp i listrutan Dokumenttyp . Antalet pixlar som visas är sidlängden för inventerings kvadraten. Anteckna motsvarande pixlar för de andra bilderna och klicka på OK.
- Välj fil | Ny (eller CTRL + N). Sätt in bredden och längden (i pixlar) på inventerings kvadraten i det kommande fönstret enligt skalstapeln. Välj bakgrundsfärg vitoch tryck sedan på OK.
- Klicka på Välj | Markera alla (eller CTRL + A). Välj Redigera | Kopiera (eller CTRL + C).
- Välj bilden av hornhinnan endotelet öppnas i steg 3.1.1. Välj Redigera | Klistra in (eller CTRL + V) för att infoga kvadraten på bilden av hornhinnan endotelet.
- Markera kvadratens lager och justera genomskinligheten. Välj lager | Lagerstil | Blandningsalternativ | Ställ in opacitet på 30% | OK.
- Spara bilden med den projicerade kvadraten med en sann till skala sidlängd på 100 μm. Upprepa med de andra bilderna som behövs för analys.
- Bedöma endotelcellernas densitet och morfologiska parametrar.
- Öppna bilderna med de projicerade rutorna i ImageJ (version 1.50 i) och Använd CellCounter-insticksprogrammet för att räkna cellerna i kvadraten. Öppna ImageJ, Välj fil | Öppna (eller CTRL + O) | Välj bild.
Obs: ImageJ och CellCounter PlugIn är freeware tillgängliga för nedladdning på nätet. - Välj insticksmoduler | Cell_Counter | Cell räknare | Initiera. Räkna endotelcellerna och registrera resultatet. På två sidor av kvadraten, räkna de celler som skärs av kvadraten kant. Räkna inte skära celler på de andra två sidorna.
- Analysera minst sex kvadrater per hornhinna från olika områden (t. ex. tre bilder, två rutor per bild) och Bestäm den genomsnittliga hornhinnan endotelial celltäthet per kvadrat (100 μm2). Extrapolerar endotelcellernas densitet per 100 μm2 till 1 mm2 genom att multiplicera med 100.
- Öppna bilderna med de projicerade rutorna i ImageJ (version 1.50 i) och Använd CellCounter-insticksprogrammet för att räkna cellerna i kvadraten. Öppna ImageJ, Välj fil | Öppna (eller CTRL + O) | Välj bild.
- För bedömning av morfologiska förändringar, räkna Reformation siffror (gemensamt möte på ≥ 4 celler/cellkanter i stället för tre), rosett formationer (karakteristiska rosett-formad utseende, fem eller fler radiellt ordnade celler som omger en förstörd cell ), eller alizarin röda områden (förstörda celler) i de projicerade torgen.
Anmärkning: Alternativt kan det vara bra att använda större rutor (t. ex. 200 x 200 μm2) för Morfologisk analys i välbevarade prover för att få mer representativa resultat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den presenterade dissekera tekniken innebär partiell avlägsnande av stromacellstumörer vävnad, vilket resulterar i en tunnare hornhinnan prov och därmed mindre stromacellstumörer svullnad (figur 1 och figur 2). Mindre stromacellstumörer svullnad inducerar mindre skjuvning och nypa krafter som har en negativ inverkan på hornhinnan endotelet, vilket orsakar lägre endotelceller cellförlust frekvenser6. Split hornhinnan knappar visar en betydligt bättre bevarade endotelceller lager efter 15 dagar av odling jämfört med icke-Split hornhinnan knappar och hela corneoscleral prover, som återspeglar mindre endotelial cellförlust och ett lägre antal Reformation siffror (≥ 4 celler/cellkanter sammanfogade i stället för tre), rosett formationer (fem eller fler radiellt arrangerade celler möte på en enda plats), och alizarin röda (förstörda) celler efter 15 dagar6.
Under en period av 15 dagar, Split hornhinnan knappar visar en stadig nedgång i endotelceller densitet med en genomsnittlig vecka procentuellt endotelial cellförlust av 4,90% (n = 40, figur 3). Börjar på dag 1 med en endotelial celltäthet av 4 033 ± 146/163 celler/mm2 (median ± 25%/75% kvartil), celltäthet minskade till 3 850 ± 167/233 celler/mm2 på dag 8, och 3 650 ± 200/233 celler/mm2 på dag 15. Fastställda cell förluster var likartade för första och andra veckan. På dagar 1 − 8, 4,00 ± 2,17/1,93% (median ± 25%/75% kvartil); dagar 8 − 15, 4,88 ± 5.52/4.42%; dagar 1 − 15, 8,64 ± 4,32/2,71%). Sålunda, den givna nedgången frekvensen liknar den kurs som rapporteras i humant donator hornhinnor under odling i tidigare studier10,11,12.
Morfologiska parametrar bedömdes efter färgning av endotelcellskiktet på dag 15 (n = 28, figur 4). Reformationen siffror består 7,18 ± 2,36/2.90% (median ± 25%/75% kvartil) av de fusionerande cellgränserna. En median på 1,11 ± 1,11/15.56 rosett formationer/mm2 (median ± 25%/75% kvartil) var närvarande i de undersökta proverna, medan 13,33 ± 4.44/11.67 alizarin röda färgade celler/mm2 (median ± 25%/75% kvartil) markerade punktliga cell förluster.
Figur 5 ger representativa bilder av hornhinnan endotelet under mikroskopisk utvärdering i Hbss (figur 5A) och efter färgning med trypan blå och alizarin Röd S (figur 5B). Bedömningen av endotelcellernas densitet i hBSS kan utföras flera gånger (t. ex. på dag 1, 8 och 15), medan färgade prover kan användas för bedömning av morfologiska parametrar (reformerade figurer, rosett formationer, alizarin rödfärgade celler) eller bestämning av endotelcellernas densitet i slutet av experimenten på grund av de cytotoxiska egenskaperna hos de flesta infärgnings ämnena.
Om de delade hornhinnans knappar placeras och odlas med den endoteliala sidan vänd nedåt av en slump, kan omfattande endotelial cellskada förväntas (figur 6A). Icke-Split hornhinnan knappar drabbas signifikant ökad endotelcell förlust på grund av stromacellstumörer svullnad, orsakar Descemet membran vikning över 15 dagar av odling (figur 6B), medan Split hornhinnan knappar visar en i stort sett bevarad hornhinnan endotelet efter 15 dagar av odling, indikeras av utspridda punktliga alizarin röda färgade områden som indikerar enstaka förstörda celler (figur 6C).
Figur 2: Schematisk illustration av icke-delade horn hinnknappar och delade hornhinnor. Efter avlägsnande av 300 μm av svin hornhinnan, inklusive epitel och större delar av stromacellstumörer vävnad, tjockleken på Split hornhinnan knappar reduceras till förmån för bättre bevarande av hornhinnan endotelet på grund av minskad stromacellstumörer svullnad i hela odling på upp till 15 dagar. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Endotelcelldensitet (ECD) av delade hornhinnor över 15 dagar. Split hornhinnan knappar (n = 40) visade en stadig nedgång. ECD på dag 1, 4 033 ± 146/163 celler/mm2 (median ± 25%/75% kvartil); dag 8, 3 850 ± 167/233 celler/mm2; dag 15, 3 650 ± 200/233 celler/mm2. Data avbildas som median ± 25%/75% kvartil, morrhår representerar antingen minimum och maximum eller 1,5 av interkvartilintervall Range (IQR). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: morfologiska parametrar för ytterligare utvärdering av cellskador och omarrangeringsprocesser. Mikroskopiska fotografier av hornhinnan endotelet i 400x förstoring efter 15 dagar av odling och färgning med trypan blå och alizarin röda S visar (a) reformationen siffror (pilar, gemensamt möte med fyra eller fler celler/cellkanter i stället för tre), (B) rosett formationer (prickig cirkel, Central minskande cell med karakteristiska rosetter formationer av fem eller flera angränsande celler) och (C) alizarin röda färgade celler (streckade cirklar, förstörda celler). Data (n = 28) avbildas som median ± 25%/75% KVARTIL. Whiskers representerar antingen minimum och maximum eller 1,5 av interkvartilintervall Range (IQR). Cirklar representerar extremvärden inte inom IQR. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: ofärgade och färgade hornhinnan endotelet. Endotelcellskiktet sett vid mikroskopisk utvärdering (400x förstoring) i (a) hypotonisk balanserad saltlösning (Hbss) som orsakar endotelcellssvullnad och därmed bättre cell synlighet och (B) efter färgning med trypan Blue och alizarin Red S. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: översikt fotografier av hornhinnan endotelet i (a) en delad hornhinnan knappen odlas upp och ner, (B) en icke-delad hornhinnan knapp, och (C) en delad hornhinnan knapp efter färgning. Fotografier visar hornhinnan endotel efter färgning med trypan blå och alizarin Röd S. a) omfattande skador på hornhinnan i endotelceller (röttområde) observerasefter att de delade korneal knapparna odlas med den endoteliala sidan vänd nedåt efter en vecka av odling. (B) signifikant ökad endotelial cellskador i icke-Split hornhinnan knappar på grund av Descemets membran fällbara och stromacellstumörer svullnad efter 15 dagar av odling (röda ränder). (C) split hornhinnan knappar visar ett välbevarat endotelceller skikt efter 15 dagar av odling endast visar punktliga förstörda celler ses i alizarin rödfärgade områden. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll ger en metod för beredning av porcin Split hornhinnan knappar, som representerar en standardiserad och låg kostnad ex vivo hornhinnan endoteliala organ kultur modell för forskningsändamål6. Porcin Split hornhinnan knappar visade en minskning av endotelceller densitet jämförbar med endoteliala cell förluster observerats i mänskliga donator hornhinnor odlas i ögat banker under en tvåveckorsperiod6,10,11, 12.
Överlägsenheten över icke-Split hornhinnan knappar samt hela svin corneoscleral prover visades tidigare6. I denna studie jämfördes tre grupper på dag 1, 8 och 15. Den hornhinneendotelet i alla grupper (corneoscleral knappar, icke-Split hornhinnan knappar, Split hornhinnan knappar) var i gott skick på dag 1, representeras av en väl bevarad endotelceller lager6. Men på grund av stromacellstumörer svullnad, fällning av Descemet membran förstörde stora delar av endotel av hela corneoscleral prover, så att en representativ bedömning av hornhinnan endotelceller densitet på dag 8 och 15 kunde inte utföras. Även om endotelet av de icke-Split hornhinnan knappar var väl bevarade fram till dag 15, några Descemet s membran veck var också närvarande. Även jämfört med corneoscleral prover endoteliala cellskikt av icke-Split hornhinnan knappar var i bättre skick, den endotelceller cellskikt av den delade hornhinnan knappar var i mycket bättre skick. Detta kan ses i kvantitativa och kvalitativa parametrar, eftersom endotelial cellförlust inom 15 dagar av odling var signifikant högre (p = 0,041) i icke-Split hornhinnan knappar (-575 ± 25/250 celler/mm2) jämfört med Split hornhinnan knappar (-417 ± 138/179 celler/mm2), som är kongruenta till de fastställda morfologiska egenskaper som är uppenbara i en mer regelbunden Hexagon cell mönster, färre Reformation siffror och rosett formationer, samt färre förstörda celler (alizarin röda områden) i Split hornhinnan knappar6. Procentuellt endotelial cell förluster bekräfta dessa fynd, som procentuellt cellförlust inom 15 dagar i icke-Split och Split hornhinnan knappar är 14,89% och 10,2% (p = 0,032) respektive6. Eftersom denna metod validerades för en period på upp till 15 dagar, det tillåter längre observationsperioder än publicerade studier hittills (72 till 120 h)3,4,5.
Förbättringarna i bevarandet av endotelcellskiktet, tillämpa gemensamma odla protokoll som också används i ögat banker, kan endast hänföras till den reducerade svullnad av hornhinnan stroma, eftersom en större del (300 μm) av stroma avlägsnas före odling6,13. Normalt stroma tenderar att svälla enormt under odling på grund av dess hydrofila egenskaper och molekyler inbäddade i stromacellstumörer vävnad14,15. Svullnad, som inducerar skjuvning och nypa krafter och Descemets membran vikning, vilket också orsakar mekanisk påfrestning på hornhinnan endotel och endotelial cellförlust, reduceras efter partiell avlägsnande av stroma6,10. I motsats till öga banker, som ofta använder osmotiska agenter såsom dextran till deswell mänsklig givare hornhinnor före transplantation, Split hornhinnan knappar inte kräver osmotisk Avsvällning16,17. Som odlingssubstrat kompletterat med dextran är känt för att absorberas av hornhinnan endotelceller och inducera ökad cellförlust7,8,9,18,19 ,20, odling av Split hornhinnan knappar utan dextran (eller andra osmotiska medel) eliminerar så många negativa toxiska faktorer som möjligt6. Eftersom odlingsmediet inte kompletteras med några tillsatser i den presenterade metoden, förväntas inga toxiska influenser som orsakas av något tillsatt ämne, vilket gör denna modell värdefull för undersökningar av biokompatibilitetstester av nya substanser.
Även om hornhinnan endotelet är ett mycket känsligt cellskikt och beredningen av delad hornhinnan knappar kräver måttlig kirurgisk kompetens och skonsam hantering, denna teknik kan vara en standardiserad metod att arbeta med och för att få pålitliga resultat om effekter av olika faktorer på hornhinnan endotelet inom en mycket rimlig tidsram. Ändå finns det några steg i detta protokoll där hornhinnan endotelet är i riskzonen. Uppenbarligen skadade eller ogenomskinliga ögon måste noggrant identifieras och kasseras i början för att förhindra eventuella fördomar. Dessutom måste hornhinnan endotel alltid lämnas orörd under trephination, dissektion, extraktion, och hantering (t. ex., överföring från öga till odlingsplattan, från odlingsplattan till odlingsplattan, etc.) av delade hornhinnan knappar för att förhindra att någon mekaniska skador. Vid placering av suturen ytligt i stroma kan endotelet potentiellt trängas in om nålen oavsiktligt sätts in för långt på djupet. I så fall kommer märkbar vätska från den främre ögonkammaren att passera genom suturen kanalen och motsvarande öga måste kasseras. För att förhindra detta bör nålen hållas ytligt inom stroma. Dessutom måste försiktighet iakttas för att strikt dela hornhinnan knappen horisontellt med skalpell. Ojämn skärning kommer att resultera i ojämn svullnad under odling, möjligen orsakar ökad endotelial cellförlust.
Undersökningen av obefläckade hornhinnan endotelceller i hBSS utförs vanligen i mänskliga donator hornhinnor. Det finns inga tecken på betydande cellskador orsakade av osmotisk svullnad av endotelcellerna för den valda provningstiden för Split hornhinnan knappar i hBSS3. Även färgning ökar synligheten av cellkanter, ofärgade räkna inte resulterar i signifikant olika resultat av endotelceller densitet jämfört med färgade räkna21. Den uppenbara fördelen med obefläckade räkna är att det tillåter flera uppföljning undersökningar under hela experiment, medan färgning ämnen är vanligtvis cytotoxiska och avsluta observationsperioden. Färgade räkna är dock fortfarande viktigt att bedöma de morfologiska egenskaperna hos endotelet. Trypan Blue belyser kärnor av skadade celler som ofta verkar oskadade i obefläckade räkna. Alizarin Red S förbättrar tydligt synbarheten av cellkanterna och skadade celler genom färgning av Descemets membran, vilket underlättar bedömningen av endotelcellernas densitet och möjliggör analys av morfologiska egenskaper hos hornhinnans endotelet , såsom reformerade figurer, rosett formationer och alizarin röda färgade celler (figur 4).
En stor begränsning av Split hornhinnan knappar som en ex vivo modell är att, precis som in vitro-modeller, de är endast lämpliga för att undersöka yttre påverkan på hornhinnan endotelceller. Därför, in vivo modeller är oersättliga för forskning om systemiska sjukdomar och tillstånd med en inverkan på ögat och hornhinnan endotelet. Oavsett, denna förberedelse teknik kan generera giltiga data för att testa effekterna av olika yttre faktorer på hornhinnan endotelet (t. ex. i biokompatibilitetstester av nya substanser)22. Enligt 3R-principen (ersättning, reduktion, förfining) för att minska antalet levande djur experiment, ger denna metod en adekvat forskningsmodell för att ytterligare överbrygga klyftan mellan in vitro cellkulturer, där resultaten ofta är inkongruösa till i vivo situation hos människor, och djurförsök, som kräver stora ansträngningar och väcker alltmer etiska frågor23.
På grund av deras egenskaper och tillgänglighet, gris ögon verkar vara den enda lämpliga substitut för mänskliga ögon för forskningsändamål. Hornhinnor från icke-mänskliga primater är inte ett bra alternativ på grund av etiska skäl och tillgänglighet, även om dessa djur är de närmaste arterna till människor. Å andra sidan, ögonen på mindre djur är helt enkelt för små för att möjliggöra effektiv hornhinna avlägsnande. Gris ögon är jämförbara med mänskliga ögon i storlek och visar liknande egenskaper hos hornhinnan endotelceller, vilket också återspeglas i den forskning som behandlar eventuella framtida xenotransplantation av genetiskt modifierade svin hornhinnor24, 25,26. Att vara en biprodukt av slakterier, de är också lätt att få.
Sammanfattningsvis, den presenterade metoden med svin hornhinnor erbjuder en mycket reproducerbar Organo-typiskt odlade forskningsmodell möjliggör kostnadseffektiv forskning på hornhinnan endotelceller. Framtida utredare kan använda Split hornhinnan knappar för att analysera effekterna av olika faktorer såsom nya ämnen, kirurgiska tekniker, utrustning, och andra möjliga yttre påverkan där hornhinnan endotelet är av stort intresse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Inrättandet av den presenterade forsknings modellen stöddes av KMU-innovativ (FKZ: 13GW0037F) av förbundsministeriet för utbildning och forskning Tyskland.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Subject | |||
| Pig eyes | local abbatoir | ||
| Substances | |||
| Alizarin red S | Sigma-Aldrich, USA | ||
| Culture Medium 1, #F9016 | Biochrom GmbH, Germany | ||
| Dulbecco's PBS (1x) | Gibco, USA | ||
| Fetal calf serum | Biochrom GmbH, Germany | ||
| Hydrochloric acid (HCl) solution | own production | ||
| Hypotonic balanced salt solution | own production | per 1 L of H2O: NaCl 4.9 g; KCl 0.75 g; CaCl x H2O 0.49 g; MgCl2 x H2O 0.3 g; Sodium Acetate x 3 H2O 3.9 g; Sodium Citrate x 2 H2O 1.7 g | |
| Povidon iodine 7.5%, Braunol | B. Braun Melsungen AG, Germany | ||
| Sodium chloride (NaCl) 0.9% | B. Braun Melsungen AG, Germany | ||
| Sodium hydroxide (NaOH) solution | own production | ||
| Trypan blue 0.4% | Sigma-Aldrich, USA | ||
| Materials & Instruments | |||
| Accu-jet pro | Brand GmbH, Germany | ||
| Beaker Glass 50 mL | Schott AG, Germany | ||
| Blunt cannula incl. Filter (5 µm) 18G | Becton Dickinson, USA | ||
| Cell culture plate (12 well) | Corning Inc., USA | ||
| Colibri forceps | Geuder AG, Germany | ||
| Corneal scissors | Geuder AG, Germany | ||
| Eppendorf pipette | Eppendorf AG, Germany | ||
| Eye Bulb Holder | L. Klein, Germany | ||
| Eye scissors | Geuder AG, Germany | ||
| Folded Filter ø 185 mm | Whatman, USA | ||
| Hockey knife | Geuder AG, Germany | ||
| Laboratory Glass Bottle with cap 100 mL | Schott AG, Germany | ||
| Magnetic stir bar | Carl Roth GmbH & Co. KG, Germany | ||
| MillexGV Filter (5 µm) | Merck Millopore Ltd., USA | ||
| Needler holder | Geuder AG, Germany | ||
| Petri dishes | VWR International, USA | ||
| Pipette tips | Sarstedt AG & Co., Germany | ||
| Scalpel (single use), triangular blade | Aesculap AG & Co. KG, Germany | ||
| Serological pipette 10 mL | Sarstedt AG & Co., Germany | ||
| Serological pipette 5 mL | Sarstedt AG & Co., Germany | ||
| Sterile cups | Greiner Bio-One, Österreich | ||
| Sterile gloves | Paul Hartmann AG, Germany | ||
| Sterile surgical drape | Paul Hartmann AG, Germany | ||
| Stitch scissors | Geuder AG, Germany | ||
| Suture Ethilon 10-0 Polyamid 6 | Ethicon Inc., USA | ||
| Syringe (5 mL) | Becton Dickinson, USA | ||
| trephine ø 7.5 mm | own production | ||
| Tying forceps | Geuder AG, Germany | ||
| Weighing paper | neoLab Migge GmbH, Germany | ||
| Equipment & Software | |||
| Binocular surgical microscope | Carl Zeiss AG, Germany | ||
| Camera mounted on microscope | Olympus, Japan | ||
| CellSens Entry (software) | Olympus, Japan | ||
| Cold-light source | Schott AG, Germany | ||
| Incubator | Heraeus GmbH, Germany | ||
| Inverted phase contrast microscope | Olympus GmbH, Germany | ||
| Magnetic stirrer with heating function | IKA-Werke GmbH & Co. KG, Germany | ||
| pH-meter pHenomenal | VWR International, USA | ||
| Photoshop CS2 | Adobe Systems, USA | ||
| Precision scale | Ohaus Europe GmbH, Switzerland |
References
- Gain, P., et al. Global Survey of Corneal Transplantation and Eye Banking. JAMA Ophthalmology. 134 (2), 167-173 (2016).
- Roy, O., et al. Understanding the process of corneal endothelial morphological change in vitro. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (2), 1228-1237 (2015).
- Meltendorf, C., Ohrloff, C., Rieck, P., Schroeter, J. Endothelial cell density in porcine corneas after exposure to hypotonic solutions. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 245 (1), 143-147 (2007).
- Schroeter, J., Meltendorf, C., Ohrloff, C., Rieck, P. Influence of temporary hypothermia on corneal endothelial cell density during organ culture preservation. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 246 (3), 369-372 (2008).
- Schroeter, J., Ruggeri, A., Thieme, H. Impact of temporary hyperthermia on corneal endothelial cell survival during organ culture preservation. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 253 (5), 753-758 (2015).
- Kunzmann, B. C., et al. Establishment Of A Porcine Corneal Endothelial Organ Culture Model For Research Purposes. Cell and Tissue Banking. 19 (3), 269-276 (2018).
- Redbrake, C., et al. A histochemical study of the distribution of dextran 500 in human corneas during organ culture. Current Eye Research. 16 (5), 405-411 (1997).
- Zhao, M., et al. Poloxamines for Deswelling of Organ-Cultured Corneas. Ophthalmic Research. 48 (2), 124-133 (2012).
- Filev, F., et al. Semi-quantitative assessments of dextran toxicity on corneal endothelium: conceptual design of a predictive algorithm. Cell and Tissue Banking. 18 (1), 91-98 (2017).
- Pels, E., Schuchard, Y. Organ-culture preservation of human corneas. Documenta Ophthalmologica. 56 (1-2), 147-153 (1983).
- Borderie, V. M., Kantelip, B. M., Delbosc, B. Y., Oppermann, M. T., Laroche, L. Morphology, Histology and Ultrastructure of Human C31 Organ-Cultured Corneas. Cornea. 14 (3), 300-310 (1995).
- Linke, S. J., et al. Thirty years of cornea cultivation: long-term experience in a single eye bank. Acta Opthalmologica. 91 (6), 571-578 (2013).
- Schroeter, J., et al. Arbeitsrichtlinien - Gute Fachliche Praxis für Hornhautbanken [Procedural guidelines. Good tissue practice for cornea banks]. Ophthalmologe. 106 (3), 265-276 (2009).
- Dohlman, C. H., Hedbys, B. O., Mishima, S. The swelling pressure of the corneal stroma. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 1, 158-162 (1962).
- Xuan, M., et al. Proteins of the corneal stroma: importance in visual function. Cell and Tissue Research. 364 (1), 9-16 (2016).
- Sperling, S. Human Corneal Endothelium in Organ Culture - The Influence of Temperature and Medium of Incubation. Acta Opthalmologica. 57 (2), 269-276 (1979).
- Schroeter, J. Endothelial Evaluation in the Cornea Bank. Developments in Ophthalmology. 43, 47-62 (2009).
- Pels, E., Schuchard, Y. The Effects of High Molecular Weight dextran on the Presevation of Human Corneas. Cornea. 3 (3), 219-227 (1985).
- van der Want, H. J. L., Pels, E., Schuchard, Y., Olesen, B., Sperling, S. Electron Microscopy of Cultured Human Corneas Osmotic Hydration and the Use of dextran Fraction (dextran T 500) in Organ Culture. Archives of Ophthalmology. 101 (12), 1920-1926 (1983).
- Thuret, G., Manissolle, C., Campos-Guyotat, L., Guyotat, D., Gain, P. Animal compound-free medium and poloxamer for human corneal organ culture and Deswelling. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 46 (3), 816-822 (2005).
- Wenzel, D. A., Kunzmann, B. C., Spitzer, M. S., Schultheiss, M. Staining of endothelial cells does not change the result of cell density. Cell and Tissue Banking. 20 (2), 327-328 (2019).
- Wenzel, D. A., Kunzmann, B. C., Hellwinkel, O., Druchkiv, V., Spitzer, M. S., Schultheiss, M. Effects of perfluorobutylpentane (F4H5) on corneal endothelial cells. Current Eye Research. , (2019).
- Olsson, I. A. S., Franco, N. H., Weary, D. M., Sandøe, P. The 3Rs principle - mind the ethical gap! ALTEX Proceedings, 1/12, Proceedings of WC8. , 333-336 (2012).
- Sanchez, I., Martin, R., Ussa, F., Fernandez-Bueno, I. The parameters of the porcine eyeball. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 249 (4), 475-482 (2011).
- Kim, M. K., Hara, H. Current status of corneal xenotransplantation. International Journal of Surgery. 23 (Pt B), 255-260 (2015).
- Fujita, M., et al. Comparison of Proliferative Capacity of Genetically-Engineered Pig and Human. Ophthalmic Research. 49 (3), 127-138 (2013).
