Summary
Burada domuz eti bölünmüş kornea düğmelerinin hazırlanması ve yetiştirilmesi için adım adım bir protokol sunulmuştur. Bu organo-tipik ekili organ kültürü modeli 15 gün içinde hücre ölüm oranlarını gösterir gibi, insan donör kornea karşılaştırılabilir, toksik dekstran eklemeden insan dışı kornea uzun vadeli ekimi sağlayan ilk modeli temsil eder.
Abstract
Kornea endotel hücreleri üzerinde deneysel araştırma çeşitli zorluklarla ilişkilidir. İnsan donör kornealar nadirdir ve normalde transplantasyon için gerekli olduğu için deneysel araştırmalar için nadiren kullanılabilir. Endotel hücre kültürleri genellikle in vivo durumlara iyi tercüme etmez. İnsan olmayan korneaların biyoyapısal özellikleri nedeniyle, ekim sırasında stromal şişlik önemli kornea endotel hücre kaybına neden olur, bu da uzun bir süre için ekimi yapmak zor hale getirir. Bu yanıtı etkisiz hale getirmek için dextran gibi şişme ajanları kullanılır. Ancak, onlar da önemli endotel hücre kaybına neden olur. Bu nedenle şişme ajanlar gerektirmeyen bir ex vivo organ kültür modeli oluşturulmuştur. Yerel bir mezbahadan domuz gözleri bölünmüş kornea düğmeleri hazırlamak için kullanılmıştır. Kısmi kornea trehinasyonundan sonra korneanın dış katmanları (epitel, bowman tabakası, stromanın bazı kısımları) çıkarıldı. Bu önemli ölçüde büyük stromal şişme ve Descemet membran uzun ekim dönemleri boyunca katlama tarafından indüklenen kornea endotel hücre kaybını azaltır ve endotel hücre tabakasının genel korunmasını artırır. Sonraki tam kornea trehinasyonu kalan göz soğanı ve ekimi bölünmüş kornea düğmesinin kaldırılması izledi. Endotel hücre yoğunluğu, ışık mikroskobu kullanılarak hazırlıktan 15 gün sonraya kadar (örn. 1, 8, 15 gün) takip sürelerinde değerlendirildi. Kullanılan hazırlama tekniği daha az stromal doku şişmesi ile etkin endotel hücre tabakasının daha iyi korunmasını sağlar, hangi insan donör kornea karşılaştırılabilir bölünmüş kornea düğmelerinde yavaş ve doğrusal düşüş oranları ile sonuçlanır. İlk kez bu standart organo-tipik ekili araştırma modeli en az iki hafta istikrarlı bir ekimi sağlar gibi, onların açısından çeşitli dış faktörlerin gelecekteki araştırmalar için insan donör kornealar için değerli bir alternatiftir kornea endotel üzerindeki etkileri.
Introduction
Kornea transplantasyon işlemleri dünya çapında en sık yapılan transplantasyonlar arasında dır1. İnsan donör kornea ciddi bir sıkıntısı olduğu gibi, insan kornea kornea kornea endotel hücrelerini ele deneysel araştırma1gerçekleştirmek zordur. Ancak, göz içinde kullanılan sulama solüsyonları ve diğer maddelerin, oftalmik viskoelastik cihazların yanı sıra cerrahi alet ve tekniklerin (örn. fakoemülsifikasyon aletleri ve teknikleri, ultrason enerjisi) tanıtılması, klinik kullanım dan önce kornea endotel üzerindeki etkileri ile ilgili geçerli ve kapsamlı araştırmalar.
Araştırma için insan donör kornealarına birkaç alternatif vardır. Hayvan araştırma modelleri çok değerli ama aynı zamanda çok kaynak tüketen ve giderek etik sorgulanan. In vitro hücre kültürlerinin önemli bir dezavantajı insan gözüne sınırlı çeviri olduğunu. Hücre kültürlerinden elde edilen sonuçlar in vivo koşullara uyumsuz olabilir, çünkü hücreler endotel mezenkimal geçiş (EMT) geçirebilir, bu da hücre polaritesinin kaybı ve hücre şekli ve gen değişikliklerinden kaynaklanan fibroblast benzeri morfolojiile sonuçlanabilir. ifade2.
Önceki ex vivo modelleri sadece 120 saate kadar ekim süreleri rapor ederken, en az 15 gün taze domuz korneaları kültüre getirerek bir domuz kornea endotel organ kültür modeli oluşturmak için yeni bir hazırlık tekniği son zamanlardatanıtıldı 3 3 ,4,5,6. Kornea epiteli ve stromanın parçaları ekimden önce korneadan çıkarılırsa (toplam 300 m) stromanın şişmesi bölünmüş kornea düğmelerinde azalır ve bu da daha az endotel hücre kaybına ve bakımlı endotel kaybına neden olur. hücre tabakası 15 güne kadar, bölünmemiş kornea düğmeleri ise düzensiz stromal şişlik ve Descemet kıvrımlarının oluşumuna bağlı olarak önemli endotel hücre kaybı gösterir. Göz bankaları genellikle transplantasyon öncesi kornea ların şişmesini azaltmak için dekstran gibi ozmotik deswelling ajanları kullanır. Ancak, bu ajanlar artmış endotel hücre kaybınedengösterilmiştir 7,8,9.
Bu makalede, gelecekteki araştırmacıların bölünmüş kornea düğmeleri kullanarak kornea endotel üzerinde araştırma yapmalarını sağlamak amacıyla bu standartlaştırılmış ex vivo araştırma modelini ayrıntılı bir adım adım protokolde görselleştirmeyi amaçlamaktadır. Bu model, göz içi viskoelastik cihazlar, sulama solüsyonları ve ultrason enerjisi veya kornea endotellerinin ilgi çekici olduğu diğer işlemler gibi göz içinde kullanılan maddeleri ve teknikleri test etmek için basit bir yöntemi temsil eder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu protokol kurumumuzun etik kurallarına uygundur. Kurumumuzun etik inceleme komitesi tüzüğüne uygun olarak, tüm domuz korneaları yerel mezbahadan alındığı için deneylerden önce etik onay alınmak zorunda değildir.
1. Organ kültürü
- Domuz gözlerini hazırlayın.
- Yerel mezbahadan, kısa bir süre sonra ölümden sonra kaldırıldı domuz gözleri elde ama termal tedavi den önce. Gözleri laboratuara götürün ve birkaç saat içinde işleyin. Taşıma sırasında, işlemeden önce gözleri oda sıcaklığında (yaklaşık 21 °C) tutun.
- Göz makasve kolibri forseps kullanarak dezenfeksiyon öncesinde tüm orbital adnexes (göz kasları, konjonktiva, yağ dokusu) kaldırın. Belirgin travma, dış hasar (örn. bıçak kesme) veya görünür kornea oparesi ile tüm gözleri ayırın ve atın.
- Steril bir kapta %5 iyot-PBS çözeltisi (1:20) bir fosfat tamponlu salin (PBS) çözeltisine 57 mL'lik povison iyot %7,5 povison iyot ekleyerek hazırlayın. Ayrıca 60 mL saf PBS içeren ayrı bir steril bardak hazırlayın.
NOT: Kullanılan iyot-PBS çözeltisinin toplam miktarı ve kabın büyüklüğü kesilecek kornea sayısına bağlıdır. Beş ila altı göz, düzgün dezenfekte edilmesi için %5-iyot-PBS çözeltisinin yaklaşık 60 mL'sini gerektirir. - 5-iyot-PBS çözeltisi içine 5-altı göz koyun toplam 5 dakika düzgün göz yüzeyini dezenfekte etmek için. Göz yüzeyinin tamamen batmış ve iyot çözeltisinde tamamen dezenfekte edildiğinden emin olmak için her dakikayı dikkatlice karıştırın.
- 5 dakika sonra dezenfekte edilmiş gözleri saf PBS ile dolu hazır bardağa aktarın. Yine, iyot-PBS çözeltisinin göz yüzeyinden yıkandığından emin olmak için dikkatlice karıştırın.
NOT: Dezenfekte edilmiş gözlerin kirlenmesini önlemek için bu adımı temiz bir bankta gerçekleştirin.
- Hücre kültür plakaları hazırlayın.
NOT: Sabit laminar hava akışı ile temiz bir bankta aşağıdaki adımları gerçekleştirin.- Fetal baldır serumunun 2 mL'si (FCS) çözülür. Bir şırınga (5 mL) fcs ile künt bir kanül kullanarak doldurun. Şırıngayı, FCS'nin 80 mL dekstran içermeyen kültür ortamı I'e (earle tuzları, penisilin/streptomisin, L-glutamin [200 mM] ile olası bakteriyel kontaminasyonunu önlemek için şırınga filtresinden (0,22 μm) boşaltın, amphotericin B [250 μg/mL], Hepes tampon [1 M] [50x], NaHCO3, ve distile su). Hatta substrat dağılımını sağlamak için karışımı çalkalayın.
- 12 kuyulu hücre kültür plakasının her kuyuyu 3 mL substrat karışımı ile doldurun.
- Diseksiyon ve kuluçka yapın.
NOT: Bu adımı temiz bir bankta gerçekleştirin. Kornea endoteline herhangi bir aletle dokunmayın.- PBS ile bardaktan kornea yukarı bakan göz ampulü tutucu içine bir göz ampulü aktarın ve bir oftalmik cerrahi mikroskop altına yerleştirin. Biraz diseksiyon için pozisyonda göz sabitleme göz ampul tutucu üzerinde göze bazı emme uygulamak için% 0.9 NaCl ile dolu bir şırınga kullanın.
- Merkezi korneanın yüzeysel olarak kesilmesi için, trephined derinliğinin 300 μm'yi geçmemesini sağlayan standart bir kayı içeren bir trephin (ø 7,5 mm) kullanın (Şekil 1A).
- Kolibri forceps ve üçgen bıçak ile tek kullanımlık neşter kullanın kesmek ve stroma ile yatay korneakısmen trephined kısmını kaldırmak için. Kornea epiteloluşan ayrılmış kornea parçası atın, bowman tabakası, ve stroma bir parçası.
NOT: Kalan stromanın eşit kalınlığını elde etmek için yatay kesme yönünü sıkı bir şekilde koruyun. - Deneyler sırasında endotel'i stromal taraftan ayırt edebilmek için 10-0 sütür (10-0 poliamid 6) stromaya yüzeysel olarak yerleştirin(Şekil 1B). Kornea endotel penetrasyonunu önleyin. Endotel nüfuz edilirse göz ampulü atın.
NOT: Ön göz odasından gelen sıvı dikiş kanalından sızacağı için kornea endotellerinin dikiş iğnesi ile penetrasyonu görülebilir. - Ön göz odasına ulaşılına kadar trephined kesim tam derinliğe ilerlemek için kayı olmadan trephine kullanın (Şekil 1C). Anterior göz odasından sızan direnç ve sıvıda belirgin bir düşüş korneanın tam penetrasyonundan sonra algılanabilir.
NOT: Bölünmüş kornea düğmesi trephination sonra bölünmüş kornea düğmesinin bir tarafında bağlı kalırsa bir hokey bıçağı kullanın. - Elde edilen bölünmüş kornea düğmesini, şimdi stroma bir parçası oluşan(Şekil 2),Descemet membran ve kornea endotel, kültür ortamı (kültür orta I + FCS, bölüm 1.2 bakınız) içine 12 kuyu hücre kültür plakası içine aşağı bakan etiketli tarafı, böylece kornea endotel yukarı bakıyor.
NOT: Endotel tarafı aşağı bakacaksa, endotel zarar görebilir. - Takipler sırasında kimlik tespiti için her bölünmüş kornea düğmesine ayrı bir numara atayın ve hücre kültür plakasındaki kuyuları buna göre etiketleyin.
- Dolu hücre kültür plakalarını standart koşullar altında 37 °C, %5 CO2 ve bağıl hava nemi %95 sıcaklıkta kuluçkaya yatırın. 7 günlük kuluçka süresi aşılırsa, 8.
NOT: Bölünmüş kornea düğmeleri kullanılarak kuluçka işlemi 15 güne kadar doğrulanmıştır.
Şekil 1: Bölünmüş kornea düğmeleri elde etmek için domuz korneasının diseksiyonu. (A) Korneanın trefinin 300 μm derinliğe kesilmesi ve epitelin ve stromal doku parçalarının çıkarılması için bir kalıtım ile trefilasyondan sonra, (B) korneanın penetrasyonu olmadan stromaya yüzeysel olarak bir dikiş konur. stromal tarafın daha sonra tanımlanması için endotel. (C) Kalan korneanın tam trehinasyonu takip edilir (D) göz ampulünden elde edilen bölünmüş kornea düğmesinin çıkarılması. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
2. Endoskopi ve endotel muayenesi
- Lekesiz muayene yapın.
NOT: Lekesiz muayene birden çok kez yapılabilir (örn. 1, 8 ve 15. gün haftalık takiplerde). Ancak, lekesiz sayma sadece endotel hücre yoğunluğunun değerlendirilmesine izin verir, morfolojik parametreleri değil.- 12 kuyuluk hücre kültür plakasının her kuyuda 3 mL hipotonik dengeli tuz çözeltisi doldurun (hBSS, Malzeme Tablosu'ndakikompozisyona bakın). Kornea endotel hücrelerinin şişmesine neden olmak ve hücre sayımı için hücrelerin görünürlüğünü artırmak için hBSS'ye tek bir bölünmüş kornea düğmesini dikkatlice yerleştirin.
NOT: Endotel tarafının mikroskop yönünde olduğundan emin olun. Ters faz kontrastmikroskopu kullanılırsa, endotel tarafının aşağıya dönük olması gerekir. Yerinde iken, kültür plakası endotel hücre hasarı önlemek için hareket ettirilmemelidir. - Mikroskoba bağlı kamera ile endotel bir resim çekmeden önce hücreleri 1-2 dakika şiştirin. Kornea endotel gerçek durumu temsili bir izlenim elde etmek için en az üç farklı alanlarda en az üç fotoğraf çekin. Kornea endotel hücre yoğunluğu ve morfolojik parametrelerin daha sonra analizi için 100 μm doğru ölçekli uzunluğu ile bir ölçek çubuğu ekleyin.
- Ozmotik hasarı önlemek için, hBSS'den bölünmüş kornea düğmesini en fazla 5 dk sonra çıkarın ve kültürortamınageri aktarın 3 .
- 12 kuyuluk hücre kültür plakasının her kuyuda 3 mL hipotonik dengeli tuz çözeltisi doldurun (hBSS, Malzeme Tablosu'ndakikompozisyona bakın). Kornea endotel hücrelerinin şişmesine neden olmak ve hücre sayımı için hücrelerin görünürlüğünü artırmak için hBSS'ye tek bir bölünmüş kornea düğmesini dikkatlice yerleştirin.
- Lekeli muayene yapın.
NOT: Kullanılan boyama maddeleri sitotoksik olduğundan, boyama deneyleri sonlandırır. Bu nedenle, morfolojik parametrelerin (reformasyon figürleri, rozet oluşumları, alizarin kırmızı lekeli hücreler) değerlendirilmesi için sadece gözlem döneminin sonunda boyama yapılabilir.- Boyama işlemi için %0,25 trypan mavi solüsyonu ve %0,2 alizarin kırmızı S çözeltisi hazırlayın.
- %0,25 trypan mavi çözeltisi için %0,4 trypan mavi çözeltisini %0,9 NaCl çözeltisi ile seyreltin.
NOT: Örneğin, %0,25'lik trypan mavi çözeltisinin 20 mL'sini elde etmek için % 0,4 trippan mavi çözeltisinin 12,5 mL'sini seyreltin ve %0,9 NaCl çözeltisinin 7,5 mL'sini elde edin. Trypan mavi çözeltisi birkaç hafta veya ay oda sıcaklığında saklanabilir. - %0.2 alizarin kırmızı S çözeltisi elde etmek için 100 mg alizarin kırmızı S tozunu 50 mL'lik bir NaCl çözeltisinin %0,9 NaCl çözeltisi altında sürekli karıştırma ve ısıtma 50 °C'ye Kadar ısıtma işlevi ile bir mıknatıs karıştırma plakası üzerinde çözünür. Olası çökeltileri gidermek için elde edilen çözeltiyi filtreleyin. Buna göre sodyum hidroksit veya hidroklorik asit ekleyerek alizarin kırmızı S çözeltisinin pH'ını pH 4.2'ye ayarlayın.
NOT: Alizarin red S çözeltisinin her uygulamasından önce pH'ın 4.2'ye kadar düzeltildiklerinden ve çözeltide çökelti olmadığından emin olun. Çözelti oda sıcaklığında saklanabilir. Çözümü 4 haftadan uzun süre saklamayın.
- %0,25 trypan mavi çözeltisi için %0,4 trypan mavi çözeltisini %0,9 NaCl çözeltisi ile seyreltin.
- Endotel hücrelerini boyamak için endotel tarafı yukarı bakacak şekilde Petri kaplarında bölünmüş kornea düğmelerini yerleştirin. 90 s için kornea endotel üzerine damla% 0.25 trypan mavi çözelti damla yavaş yavaş damla için bir pipet kullanın.
NOT: Trypan mavisi, çekirdeklerini lekelediği için hasarlı kornea hücrelerinin geçirilebilir bir zarla tanımlanmasını sağlar. - Küçük bir cam kabın içinde %0,9 NaCl'de bölünmüş kornea düğmesini 3x dikkatlice durulayın. Yine, yavaş yavaş 90 s için kornea endotel üzerine damla% 0.2 alizarin kırmızı S çözeltisi damla damla için bir pipet kullanın.
NOT: Alizarin kırmızı S descemet membran lekeleri, hasarsız kornea endotel hücrelerinde hücre sınırlarını vurgulamak ve altta yatan Descemet membran görünür hale geldiğinde yok hücreleri vurgulamak için yardımcı olur. Ayrıca, daha büyük tahrip alanların kolayca tanımlanmasını sağlar. - Lekeli kornea endotel incelemesi için bölüm 2.1 lekesiz sayma için açıklanan adımları izleyin.
- Boyama işlemi için %0,25 trypan mavi solüsyonu ve %0,2 alizarin kırmızı S çözeltisi hazırlayın.
3. Kornea endotel hücre yoğunluğu ve morfolojik parametrelerin analizi
- Grafik düzenleme yazılımı(Tablo Of Materials)kullanarak resimlere kare sayma projesi .
- Dosya yı seçerek yazılımı açın ve kornea endotel görüntüsünü açın | Aç | Seçin.
- Görüntüüzerinde 100 μm'lik gerçek bir ölçek kenarı uzunluğuna sahip bir kare yansıtın.
NOT: Görüntüleme yazılımı resim üzerine sayma kareleri yansıtılmasına izin veriyorsa, bölüm 3.1.2'nin aşağıdaki adımları yoksayılabilir. Karenin yan uzunluğu mikroskop kamerası ile çekilen görüntülerin çözünürlüğüne bağlıdır ve ölçek çubuğu ile hesaplanabilir.- Mikroskopla çekilen fotoğraftan ölçek çubuğunu kırpma: Araç çubuğundaki Dikdörtgen Çerçeve Aracı'nı seçin veya Mtuşuna basın, ardından ölçek çubuğunu sınırlayın, sonra Düzenleme'yi seçin | Kırpma veya Ctrl + Xtuşuna basın.
- Dosyayı Tıklatın | Yeni (veya Ctrl + Ntuşuna basın). Gelecek pencerede Belge Türü açılır listesinde Pano'yu seçin. Gösterilen piksel sayısı, sayım karesinin yan uzunluğudur. Diğer resimler için karşılık gelen pikselleri not edin ve Tamam'ıtıklatın.
- Dosya Yı Seçin | Yeni (veya Ctrl + N). Ölçek çubuğunun uzunluğuna göre, gelecek penceredeki sayma karesinin genişliğini ve uzunluğunu (piksel olarak) ekleyin. Arka plan rengi Beyaz'ıseçin, ardından Tamam tuşunabasın.
- Seç'e tıklayın | Tümünü seçin (veya Ctrl + A). Seç Edit | Kopyala (veya Ctrl + C).
- Adım 3.1.1'de açılan kornea endotel görüntüsünü seçin. Seç Edit | Kornea endotel fotoğrafına kare eklemek için yapıştırın (veya Ctrl + V).
- Kare katmanını seçin ve saydamlığı ayarlayın. Katman Seçin | Katman Stili | Harmanlama Seçenekleri | Opaklığı %30'a ayarlayın | Tamam.
- Görüntüyü, doğru ve ölçeklenmiş yan uzunluğu 100 μm olan yansıtılan kareyle kaydedin.
- Endotel hücre yoğunluğunu ve morfolojik parametreleri değerlendirin.
- Görüntüleri ImageJ'de (Sürüm 1.50i) yansıtılan karelerle açın ve kare içindeki hücreleri saymak için CellCounter PlugIn'i kullanın. ImageJ'i aç, Dosya'yı seç | Aç (veya Ctrl + O) | Resim'i seçin.
NOT: ImageJ ve CellCounter PlugIn online indirmek için ücretsiz. - Eklentileri Seçin | Cell_Counter | Hücre Sayacı | Initialize . Endotel hücrelerini sayın ve sonucu kaydedin. Karenin iki tarafında, kare kenarı tarafından kesilen hücreleri sayın. Diğer iki tarafta kesilmiş hücreleri saymayın.
- Farklı alanlardan kornea başına en az altı kareyi analiz edin (örn. üç resim, resim başına iki kare) ve kare başına ortalama kornea endotel hücre yoğunluğunu belirleyin (100 μm2). 100 μm2 ila 1 mm2 başına endotel hücre yoğunluğunu 100 ile çarparak tahmin edin.
- Görüntüleri ImageJ'de (Sürüm 1.50i) yansıtılan karelerle açın ve kare içindeki hücreleri saymak için CellCounter PlugIn'i kullanın. ImageJ'i aç, Dosya'yı seç | Aç (veya Ctrl + O) | Resim'i seçin.
- Morfolojik değişikliklerin değerlendirilmesi için, sayım reformasyon rakamları (üç yerine ≥4 hücre/hücre sınırlarının ortak buluşması), rozet oluşumları (karakteristik rozet şeklinde görünüm, yok edilmiş bir hücreyi çevreleyen beş veya daha fazla radyal olarak düzenlenmiş hücre ), veya yansıtılan karelerde alizarin kırmızı alanları (yok edilen hücreler).
NOT: Alternatif olarak, daha fazla temsili sonuç elde etmek için iyi korunmuş numunelerde morfolojik analiz için daha büyük kareler (örneğin, 200 x 200 μm2)kullanmak yararlı olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Sunulan diseksiyon tekniği stromal dokunun kısmi olarak çıkarılması, daha ince kornea örneği ve dolayısıyla daha az stromal şişlik ile sonuçlanan anlamına gelir(Şekil 1 ve Şekil 2). Daha az stromal şişlik kornea endotel üzerinde olumsuz bir etkiye sahip daha az makas ve çimdik kuvvetleri neden olur, böylece daha düşük endotel hücre kaybı oranları neden6. Bölünmüş kornea düğmeleri, 15 günlük ekimden sonra, daha az endotel hücre kaybı nı ve daha az sayıda reformasyonu yansıtan bölünmüş olmayan kornea düğmeleri ve tüm korneoskleral örneklere göre önemli ölçüde daha iyi korunmuş bir endotel hücre tabakası nı göstermektedir. rakamlar (≥ 4 hücre/hücre sınırları üç yerine yapışık), rozet oluşumları (beş veya daha fazla radyal olarak düzenlenmiş hücreler tek bir noktada bir araya gelerek) ve alizarin kırmızısı (yok edilmiş) hücreler 15 gün sonra6.
15 günlük bir süre içinde, bölünmüş kornea düğmeleri ortalama haftalık yüzdelik hücre kaybı % 4.90 ile endotel hücre yoğunluğunda sürekli bir düşüş göstermektedir (n = 40, Şekil 3). Birinci güne 4.033 ± 146/163 hücre/mm2 (ortanca ± %25/75 dörtte) endotel hücre yoğunluğu ile başlayan hücre yoğunluğu, 8. günde 3.850 ± 167/233 hücre/mm2'ye, 15.gün 3.650 ± 200/233 hücre/mm2'ye düştü. Belirlenen hücre kayıpları birinci ve ikinci hafta benzerdi. 1−8, 4.00 ± %2.17/1.93 (ortanca ± %25/75% dörtte) gün 8−15, 4,88 ± 5,52/4,42%; gün 1−15, 8.64 ± 4.32/2.71%). Böylece, verilen düşüş oranı önceki çalışmalarda ekimi sırasında insan donör kornea bildirilen oranına benzer10,11,12.
Morfolojik parametreler endotel hücre tabakasının 15. Reformasyon rakamları birleşen hücre sınırlarının %7.18 ± 2.36/2.90%'ini (ortanca ± %25/%75 dörtte) oluştur. İncelenen örneklerde ortanca 1.11 ± 1.11±15.56 rozet oluşumu/mm2 (ortanca ± %25/75 dörtte) bulunurken, 13.33 ± 4.44/11.67 alizarin kırmızı lekeli hücreler/mm2 (median ± %25/75 dörtte) puntoal hücre kayıpları belirgin olarak bulundu.
Şekil 5, hBSS mikroskobik değerlendirme sırasında kornea endotellerinin temsili görüntülerini sağlar (Şekil 5A) ve trippan mavisi ve alizarin kırmızısı S (Şekil 5B)ile boyandıktan sonra. HBSS'de endotel hücre yoğunluğunun değerlendirilmesi birden çok kez yapılabilir (örn. 1, 8 ve 15. hücreleri) veya en boyama maddelerin sitotoksik özellikleri nedeniyle deneylerin sonunda endotel hücre yoğunluğunun belirlenmesi.
Bölünmüş kornea düğmeleri yerleştirilir ve endotel tarafı kazara aşağı bakacak şekilde ekili ise, geniş endotel hücre hasarı beklenebilir(Şekil 6A). Bölünmeyen kornea düğmeleri stromal şişlik nedeniyle önemli ölçüde artmış endotel hücre kaybına uğrar, descemet zarının 15 günlük ekimde katlanmasına neden olur(Şekil 6B), bölünmüş kornea düğmeleri ise büyük ölçüde korunmuş kornea endotel ekimi 15 gün sonra, tek tahrip hücreleri gösteren dağınık dakik alizarin kırmızı lekeli alanlarda gösterilir (Şekil 6C).
Şekil 2: Bölünmeyen kornea düğmelerinin ve bölünmüş kornea düğmelerinin şematik çizimi. Epitel ve stromal dokunun ana parçaları da dahil olmak üzere domuz korneasının 300 μm'lik kısmı çıkarıldıktan sonra, kornea endotellerinin daha iyi korunması lehine bölünmüş kornea düğmelerinin kalınlığı azalır. 15 güne kadar ekimi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: 15 gün boyunca bölünmüş kornea düğmelerinin endotel hücre yoğunluğu (ECD). Split kornea düğmeleri (n = 40) sabit bir düşüş gösterdi. 1. günde ECD, 4,033 ± 146/163 hücre/mm2 (ortanca ± %25/75 oranında dörtte bir) ; gün 8, 3,850 ± 167/233 hücre/mm2; gün 15, 3.650 ± 200/233 hücreleri/mm2. Veriler ortanca ± %25/75 dörtte biri olarak gösterilmiştir, bıyıklar interquartile aralığının (IQR) minimum ve maksimum veya 1,5'ini temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Hücre hasarı nın ek değerlendirilmesi ve yeniden düzenleme süreçlerinin morfolojik parametreleri. 15 gün sonra 400x büyütmede kornea endotellerinin mikroskobik fotoğrafları trypan mavisi ve alizarin kırmızısı S ile 15 gün sonra(A)reformasyon rakamları (oklar, dört veya daha fazla hücre/hücre sınırlarının ortak buluşması yerine üç),(B)rozet oluşumları (noktalı daire, beş veya daha fazla bitişik hücreden oluşan karakteristik rozet oluşumları ile merkezi azalan hücre) ve (C) alizarin kırmızı lekeli hücreler (kesik daireler, yok edilmiş hücreler). Veriler (n = 28) median ± % 25/75 dörtte biri olarak gösterilmiştir. Bıyıklar en az ve maksimum veya interquartile aralığının (IQR) 1,5'ini temsil eder. Daireler IQR içinde olmayan aykırı temsil. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Lekesiz ve lekeli kornea endotel. Mikroskobik değerlendirme sırasında görülen endotel hücre tabakası (400x büyütme) in (A) hipotonik dengeli tuz çözeltisi (hBSS) endotel hücre şişmesine neden olur ve böylece daha iyi hücre görünürlüğü ve (B) trypan mavisi ile boyandıktan sonra ve alizarin kırmızı S. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: (A) bölünmüş kornea düğmesi baş aşağı ekili kornea endotel genel fotoğraflar, (B) bölünmemiş kornea düğmesi, ve (C) boyama sonra bölünmüş kornea düğmesi. Fotoğraflar, trippan mavisi ve alizarin kırmızısı S. (A) Geniş kornea endotel hücre hasarı (kırmızı alan) ile boyandıktan sonra kornea endotellerinin bir den sonra aşağı bakacak şekilde kornea kenarı ekili olduğunu göstermektedir. ekim haftası. (B) Descemet'in zar katlama ve stromal şişmesi nedeniyle bölünmeyen kornea düğmelerinde endotel hücre hasarı 15 gün sonra önemli ölçüde artmıştır (kırmızı çizgiler). (C) Bölünmüş kornea düğmeleri, 15 günlük ekimden sonra iyi korunmuş bir endotel hücre tabakasını gösterir ve sadece alizarin kırmızısı lekeli alanlarda görülen dakik leşmiş hücreleri gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokol araştırma amaçlı standart ve düşük maliyetli ex vivo kornea endotel organ kültür modeli temsil domuz bölünmüş kornea düğmeleri, hazırlanması için bir yöntem sağlar6. Domuz bölünmüş kornea düğmeleri iki haftalık bir süre içinde göz bankalarında ekili insan donör korneagöz görülen endotel hücre kayıpları ile karşılaştırılabilir endotel hücre yoğunluğunda bir azalma gösterdi6,10,11, 12. Yıl.
Bölünmemiş kornea düğmelerine ve tüm domuz korneoskleral örneklerine göre üstünlük daha önce6olarak gösterilmiştir. Bu çalışmada 1, 8 ve 15. Tüm grupların kornea endotel (korneoskleral düğmeler, bölünmemiş kornea düğmeleri, bölünmüş kornea düğmeleri) iyi durumda olduğunu gün 1, iyi korunmuş endotel hücretabakası6 ile temsil edildi . Ancak stromal şişlik nedeniyle Descemet zarının katlanması korneoskleral numunelerin endotellerinin geniş alanlarını tahrip etti, böylece 8 ve 15. Bölünmeyen kornea düğmelerinin endotelleri 15 güne kadar iyi korunmuş olsa da, bazı Descemet membran kıvrımları da mevcuttu. Korneoskleral örneklerle karşılaştırıldığında bölünmeyen kornea düğmelerinin endotel hücre tabakası daha iyi durumda olmasına rağmen, bölünmüş kornea düğmelerinin endotel hücre tabakası çok daha iyi durumdaydı. Bu durum kantitatif ve nitel parametrelerde görülebilir, çünkü ekimden sonraki 15 gün içinde endotel hücre kaybı split kornea düğmelerinde (-575 ± 25/250 hücre/mm2)bölünmüş kornea düğmelerine göre anlamlı olarak daha yüksekti (-417 ± ± 138/179 hücre/mm2), daha düzenli bir altıgen hücre deseninde belirgin olan belirlenen morfolojik özelliklere, daha az reformasyon figürü ve rozet formasyonuna ve daha az tahrip edilmiş hücreye (alizarin kırmızı alanları) uyumludur. kornea düğmeleri6. Yüzdelik endotel hücre kayıpları bu bulguları doğrular, bölünmeyen ve bölünmüş kornea düğmelerinde 15 gün içinde yüzdelik hücre kaybı sırasıyla %14,89 ve %10,2 (p = 0,032) sırasıyla6' dır. Bu yöntem 15 güne kadar bir süre için doğrulandığı için, şimdiye kadar yayınlanan çalışmalardan daha uzun gözlem süreleri sağlar (72-120 h)3,4,5.
Göz bankalarında da kullanılan ortak yetiştirme protokollerinin uygulanması yla endotel hücre tabakasının korunmasında yapılan iyileştirmeler, stromanın büyük bir kısmı (300 μm) öncesinde çıkarıldığından, sadece kornea stromasının azaltılmış şişmesine bağlanabilir. ekimi6,13. Normalde stroma, hidrofilik özellikleri ve stromal doku içine gömülü moleküller nedeniyle ekimi sırasında muazzam şişme eğilimindedir14,15. Kesme ve sıkıştırma kuvvetleri ve Descemet membran katlama neden şişme, aynı zamanda kornea endotel ve endotel hücre kaybı mekanik zorlanma neden olur, stroma kısmi çıkarılmasından sonra azalır6,10. Göz bankalarının aksine, genellikle nakli öncesi insan donör korneaları deswell dextran gibi ozmotik ajanlar kullanmak, bölünmüş kornea düğmeleri ozmotik deswelling gerektirmez16,17. Dekstran ile takviye kültür ortamı kornea endotel hücreleri tarafından emilir ve artan hücre kaybı7,8,9,18,19 neden olduğu bilinmektedir ,20, dextran olmadan bölünmüş kornea düğmeleri ekimi (veya diğer ozmotik ajanlar) mümkün olduğunca çok sayıda olumsuz toksik faktörleri ortadan kaldırır6. Kültür ortamı sunulan yöntemde herhangi bir katkı maddesi ile takviye olmadığından, herhangi bir ilave maddenin neden olduğu toksik etkiler beklenmez, bu da bu modeli yeni maddelerin biyouyumluluk testlerinin araştırılması için değerli kalmaktadır.
Kornea endotel çok hassas bir hücre tabakası olmasına ve bölünmüş kornea düğmelerinin hazırlanması orta cerrahi beceriler ve nazik kullanım gerektirir rağmen, bu teknik ile çalışmak ve ilgili güvenilir sonuçlar elde etmek için standart bir yöntem olabilir çok makul bir zaman dilimi içinde kornea endotel üzerinde çeşitli faktörlerin etkileri. Yine de, kornea endotel risk altında olduğu bu protokolde birkaç adım vardır. Açıkçası hasarlı veya opak gözler dikkatle tespit edilmesi ve olası önyargıları önlemek için başlangıçta atılır gerekir. Ayrıca, kornea endotel her zaman trephination sırasında el değmemiş bırakılmalıdır, diseksiyon, ekstraksiyon, ve işleme (örneğin, kültür plaka, kültür plaka, vb) herhangi bir önlemek için bölünmüş kornea düğmeleri göz den kültür plakasına aktarılması mekanik hasar. Sütür stromaya yüzeysel olarak yerleştirildiğinde, iğne kazara çok derinliğe yerleştirilirse endotel potansiyel olarak delinebilir. Eğer öyleyse, ön göz odasından fark sıvı dikiş kanalı ile geçiyor olacak ve ilgili göz atılması gerekir. Bunu önlemek için, iğne stroma içinde yüzeysel tutulmalıdır. Ayrıca, neşter kullanarak kornea düğmesini yatay olarak kesin olarak bölmeye özen duyulmalıdır. Düzensiz kesim ekimi sırasında düzensiz şişmeye neden olacak, muhtemelen artan endotel hücre kaybına neden.
HBSS'de lekesiz kornea endotel hücrelerinin muayenesi yaygın olarak insan donör kornealarında yapılır. HBSS3'tebölünmüş kornea düğmelerinin seçilen muayene süresi için endotel hücrelerinin ozmotik şişmesinin neden olduğu önemli hücre hasarına dair bir kanıt bulunmamaktadır. Boyama hücre sınırlarının görünürlüğünü artırır rağmen, lekesiz sayma lekeli sayma lekeli sayma21ile karşılaştırıldığında endotel hücre yoğunluğu önemli ölçüde farklı sonuçlar alamamış. Lekesiz sayma açık yararı deneyler boyunca birden fazla takip muayeneleri sağlar, boyama maddeleri genellikle sitotoksik ve gözlem süresini sona erdirmek ise. Lekeli sayma, ancak, endotel morfolojik özelliklerini değerlendirmek için önemli olmaya devam etmektedir. Trypan mavigenellikle lekesiz sayma zarar görmemiş gibi görünüyor hasarlı hücrelerin çekirdekleri vurgulamaktadır. Alizarin kırmızı S açıkça endotel hücre yoğunluğunun değerlendirilmesi kolaylaştırır ve kornea endotel morfolojik özelliklerinin analizini sağlar Descemet membran boyama tarafından hücre sınırları ve hasarlı hücrelerin görünürlüğünü artırır , reformasyon figürleri, rozet oluşumları ve alizarin kırmızı lekeli hücreler gibi (Şekil 4).
Bir ex vivo modeli olarak bölünmüş kornea düğmeleri önemli bir sınırlama, sadece in vitro modellerde olduğu gibi, sadece kornea endotel hücreleri üzerindeki dış etkileri araştırmak için uygundur. Bu nedenle in vivo modelleri göz ve kornea endotel üzerinde etkisi olan sistemik hastalıklar ve durumlar üzerinde araştırma için yeri doldurulamaz. Ne olursa olsun, bu hazırlık tekniği kornea endotel (örneğin, yeni maddelerin biyouyumluluk testi) üzerinde çeşitli dış faktörlerin etkilerini test etmek için geçerli veri üretebilir22. Canlı hayvan deneylerinin sayısını azaltmak için 3R prensibini (değiştirme, azaltma, arıtma) takiben, bu yöntem, in vitro hücre kültürleri arasındaki boşluğu daha da kapatmak için yeterli bir araştırma modeli sağlar, burada sonuçlar genellikle in insanlarda vivo durum ve hayvan araştırmaları, önemli çabalar gerektirir ve giderek etik kaygıları23yükseltir.
Özellikleri ve durumu nedeniyle, domuz gözleri araştırma amaçlı insan gözleri için tek yeterli yedek gibi görünüyor. Bu hayvanlar insanlara en yakın türler olmasına rağmen, insan olmayan primatlardan kornealar etik nedenler ve kullanılabilirlik nedeniyle iyi bir alternatif değildir. Öte yandan, küçük hayvanların gözleri sadece verimli kornea kaldırma izin vermek için çok küçük. Domuz gözleri boyutu insan gözleri ile karşılaştırılabilir ve kornea endotel hücrelerinin benzer özellikleri göstermek, aynı zamanda genetik olarak değiştirilmiş domuz korneaolası olası gelecekteki ksenotransplantasyon ile ilgili araştırma yansıtılır24, 25,26. Ayrıca, mezbahaların bir yan ürünü olarak, elde etmek kolaydır.
Sonuç olarak, domuz korneaları kullanılarak sunulan yöntem kornea endotel hücreleri üzerinde maliyet-etkin araştırma sağlayan son derece tekrarlanabilir organo-tipik ekili araştırma modeli sunuyor. Gelecekteki araştırmacılar, kornea endotel büyük ilgi olduğu yeni maddeler, cerrahi teknikler, ekipman ve diğer olası dış etkiler gibi çeşitli faktörlerin etkilerini analiz etmek için bölünmüş kornea düğmeleri kullanabilirsiniz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Sunulan araştırma modelinin kurulması, Almanya Eğitim ve Araştırma Bakanlığı'nın KMU-innovativ (FKZ: 13GW0037F) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Subject | |||
| Pig eyes | local abbatoir | ||
| Substances | |||
| Alizarin red S | Sigma-Aldrich, USA | ||
| Culture Medium 1, #F9016 | Biochrom GmbH, Germany | ||
| Dulbecco's PBS (1x) | Gibco, USA | ||
| Fetal calf serum | Biochrom GmbH, Germany | ||
| Hydrochloric acid (HCl) solution | own production | ||
| Hypotonic balanced salt solution | own production | per 1 L of H2O: NaCl 4.9 g; KCl 0.75 g; CaCl x H2O 0.49 g; MgCl2 x H2O 0.3 g; Sodium Acetate x 3 H2O 3.9 g; Sodium Citrate x 2 H2O 1.7 g | |
| Povidon iodine 7.5%, Braunol | B. Braun Melsungen AG, Germany | ||
| Sodium chloride (NaCl) 0.9% | B. Braun Melsungen AG, Germany | ||
| Sodium hydroxide (NaOH) solution | own production | ||
| Trypan blue 0.4% | Sigma-Aldrich, USA | ||
| Materials & Instruments | |||
| Accu-jet pro | Brand GmbH, Germany | ||
| Beaker Glass 50 mL | Schott AG, Germany | ||
| Blunt cannula incl. Filter (5 µm) 18G | Becton Dickinson, USA | ||
| Cell culture plate (12 well) | Corning Inc., USA | ||
| Colibri forceps | Geuder AG, Germany | ||
| Corneal scissors | Geuder AG, Germany | ||
| Eppendorf pipette | Eppendorf AG, Germany | ||
| Eye Bulb Holder | L. Klein, Germany | ||
| Eye scissors | Geuder AG, Germany | ||
| Folded Filter ø 185 mm | Whatman, USA | ||
| Hockey knife | Geuder AG, Germany | ||
| Laboratory Glass Bottle with cap 100 mL | Schott AG, Germany | ||
| Magnetic stir bar | Carl Roth GmbH & Co. KG, Germany | ||
| MillexGV Filter (5 µm) | Merck Millopore Ltd., USA | ||
| Needler holder | Geuder AG, Germany | ||
| Petri dishes | VWR International, USA | ||
| Pipette tips | Sarstedt AG & Co., Germany | ||
| Scalpel (single use), triangular blade | Aesculap AG & Co. KG, Germany | ||
| Serological pipette 10 mL | Sarstedt AG & Co., Germany | ||
| Serological pipette 5 mL | Sarstedt AG & Co., Germany | ||
| Sterile cups | Greiner Bio-One, Österreich | ||
| Sterile gloves | Paul Hartmann AG, Germany | ||
| Sterile surgical drape | Paul Hartmann AG, Germany | ||
| Stitch scissors | Geuder AG, Germany | ||
| Suture Ethilon 10-0 Polyamid 6 | Ethicon Inc., USA | ||
| Syringe (5 mL) | Becton Dickinson, USA | ||
| trephine ø 7.5 mm | own production | ||
| Tying forceps | Geuder AG, Germany | ||
| Weighing paper | neoLab Migge GmbH, Germany | ||
| Equipment & Software | |||
| Binocular surgical microscope | Carl Zeiss AG, Germany | ||
| Camera mounted on microscope | Olympus, Japan | ||
| CellSens Entry (software) | Olympus, Japan | ||
| Cold-light source | Schott AG, Germany | ||
| Incubator | Heraeus GmbH, Germany | ||
| Inverted phase contrast microscope | Olympus GmbH, Germany | ||
| Magnetic stirrer with heating function | IKA-Werke GmbH & Co. KG, Germany | ||
| pH-meter pHenomenal | VWR International, USA | ||
| Photoshop CS2 | Adobe Systems, USA | ||
| Precision scale | Ohaus Europe GmbH, Switzerland |
References
- Gain, P., et al. Global Survey of Corneal Transplantation and Eye Banking. JAMA Ophthalmology. 134 (2), 167-173 (2016).
- Roy, O., et al. Understanding the process of corneal endothelial morphological change in vitro. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (2), 1228-1237 (2015).
- Meltendorf, C., Ohrloff, C., Rieck, P., Schroeter, J. Endothelial cell density in porcine corneas after exposure to hypotonic solutions. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 245 (1), 143-147 (2007).
- Schroeter, J., Meltendorf, C., Ohrloff, C., Rieck, P. Influence of temporary hypothermia on corneal endothelial cell density during organ culture preservation. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 246 (3), 369-372 (2008).
- Schroeter, J., Ruggeri, A., Thieme, H. Impact of temporary hyperthermia on corneal endothelial cell survival during organ culture preservation. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 253 (5), 753-758 (2015).
- Kunzmann, B. C., et al. Establishment Of A Porcine Corneal Endothelial Organ Culture Model For Research Purposes. Cell and Tissue Banking. 19 (3), 269-276 (2018).
- Redbrake, C., et al. A histochemical study of the distribution of dextran 500 in human corneas during organ culture. Current Eye Research. 16 (5), 405-411 (1997).
- Zhao, M., et al. Poloxamines for Deswelling of Organ-Cultured Corneas. Ophthalmic Research. 48 (2), 124-133 (2012).
- Filev, F., et al. Semi-quantitative assessments of dextran toxicity on corneal endothelium: conceptual design of a predictive algorithm. Cell and Tissue Banking. 18 (1), 91-98 (2017).
- Pels, E., Schuchard, Y. Organ-culture preservation of human corneas. Documenta Ophthalmologica. 56 (1-2), 147-153 (1983).
- Borderie, V. M., Kantelip, B. M., Delbosc, B. Y., Oppermann, M. T., Laroche, L. Morphology, Histology and Ultrastructure of Human C31 Organ-Cultured Corneas. Cornea. 14 (3), 300-310 (1995).
- Linke, S. J., et al. Thirty years of cornea cultivation: long-term experience in a single eye bank. Acta Opthalmologica. 91 (6), 571-578 (2013).
- Schroeter, J., et al. Arbeitsrichtlinien - Gute Fachliche Praxis für Hornhautbanken [Procedural guidelines. Good tissue practice for cornea banks]. Ophthalmologe. 106 (3), 265-276 (2009).
- Dohlman, C. H., Hedbys, B. O., Mishima, S. The swelling pressure of the corneal stroma. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 1, 158-162 (1962).
- Xuan, M., et al. Proteins of the corneal stroma: importance in visual function. Cell and Tissue Research. 364 (1), 9-16 (2016).
- Sperling, S. Human Corneal Endothelium in Organ Culture - The Influence of Temperature and Medium of Incubation. Acta Opthalmologica. 57 (2), 269-276 (1979).
- Schroeter, J. Endothelial Evaluation in the Cornea Bank. Developments in Ophthalmology. 43, 47-62 (2009).
- Pels, E., Schuchard, Y. The Effects of High Molecular Weight dextran on the Presevation of Human Corneas. Cornea. 3 (3), 219-227 (1985).
- van der Want, H. J. L., Pels, E., Schuchard, Y., Olesen, B., Sperling, S. Electron Microscopy of Cultured Human Corneas Osmotic Hydration and the Use of dextran Fraction (dextran T 500) in Organ Culture. Archives of Ophthalmology. 101 (12), 1920-1926 (1983).
- Thuret, G., Manissolle, C., Campos-Guyotat, L., Guyotat, D., Gain, P. Animal compound-free medium and poloxamer for human corneal organ culture and Deswelling. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 46 (3), 816-822 (2005).
- Wenzel, D. A., Kunzmann, B. C., Spitzer, M. S., Schultheiss, M. Staining of endothelial cells does not change the result of cell density. Cell and Tissue Banking. 20 (2), 327-328 (2019).
- Wenzel, D. A., Kunzmann, B. C., Hellwinkel, O., Druchkiv, V., Spitzer, M. S., Schultheiss, M. Effects of perfluorobutylpentane (F4H5) on corneal endothelial cells. Current Eye Research. , (2019).
- Olsson, I. A. S., Franco, N. H., Weary, D. M., Sandøe, P. The 3Rs principle - mind the ethical gap! ALTEX Proceedings, 1/12, Proceedings of WC8. , 333-336 (2012).
- Sanchez, I., Martin, R., Ussa, F., Fernandez-Bueno, I. The parameters of the porcine eyeball. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 249 (4), 475-482 (2011).
- Kim, M. K., Hara, H. Current status of corneal xenotransplantation. International Journal of Surgery. 23 (Pt B), 255-260 (2015).
- Fujita, M., et al. Comparison of Proliferative Capacity of Genetically-Engineered Pig and Human. Ophthalmic Research. 49 (3), 127-138 (2013).
