Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

الرصد في الموقع للجمعيات النكّيّازة الجزيئية المشكلة بشكل عابر في البكتيريا والخميرة والخلايا البشرية

Published: September 2, 2019 doi: 10.3791/60172
Automatic Translation
*1, *2, 3
1Department of Biomedical Sciences of Cells & Systems, University of Groningen, 2Department of Anatomy, Faculty of Medicine, University of Colombo, 3Australian Regenerative Medicine Institute (ARMI), Monash University
* These authors contributed equally

Summary

تتعاون بروتينات Cognate J-domain مع مرافق Hsp70 للمساعدة في عدد لا يحصى من العمليات البيولوجية التي تتراوح بين طي البروتين إلى التدهور. هنا، ونحن نصف دراسة الربط القرب في الموقع، والذي يسمح برصد هذه الآلات مرافقة شكلت عابرة في الخلايا البكتيرية والخميرة والبشرية.

Abstract

البروتينات J-المجال (JDPs) تشكل أكبر وأكثر تنوعا الأسرة المشتركة في الخلايا eukaryotic. وتظهر النتائج الأخيرة أن أعضاء معينين من عائلة JDP يمكن أن تشكل المجمعات غير المتجانسة العابرة في eukaryotes لضبط اختيار الركيزة لضبط البروتين صدمة الحرارة 70 kDa (Hsp70) المثبطون القائم على البروتين المفككة. تستهدف مجمعات JDP البروتينات المجمعة الناجمة عن الإجهاد الحاد/المزمن، ويفترض أنها تساعد في تجميع التدرجات عن طريق توظيف عدة من Hsp70s على سطح مجاميع البروتين. مدى شبكة مراقبة جودة البروتين (PQC) التي شكلتها هذه JDPs التفاعل جسديا لا يزال إلى حد كبير غير مميزة في الجسم الحي. هنا، نقوم بوصف الفحص المجهري القائم على التفاعل البروتيني في الموقع المسمى الفحص ربط القرب (PLA)، والتي هي قادرة على التقاط بقوة هذه المجمعات مرافقة شكلت عابرة في مقصورات الخلوية متميزة من الخلايا eukaryotic. عملنا يوسع توظيف جيش التحرير الشعبى الصينى من الخلايا البشرية إلى الخميرة(Saccharomyces cerevisiae)والبكتيريا (الإشريكيةالقولونية) ، مما يجعل أداة هامة لرصد ديناميات جمعيات البروتين شكلت بشكل عابر في كل من الخلايا البروكاريوتيكية وeukaryotic.

Introduction

كمية هائلة من المعلومات الجينية لا تزال غير قابلة للتفسير بسبب فهمنا غير الكامل للinteractomes الخلوية. إن منهجيات الكشف عن التفاعل التقليدي بين البروتين والبروتين، مثل الهطول المناعي المشترك للبروتين مع/بدون الربط بين المواد الكيميائية وتوطين البروتين المشترك، على الرغم من استخدامه على نطاق واسع، تشكل مجموعة من العيوب. وتشمل بعض المساوئ الرئيسية ضعف التحديد الكمي للتفاعلات وإمكانية إدخال أحداث ملزمة غير أصلية. وبالمقارنة، توفر التقنيات الناشئة القائمة على القرب نهجاً بديلاً وقوياً لالتقاط تفاعلات البروتين في الخلايا. اختبار الربط القرب (جيش التحرير الشعبى الصينى)1، والمتاحة الآن كمجموعة الملكية ، ويستخدم الأجسام المضادة لاستهداف على وجه التحديد مجمعات البروتين على أساس القرب من الوحدات الفرعية المتفاعلة.

بدأ جيش التحرير الشعبى الصينى من خلال تشكيل سقالة تتكون من الأجسام المضادة الأولية والثانوية مع علامات الحمض النووي الصغيرة (تحقيقات جيش التحرير الشعبى الصينى) على سطح مجمع البروتين المستهدف (الشكل 1، الخطوات 1-3). بعد ذلك، التي يحددها القرب من علامات الحمض النووي، يتم إنشاء جزيء الحمض النوويالدائري عن طريق التهجين مع موصل oligonucleotides (الشكل 1، الخطوة 4). يتم الانتهاء من تشكيل الحمض النووي الدائري عن طريق خطوة ربط الحمض النووي. القطعة الدائرية التي تم تشكيلها حديثا من الحمض النووي بمثابة قالب لتضخيم دائرة المتداول اللاحقة (RCA) القائم على تفاعل سلسلة بوليميراز (PCR) تستعد من قبل واحدة من العلامات oligonucleotide المترافقة. وهذا يولد جزيء الحمض النووي المقعر الذي تقطعت به السبل واحد تعلقعلى مجمع البروتين عن طريق سقالة الأجسام المضادة (الشكل 1، الخطوة 6). يتم تصور جزيء الحمض النووي المتسلسل باستخدام oligonucleotides المسمى بشكل فلورسنت التي تهجينإلى تسلسل فريد ة متعددة متناثرة عبر الحمض النووي تضخيم (الشكل 1، الخطوة 7)2. تتوافق إشارة PLA التي تم إنشاؤها، والتي تظهر كنقطة فلورسنت (الشكل1، الخطوة 7)، مع موقع مجمع البروتين المستهدف في الخلية. ونتيجة لذلك، يمكن للتحليل الكشف عن مجمعات البروتين بدقة مكانية عالية. هذه التقنية لا تقتصر على مجرد التقاط تفاعلات البروتين، ولكن يمكن أيضا أن تستخدم للكشف عن جزيئات واحدة أو تعديلات البروتين على البروتينات ذات الحساسية العالية1،2.

Hsp70 يشكل نظام مرافق ة متعدد الاستخدامات للغاية مهم بشكل أساسي للحفاظ على التوازن البروتين الخلوي من خلال المشاركة في مجموعة من التدبير المنزلي والوظائف المرتبطة بالإجهاد. وتشمل أنشطة التدبير المنزلي لنظام مرافقة Hsp70 دي نوفو طي البروتين، ونقل البروتين عبر الأغشية الخلوية، وتجميع وتفكيك مجمعات البروتين، وتنظيم نشاط البروتين وربط مختلف البروتين للطي / آلات مراقبةالجودة 3. نفس نظام الchaperone أيضا refolds misfolded /unfolded البروتينات، ويمنع تجميع البروتين، ويعزز تصنيف البروتين ويتعاون مع البروتياز الخلوية لتحلل البروتينات التي لا نهاية لها مطوية / التالفة لتسهيل إصلاح الخلوية بعد بروتيوسالاجهاد4,5. ولتحقيق هذا التنوع الوظيفي، يعتمد مرافق Hsp70 على الشراكة المشتركة بين الشركاء في عائلة JDP وعوامل التبادل النيوكليوتيد (NEFs) التي تقوم بصقل التحكم في اللوستريك المعتمد على ATP 70 من ربط الركيزة والإصدار3، 6. وعلاوة على ذلك، فإن المشاركين في مرافقة JDP تلعب دورا حيويا في اختيار ركائز لهذا النظام مرافقة تنوعا. وينقسم أفراد هذه الأسرة إلى ثلاث فئات (A و B و C) على أساس الهولوجية الهيكلية الخاصة بهم إلى النموذج الأولي JDP، E. coli DnaJ. الفئة A JDPs تحتوي على N-محطة J-المجال، الذي يتفاعل مع Hsp70، وهي منطقة غنية بالجلايسين فينيلألانين، وهي منطقة ملزمة الركيزة تتكون من منطقة تشبه أصابع الزنك (ZFLR) واثنين من المجالات بيتا برميل، ومجال ديميريسي محطة C. JDPs مع N-محطة J-المجال ومنطقة غنية بالجلايسين فينيلألانين، ولكن تفتقر إلى ZFLR، تقع في الفئة B. وبصفة عامة، يشارك أفراد هاتين الفئتين في مهام مرافقة. الأعضاء الذين يندرجون تحت الفئة C، والتي تحتوي على JDPs التي تشترك فقط في J-المجال4، تجنيد Hsp70s لأداء مجموعة متنوعة من وظائف غير مرافقة. وينعكس الدور الهام للJDPs كـ "محولات" قابلة للتبديل في نظام Hsp70 من خلال توسع أفراد الأسرة أثناء التطور. على سبيل المثال، البشر لديهم أكثر من 42 أعضاء JDP متميزة4. هذه JDPs تعمل كمونومرات، homodimers و / أو homo/hetero oligomers4،5. في الآونة الأخيرة، تعاون وظيفي عن طريق تشكيل معقدة عابرة بين الفئة ألف (على سبيل المثال، H. sapiens DNAJA2؛ S. cerevisiae Ydj1) والفئة B (على سبيل المثال، H. sapiens DNAJB1; S. cerevisiae Sis1) تم الإبلاغ عن JDPs eukaryotic لتعزيز الاعتراف الفعال لمجاميع البروتين غير متبلور في المختبر7،8. هذه المجمعات JDP فئة مختلطة يفترض تجميع على سطح البروتينات المجمعة لتسهيل تشكيل Hsp70- و Hsp70 + Hsp100 القائم على البروتين disaggregases7،8،9، 10.تم توفير الأدلة الحاسمة لدعم وجود هذه المجمعات من فئة مختلطة شكلت عابرة JDP في الخلايا eukaryotic مع جيش التحرير الشعبى الصينى8.

ويستخدم جيش التحرير الشعبي بشكل متزايد لتقييم تفاعلات البروتين في ميتازوا، في المقام الأول في خلايا الثدييات. هنا، نبلغ عن التوسع الناجح لهذه التقنية لرصد المجمعات مرافقة شكلت عابرة في الكائنات أحادية الخلية eukaryotic وprokaryotic مثل الخميرة الناشئة S. سيريفيسياي والبكتيريا E. القولونية. والأهم من ذلك، يسلط هذا التوسع الضوء على الاستخدام المحتمل لجيش التحرير الشعبي في الكشف عن الميكروبات التي تصيب الخلايا البشرية والحيوانية وتحليلها.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إعداد خلية هيلا

  1. إعداد المواد التالية: PBS (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 m Na2HPO4,1.8 m KH2PO4),pH 7.4; DMEM، تستكمل مع 10٪ FCS و 1٪ القلم العقدية؛ 4% بارافورمالدهايد في PBS; 0.5% تريتون-X100 في PBS; TBS-T (150 mM NaCl, 20 mM Tris, 0.05% Tween), pH 7.4; 0.0001٪ معقمة بولي-L-يسين الحل؛ 10 جيدا الشرائح التشخيصية؛ غرفة رطبة ، و المناديل الورقية. وكوبلين الشريحة تلطيخ الجرار.
    ملاحظة: لضمان كفاءة التثبيت الأمثل، يجب إعداد حلول البارافورمالدهايد طازجة قبل كل تجربة.
  2. إعداد غرفة رطبة من خلال تغطية الجزء السفلي من مربع مغلق مع الأنسجة الرطبة. ضع الغرفة الرطبة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية قبل بدء التجربة، لضمان أن درجة حرارة الغرفة عند 37 درجة مئوية أثناء احتضان التفاعلات الأنزيمية.
  3. خلايا هيلا الثقافة في قوارير T25، في 5 مل من DMEM (ارتفاع الجلوكوز، الجلوتامات والصوديوم بيروفات تستكمل) تستكمل مع 10٪ FCS و 1٪ القلم العقدية، في حاضنة CO2 37 درجة مئوية تحتوي على 5٪ CO2. فصل الخلايا الملتصقة باستخدام 0.05٪ تريبسين-إدتا. بعد إضافة DMEM جديدة إلى الخلايا المنفصلة، عد الخلايا باستخدام غرفة عد الخلايا وتنمو على الشرائح التشخيصية داخل غرفة رطبة.
  4. تعقيم الشرائح التشخيصية عن طريق الأشعة فوق البنفسجية التشعيع في غطاء السيارة ثقافة الخلية المعقمة لمدة 30 دقيقة.
  5. إضافة 100 درجة مئوية من معقمة تصفية 0.0001٪ بولي-L-يسين إلى كل جيدا المطلوبة للتجربة. الحضانة لمدة 30 دقيقة.
  6. جرب خلايا HeLa وإضافة ما يقرب من 15،000 خلية إلى كل بئر. إذا لزم الأمر، تمييع الخلايا إلى ما لا يقل عن 30-50 درجة مئوية من DMEM لكل بئر.
  7. تنمو الخلايا في غرفة رطبة داخل حاضنة CO2 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة تقريبا.
    ملاحظة: عالية جدا ً من الإنقواب يقلل من امتصاص الكواشف ، مما يقلل من الإشارة التي تم الحصول عليها في نهاية البروتوكول.
  8. إزالة المتوسطة عن طريق وضع ورقة الأنسجة على حافة البئر. غسل الآبار 3X مع 50 درجة مئوية من PBS.
    ملاحظة: تخضع الخلايا للفصل عند إضافة السوائل بقسوة. ويمكن منع ذلك عن طريق عدم السماح للآبار الجافة تماما قبل إضافة سائل جديد وعن طريق إضافة السائل الجديد بلطف إلى حافة البئر.
  9. إصلاح الخلايا عن طريق إضافة 50 درجة مئوية من البارافورماليدات 4٪ أعدت حديثا في PBS إلى كل بئر. الحضانة لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  10. غسل الشرائح 3X في PBS. قم بإجراء عمليات غسل في جرة تلطيخ الشرائح التي تحتوي على 100 مل من PBS. لكل غسل، وحضانة لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة دون هز.
  11. Permeabilize غشاء الخلية عن طريق غمر الشرائح في 100 مل من 0.5٪ تريتون-X100 في PBS في جرة كوبلين الشريحة تلطيخ. الحضانة لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة دون هز.
  12. غسل الشرائح 3X في TBS-T. قم بإجراء عمليات غسل في جرة تلطيخ الشرائح التي تحتوي على 100 مل من TBS-T. لكل غسل، وحضانة لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة دون هز.
  13. بعد الغسيل الأخير، قم بإزالة المخزن المؤقت الزائد باستخدام ورق الأنسجة. عند هذه النقطة الخلايا جاهزة لبروتوكول "إجراء عملية ربط القرب" التي سيتم مناقشتها في القسم 4.

2. S. سيريفيسياي إعداد الخلية

  1. إعداد المواد التالية: 100 mM KPO4,pH 6.5, يشار إليها باسم غسل العازلة; 37% الفورمالديهايد; 4٪ بارافورمالدهايد في 100mM KPO 4، والحموضة 6.5؛ 1.2 M السوربيتول في 100M KPO 4، والحموضة 6.5؛ محلول الليسيكيس (500 ميكروغرام/مل ليتيك، 20 ملي متر بيتا-ميركابتوإيثانول، 100 مم ك بو4،درجة الحموضة 6.5)؛ 0.0001٪ بولي-L-يسين الحل؛ 1٪ تريتون-X100 في 100mM KPO 4، درجة الحموضة 6.5؛ 10 جيدا الشرائح التشخيصية؛ غرفة رطبة (أعدت كما هو الحال في الخطوة 1.2)؛ المناديل الورقية. وكوبلين الشريحة تلطيخ الجرار.
    ملاحظة: لضمان كفاءة التثبيت الأمثل، يجب إعداد حلول البارافورمالدهايد طازجة قبل كل تجربة.
  2. تنمو ثقافة بين عشية وضحاها في استخراج الخميرة غير انتقائية، Peptone وسكر العنب (YPD) المتوسطة في 30 درجة مئوية في حين تهتز.
    ملاحظة: اعتمادا على المتطلبات التجريبية S. cerevisiae الخلايا يمكن زراعتها في الاصطناعية كاملة (SC) المتوسطة أو انتقائية الاصطناعية الحد الأدنى (SM) المتوسطة بدلا من ذلك.
  3. تمييع الثقافة الثابتة إلىOD 600 من 0.1 في وسط 20 مل. تنمو الخلايا في 30 درجة مئوية في حين تهتز حتى OD600 تصل إلى 0.5.
  4. نقل ثقافة 20 مل إلى أنبوب الطرد المركزي 50 مل. بيليه الخلايا عن طريق الطرد المركزي في 665 × ز لمدة 3 دقائق. إعادة تعليق الخلايا في 5 مل من المتوسطة الطازجة.
  5. إصلاح الخلايا عن طريق إضافة 550 درجة مئوية من الفورمالديهايد 37٪ إلى الثقافة. الحضانة في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.
  6. بيليه الخلايا عن طريق الطرد المركزي في 665 × ز لمدة 3 دقائق. إعادة تعليق بيليه في 1 مل من إعداد هابافورمهايد 4٪ طازجة في الغسيل العازلة. الحضانة لمدة 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  7. أثناء الحضانة، وإعداد الشرائح التشخيص عن طريق إضافة 100 درجة مئوية من 0.01٪ بولي-L-يسين الحل لكل بئر. احتضان الشرائح لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  8. بعد 30 دقيقة، اغسلي اللايسين الزائد بماء فائق النقاء ودعي الشرائح تجف. الشرائح الجافة جاهزة للاستخدام.
  9. غسل الخلايا مرتين مع 1 مل من الغسيل العازلة. قم بإجراء عمليات غسل بواسطة الطرد المركزي للخلايا عند 665 × ز لمدة 3 دقائق.
  10. بيليه الخلايا عن طريق الطرد المركزي في 665 × ز لمدة 3 دقائق. إعادة تعليق الخلايا في 1 مل من 1.2 M السوربيتول في الغسيل العازلة.
  11. بيليه الخلايا عن طريق الطرد المركزي في 665 × ز لمدة 3 دقائق. إعادة تعليق بيليه في 250 درجة مئوية من محلول Lyticase أعدت حديثا لهضم جدار الخلية. احتضان الخلايا في محلول Lyticase لمدة 15 دقيقة في 30 درجة مئوية في حين يهز.
  12. بعد الهضم، يغسل الخلايا 3x بواسطة الطرد المركزي في 665 × ز لمدة 3 دقائق وإزالة supernatant. إعادة تعليق الخلايا في 250 درجة مئوية من السوربيتول 1.2 M في الغسيل العازلة.
    ملاحظة: لأن الخلايا هشة بعد هضم جدار الخلية، وإعادة تعليقها بعناية فائقة لعدم تلف الخلايا.
  13. إضافة 20 درجة مئوية من الخلايا المعاد تعليقها إلى الشرائح المغلفة بولي-L-يسين. السماح لهم بإرفاق إلى الشرائح لمدة 30 دقيقة.
  14. Permeabilize غشاء الخلية عن طريق غسل 3X مع 50 درجة مئوية من 1٪ تريتون-X في الغسيل العازلة.
    ملاحظة: عند هذه النقطة الخلايا جاهزة لبروتوكول تصنيف الربط القرب التي سيتم مناقشتها في القسم 4.

3. E. القولونية إعداد الخلية

  1. إعداد المواد التالية: PBS-T (140 mM NaCl, 2 m M KCl, 8 m K2HPO4,1.5 m KH2PO4,0.05% Tween-20), pH 7.4; محلول ليسوزيم (2 ملغ / مل ليسوزيم، 25 مل تريس-حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 8.0، 50 مل الجلوكوز، 10 MM EDTA)؛ 0.0001٪ بولي-L-يسين الحل؛ 99% الميثانول البارد على الجليد; 99٪ غرفة درجة الحرارة الميثانول؛ 99% أسيتون; 10 جيدا الشرائح التشخيصية؛ غرفة رطبة (أعدت كما هو الحال في الخطوة 1-1-1)؛ المناديل الورقية. وكوبلين الشريحة تلطيخ الجرار.
  2. تنمو ثقافة بين عشية وضحاها في لوريا-بيرتاني (LB) المتوسطة في 30 درجة مئوية في حين تهتز.
  3. تمييع الثقافة الثابتة إلىOD 600 من 0.02 في وسط LB الطازجة. تنمو الخلايا في 30 درجة مئوية في حين تهتز حتى OD600 يصل إلى 0.4 لخلايا مرحلة السجل.
  4. ما يقرب من 15 دقيقة قبل أن تصل الخلايا إلى OD600 من 0.4، وإعداد بولي-L-يسين المغلفة الشرائح عن طريق إضافة 100 درجة مئوية من 0.0001٪ بولي-L-يسين إلى كل بئر. احتضان الشرائح لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  5. بعد 30 دقيقة يغسل الزائدة بولي-L-يسين بالماء النقي جدا والسماح للشرائح الهواء الجاف. الشرائح الجافة جاهزة للاستخدام.
  6. عندما تصل الخلايا إلى OD600 من 0.4، نقل 1 مل من الثقافة إلى أنبوب أجهزة الطرد المركزي الدقيقة المعقمة وخلايا بيليه في 2650 × ز لمدة 2 دقيقة.
  7. إعادة تعليق الخلايا في 50 درجة مئوية من LB المتوسطة.
  8. إصلاح الخلايا عن طريق إضافة 1 مل من الجليد البارد 99٪ الميثانول. يُخلط المزيج برفق بالغين باليد. حضانة الخلايا لمدة 30 دقيقة عند -20 درجة مئوية.
  9. بعد التثبيت إضافة 20 درجة مئوية من الخلايا إلى الشرائح المغلفة بولي-L-يسين. دع الشرائح تجف لمدة 30 دقيقة.
  10. إضافة 50 درجة مئوية من محلول lysozyme أعدت حديثا لكل بئر لهضم جدار الخلية. حضانة في غرفة رطبة لمدة 30 دقيقة في 25 درجة مئوية.
  11. إزالة محلول lysozyme من الآبار عن طريق إضافة ورقة الأنسجة إلى حافة البئر. غسل الشرائح 3X في 100 مل من PBS-T. قم بإجراء كل غسل في جرة تلطيخ الشرائح كوبلين لمدة 30 ق، دون اهتزاز.
  12. قم بإزالة المخزن المؤقت للغسيل من الشرائح بالنقر فوق الشرائح على ورق الأنسجة.
  13. نفاذيبيليز أغشية الخلايا عن طريق إضافة 50 ميكرولتر من الميثانول 99٪ إلى كل بئر. الحضانة لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة.
  14. إزالة الميثانول عن طريق وضع ورقة الأنسجة على حافة البئر.
  15. إضافة 50 درجة مئوية من الأسيتون 99٪ إلى كل بئر. الحضانة لمدة دقيقة واحدة.
  16. إزالة الأسيتون الزائد عن طريق وضع ورقة الأنسجة على حافة البئر. السماح للشرائح بالهواء الجاف. عند هذه النقطة الخلايا جاهزة لبروتوكول تصنيف الربط القرب التي سيتم مناقشتها في القسم 4.

4. القرب الربط التبيّن

  1. إعداد المواد التالية: حظر المخزن المؤقت; الأجسام المضادة تخفيف العازلة; غسل العازلة 'A' – (10 MM تريس, 150 MM حمض الكل، 0.05٪ توين-20) درجة الحموضة 7.4؛ غسل العازلة 'B' – (200 MM تريس, 100 مل NaCl) الحموضة 7.4; المضادة للأرنب الأجسام المضادة الثانوية زائد; الأجسام المضادة الثانوية المضادة للماوس ناقص; 5X الربط العازلة؛ ligase ، وعندما كان هناك الكثير من ال 5X تضخيم العازلة (البرتقالي: 554 نانومتر السابقين؛م 576 نانومتر)؛ البلمرة. المياه فائقة النقاء. والتركيب المتوسط الذي يحتوي على DAPI.
    ملاحظة: الكواشف الكشف جيش التحرير الشعبي متاحة أيضا في المتغيرات الخضراء (495 نانومتر السابقين؛em 527 نانومتر)، الأحمر (594 نانومترالسابق؛ em 624 نانومتر)، FarRed (644 نانومترالسابق؛ م 669 نانومتر) أو برايتفيلد (peroxidase الفجل (HRP) مترافق).
  2. حظر الخلايا عن طريق إضافة قطرة من حظر المخزن المؤقت إلى كل بئر. حضانة لمدة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية في غرفة رطبة.
  3. إعداد حلول الأجسام المضادة عن طريق تخفيف الأجسام المضادة للمخزون في الجسم المضاد تخفيف العازلة. لكل بئر 40 درجة مئوية من محلول الأجسام المضادة مطلوب.
  4. إزالة حظر العازلة عن طريق وضع ورقة الأنسجة على حافة البئر. إضافة 40 درجة مئوية من الأجسام المضادة المخففة في الجسم المضاد تخفيف العازلة إلى كل بئر. حضانة لمدة 60 دقيقة في غرفة رطبة عند 37 درجة مئوية أو بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية.
  5. إزالة محلول الأجسام المضادة من الآبار عن طريق وضع ورقة الأنسجة على حافة البئر. غسل الشرائح 2X في 100 مل من غسل العازلة 'A' في كوبلين الشريحة تلطيخ جرة لمدة 5 دقائق، دون هز.
  6. خلال خطوات الغسيل، تمييع 5X تحقيقات الأجسام المضادة الثانوية، المضادة للأرنب زائد ومكافحة الماوس MINUS (خصوصية الأنواع من تحقيقات يعتمد على الأجسام المضادة الأولية المستخدمة)، في الأجسام المضادة تخفيف العازلة. إعداد 40 درجة مئوية من محلول الأجسام المضادة في بئر.
  7. إضافة 40 درجة مئوية من محلول الأجسام المضادة الثانوية إلى كل بئر. حضانة لمدة 60 دقيقة في 37 درجة مئوية في غرفة رطبة.
  8. إزالة محلول الأجسام المضادة الثانوية من الآبار عن طريق وضع ورقة الأنسجة على حافة البئر. غسل الشرائح 2X في 100 مل من غسل العازلة 'A' في كوبلين الشريحة تلطيخ جرة لمدة 5 دقائق، دون هز.
  9. أثناء الإذاهية يعدّ 40 [فل] من ربط خليط لكلّ بئر, ب يمزج 8 [فل] من [5إكس] ربط احتياطيّة, 31 [فل] من ماء [أولتربور] و1 [فل] من [ليغس].
  10. إضافة 40 درجة مئوية من خليط الربط إلى كل بئر. حضانة لمدة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية في غرفة رطبة.
  11. إزالة خليط الربط من الآبار عن طريق وضع ورقة الأنسجة على حافة البئر. غسل الشرائح 2X في 100 مل من غسل العازلة 'A' في كوبلين الشريحة تلطيخ جرة لمدة 2 دقيقة، دون هز.
  12. أثناء الإذاهية إعداد 40 ميكرولتر من خليط التضخيم في البئر، عن طريق خلط 8 ميكرولتر من محلول تضخيم 5X، 31.5 ميكرولتر من الماء النقي جدا، و 0.5 ميكرولتر من البلمرة.
    ملاحظة: التضخيم 5X يحتوي على تحقيقات الفلورسنت. حماية هذا الخليط من الضوء. أيضاً، حماية الشرائح من الضوء أثناء كل من الخطوات التالية. إذا كنت تستخدم الجرار الشفافة كوبلين الشريحة تلطيخ وغرف الرطبة، التفاف لهم في رقائق الألومنيوم.
  13. إضافة 40 درجة مئوية من خليط التضخيم لكل بئر. حضانة لمدة 100 دقيقة في 37 درجة مئوية في غرفة رطبة.
  14. إزالة خليط التضخيم من الآبار. غسل الشرائح 2X في 100 مل من غسل العازلة 'B' في كوبلين الشريحة تلطيخ جرة لمدة 10 دقيقة دون هز.
  15. غسل الشرائح في 100 مل من غسل العازلة 'B' المخفف 1:100 في المياه النقية في جرة كوبلين الشريحة تلطيخ لمدة 30 s.
  16. إضافة 20 درجة مئوية من DAPI تحتوي على متوسط تصاعد لكل بئر إلى الشرائح. أغلق الشرائح مع غطاء وشرائح الختم مع طلاء الأظافر.
  17. في حالة التصوير، قم باحتضان DAPI على الفور الذي يحتوي على وسط التركيب لمدة 10-15 دقيقة، مع الحماية من الضوء. إذا لم يكن الأمر كذلك، قم بتخزين الشرائح عند -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى أسبوع واحد، محمية من الضوء.

5. الكشف

  1. استخدام الفحص المجهري البؤري للحصول على صور من خلايا HeLa وS. cerevisiae وE. coli مع 20x/0.8 NA و 63x/1.4 NA و 100x/1.4 NA خطة أهداف Apochromat، على التوالي. تثير DAPI ملطخة بالحمض النووي مع ليزر صمام ثنائي نابض 405 نانومتر. للإشارة جيش التحرير الشعبي (لهذه الدراسة) تثير مع ليزر 561 نانومتر الحالة الصلبة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

كشفت دراساتنا السابقة في المختبر باستخدام البروتينات النقية أن مجموعة فرعية من الفئة البشرية A والفئة B JDPs تشكل مجمعات مختلطة عابرة من فئة JDP لاستهداف مجموعة واسعة من البروتينات المجمعة بكفاءة وربما تسهيل تجميع Hsp70 القائم على البروتين التجمّع7. وظفنا جيش التحرير الشعبي لتحديد ما إذا كانت المجمعات JDP من الفئة المختلطة (A +B) تحدث في خلايا سرطان عنق الرحم البشرية (HeLa). تم استهداف الـ JDPs DNAJA2 البشرية (الفئة A) وDNAJB1 (الفئة B) بأجسام مضادة أولية محددة للغاية وتحقيقات ثانوية لجيش التحرير الشعبي (الشكل 2A-C). وأشار ظهور الملتحمة الفلورسنت الأحمر وجود مختلطة فئة DNAJA2 وDNAJB1 المجمعات في خلايا هيلا (الشكل2C)مما يؤكد النتائج الكيميائية الحيوية السابقةلدينا7. يمثل كل الملتحم حدث تفاعل بروتين فردي في خلية هيلا سيتوسول/نواة.

النتائج البيوكيميائية السابقة التي تم الحصول عليها من نقل الطاقة بالرنين Förster (FRET)، الذي يكشف تفاعلات البروتين كقراءة لكمية الطاقة المنقولة من الفلوروفور المانح متحمس تعلق على بروتين واحد إلى مقبل مناسب فلوروفور تعلق على البروتين الثاني، وأشار إلى أن المجمعات فئة مختلطة مماثلة يمكن أن تحدث أيضا بين JDPs الخميرة، في المختبر8. تأكيدا للنتائج البيوكيميائية لدينا، لاحظنا تشكيل مجمعات فئة مختلطة بين Ydj1 (الفئة A) وSis1 (الفئة B) في الخلايا eukaryote S. cerevisiae (الخميرة الخباز) مع جيش التحرير الشعبى الصينى (الشكل2F). في الخميرة، وذلك بسبب حجم الخلايا الصغيرة والاندماج من الملتحمة متعددة، يمكن أن تكون النقاط الفلورية الفردية التي تولدها جيش التحرير الشعبي في كثير من الأحيان أقل تميزا. ولوحظ انخفاض كبير في تشكيل الملتحمة الفلورسنت بعد الضربة القاضية أو الضربة القاضية من JDPs التفاعل في كل من الخلايا البشرية والخميرة8، مما يدل على خصوصية عالية من جيش التحرير الشعبى الصينى في التقاط هذه المجمعات شارك في مرافقة في مختلف أنواع الخلايا. وعلى النقيض من نظرائهم eukaryotic، وprokaryotic(E. القولونية)JDPs تفتقر إلى القدرة على تشكيل المجمعات JDP فئة مختلطة والتعاون وظيفيا لتعزيز تصنيف البروتين، في المختبر8. وبالاتفاق مع التحليل البيوكيميائي، لم نلاحظ تشكيلًا معقدًا من الفئة المختلطة JDP بين الحمض اتّصالي-YFP البكتيري (الفئة A) وCbpA-mCherry (الفئة B)، وهي الـ JDPs الوحيدة في E. coli (الشكل2I). ومع ذلك، كان لدينا إعداد جيش التحرير الشعبي قادرة على القبض على الجمعيات مرافقة أخرى تنطوي على JDPs اثنين. على سبيل المثال، اكتشفنا مجمعات مرافقبين DnaJ-YFP وDnaK (الشكل2Lالبكتيري) وCbpA-mCherry وDnaK8 (لم تظهر البيانات). تتميز هذه المجمعات مرافقة البكتيرية اثنين على نطاق واسع على حد سواء في المختبر وفي الجسم الحي8،11،12 مما يؤكد نتائج جيش التحرير الشعبى الصينى لدينا. وتظهر هذه الملاحظات معا ً قدرة جيش التحرير الشعبي على التقاط آلات مرافقة مشكّلة بشكل عابر في الخلايا أحادية الخلية/متعددة الخلايا والخلايا البروكاريوتيكية. وأظهرت الضوابط التقنية التي تفتقر إلى الأجسام المضادة الأولية ضد واحدة من JDPs التفاعل / مرافقون، ولكن تحتوي على كل من الماوس والأرنب المستمدة من تحقيقات جيش التحرير الشعب ى الثانوية، قليلا إلى أي إشارة الفلورة الخلفية (الشكل2A، B، D، E، G، H، J,K) مما يدل على عدم وجود تضخيم إشارة إيجابية كاذبة في الإعداد التجريبي لدينا.

Figure 1
الشكل 1: التمثيل التخطيطي للخطوات الزمنية لـ "إجراء عملية ربط القرب". (1) مركب بين البروتين A والبروتين B. (2) ربط الأجسام المضادة الأولية (1 درجة) (الأخضر والبني الفاتح) إلى البروتينات A و B. يجب رفع الأجسام المضادة الأولية اثنين في الأنواع المضيفة المختلفة (مثل الماوس أو الأرنب أو الماعز). (3) يتم التعرف على الأجسام المضادة الأولية من قبل الأنواع الثانوية (2 درجة) الأجسام المضادة المرفقة بشكل مشترك مع علامات القلة الحمض النووي (تحقيقات جيش التحرير الشعبى الصينى). (4) عندما تكون البروتينات A و B في حالة معقدة، تكون تحقيقات جيش التحرير الشعبي المنضمة على مقربة من بعضها البعض لتسهيل القلة الحمض النووي للتهجين مع خيوط الحمض النووي الموصل، مما يؤدي إلى تشكيل جزيء الحمض النووي الدائري. في وقت لاحق، ligase الحمض النووي يسهل الانضمام إلى خيوط الحمض النووي معا عن طريق تحفيز تشكيل السندات فوسفوديستر. (5) بدء تضخيم الدائرة المتداول (RCA) من جزيء الحمض النووي الدائري بواسطة بوليميراز الحمض النووي البكتيري في 37 درجة مئوية. (6) توليد جزيء الحمض النووي المقعر الذي تقطعت به السبل والمرتبط بأحد الأجسام المضادة الثانوية. (7) تهجين تحقيقات oligonucleotide التكميلية التي تحمل اسم الفلورسنت إلى تسلسل متكرر فريد في جزيء الحمض النووي المقعر. بعد خطوة التهجين، يمكن تصور جزيء الحمض النووي المتسلسل كنقطة فلورسنت مشرقة في موقع مجمع البروتين المستهدف في الخلايا الثابتة. يشير الجزء السفلي إلى أنواع الخلايا البروكاريوتيكية وeukaryotic التي يتم تطبيق تقنية جيش التحرير الشعبي. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2 التجمعات النشابية الجزيئية التي تم التقاطها من قبل جيش التحرير الشعبي في الخلايا prokaryotic وeukaryotic. (A-C)الكشف عن مجمعات JDP فئة مختلطة شكلت بين DNAJA2 (الفئة A) وDNAJB1 (الفئة B) في خط خلايا سرطان عنق الرحم البشرية HeLa. جيش التحرير الشعبى الصينى أجريت مع (A) المضادة للDNAJA2 الأجسام المضادة وحدها (السيطرة التقنية السلبية)؛ (B) المضادة للDNAJB1 الأجسام المضادة وحدها (السيطرة التقنية السلبية)؛ (C) الأجسام المضادة للDNAJB1 والمضادة للDNAJA2 معا. ظهور نقاط الفلورسنت متعددة في لوحة C (إشارة إيجابية) يشير إلى وجود مجمعات البروتين التي شكلت بين DNAJA2 وDNAJB1. كل نقطة الفلورسنت الأحمر / punctum يمثل تفاعل واحد. النوى (DNA) ملطخة DAPI (سماوي). (D-F) الكشف عن مجمعات JDP فئة مختلطة شكلت بين Ydj1 (الفئة A) وSis1 (الفئة B) في الخلايا S. cerevisiae. (D) جيش التحرير الشعبى الصينى أجريت مع الأجسام المضادة لمكافحة Ydj1 وحدها (السيطرة التقنية السلبية)؛ (E) جيش التحرير الشعبى الصينى أجريت مع الأجسام المضادة لمكافحة Sis1 وحدها (السيطرة التقنية السلبية)؛ (F) جيش التحرير الشعبى الصينى أجريت مع الأجسام المضادة لYdj1 والمضادة لSis1 معا. إشارة الفلورسنت الإيجابية تدل على وجود Ydj1 وSis1 المجمعات في S. cerevisiae. نواة الخميرة ملطخة DAPI (سماوي). (خع-ل) الكشف عن مجمعات مرافقة شكلت بين Hsp70 prokaryotic (DnaK) وJDPs (DnaJ وCbpA) في خلايا القولونية E. . بسبب عدم وجود أجسام مضادة أولية محددة ضد JDPs prokaryotic، وE. القولونية DnaJ (الفئة A) وCbpA (الفئة B) والموسومة مع YFP وmCherry، على التوالي. (ع،ي) جيش التحرير الشعبى الصينى يؤديها مع مكافحة YFP وحدها (السيطرة التقنية السلبية)؛ (ح) جيش التحرير الشعبى الصينى يؤديها مع مكافحة mCherry وحدها (السيطرة التقنية السلبية). (I) جيش التحرير الشعبى الصينى أجريت مع المضادة للYFP ومكافحة mCherry الأجسام المضادة. عدم وجود تشكيل نقطة الفلورسنت يشير إلى عدم وجود تشكيل معقدة بين DnaJ وCbpA. (K) جيش التحرير الشعبى الصينى أجريت مع الأجسام المضادة للDnaK وحدها (السيطرة التقنية السلبية). (L) جيش التحرير الشعبى الصينى أجريت مع الأجسام المضادة لمكافحة YFP والمضادة للحمض النووي معا. إشارة الفلورسنت الإيجابية تشير إلى تشكيل معقد بين DnaK وDnaJ. الحمض النووي البكتيري الملون مع DAPI (سماوي). وبالإضافة إلى احتواء جسم مضاد أولي واحد، أجريت جميع الضوابط التقنية السلبية في حضور تحقيقات جيش التحرير الشعبي الثانوية ذات الصلة. قضبان مقياس = 10 ميكرومتر.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

وقد استخدمت النُهُج القائمة على التسيب المناعي المشترك والتوطين المشترك كأساليب طويلة الأمد لتوصيف تجميع البروتين. ويشكل الكشف عن مجمعات مرافقة محددة مشكلة بصورة عابرة تحديا رئيسيا بهذه الأساليب التقليدية، ونتيجة لذلك، فإن النتائج السابقة تقتصر إلى حد كبير على التفسيرات النوعية. غالباً ما تتطلب تقنيات الترسيب المناعي المشترك القائم على تحليل الخلايا ربطًا عبرية لتثبيت تفاعلات البروتين والبروتين. يزيد تحليل الخلايا من خطر تعطيل مجمعات مرافقة مشكلة بشكل عابر، في حين أن الربط المتبادل يمكن أن يدخل تفاعلات غير أصلية، لا سيما مدفوعاً بـ "الالتصاق" المتأصل في معظم المرافقين. عند تحليل نظام مرافق Hsp70 باستخدام الترسيب المناعي المشترك، يمكن أن تنشأ القطع الأثرية المحتملة من (أ) مستويات التعبير العالية للمرافقة و (ب) قضايا الذوبان المتعلقة بالأغشية أو البروتين الكلي آلة مرافقة ملزمة. وإلى جانب ذلك، فإن التقنيات القائمة على المهطول المناعي المشترك لا توفر أي معلومات عن التوطين الخلوي لتجميعات البروتين التي تم التقاطها، والتي يمكن أن تكون مهمة لتحديد الوظائف المرتبطة بها. يتم تقليل عيوب استخدام تقنيات الترسيب المناعي المشترك إلى حد ما في النهج القائمة على التعريب المشترك التي تحافظ على معلومات توطين البروتين. ومع ذلك، فإن التعريب المشترك لاثنين أو أكثر من البروتينات يمكن أن تشير إما الارتباط المباشر البروتين البروتين أو تقسيم البروتينات إلى نفس المجال الصغير في الخلايا. ولذلك، فإن تحليل التعريب المشترك هو، في أحسن الأحوال، تخمين في التنبؤ بتفاعلات البروتين ويفتقر إلى أي قيمة القرب. بسبب الكشف عن البروتينات المستهدفة بشكل مجمّع وعشوائي، فإن هذه التقنية محدودة للغاية في دراسة تجمعات بروتين محددة في الخلايا. وهذا أمر مثير للمشاكل بشكل خاص عندما يمكن للبروتين (البروتين) المستهدف، بالتوازي مع ذلك، أن يشكل مجموعة واسعة من تجمعات البروتين المتميزة كما هو الحال مع نظام المرافقين Hsp70. بالمقارنة مع هذه المنهجيات التقليدية، جيش التحرير الشعبي هو تقنية أكثر دقة في الموقع وضعت للكشف بقوة وقياس جمعيات البروتين المحلية في الخلايا مع معلومات توطين البروتين المحفوظة. يتم الكشف عن تفاعل البروتين من خلال هذا القول على أساس القرب (حوالي 10-30 نانومتر) بين البروتينات المستهدفة. جيش التحرير الشعبي هو "قابل للضبط" في أن نطاق المسافة القرب يمكن تخفيضها للحصول على قراءة أكثر صرامة من قبل (أ) تقليل طول العلامات oligonucleotide تعلق على تحقيقات جيش التحرير الشعبي و / أو (ب) اقتران العلامات مباشرة إلى الأجسام المضادة الأولية. وينبغي توخي الحذر عند تفسير إشارة جيش التحرير الشعبي إيجابية. من الناحية المثالية، ينبغي تأكيد تفاعل البروتين مع اثنين أو أكثر من المنهجيات المستقلة. كثافة إشارة الفلورسنت في جيش التحرير الشعبي ليست كما يرتبط بشكل حتمي لحجم كتلة البروتين أو مسافة الفصل بين البروتينات المتفاعلة كما هو الحال مع FRET. ومع ذلك، جيش التحرير الشعبى الصينى لديه درجة عالية من الخصوصية والحساسية ، ويمكن حتى أن تستخدم لتحليل البروتينات الوفيرة منخفضة جدا مثل عوامل النمو أو السيتوكينات وتفاعلاتها في أنواع الخلايا النادرة أو العينات السريرية13.

وHsp70 مرافق شركاء مع العديد من الشركاء (على سبيل المثال، JDPs وNEFs) خلال عمرها الخلوي14 لقيادة وظائف بيولوجية متميزة. العدد الهائل من تكوينات الجهاز Hsp70-JDP-NEF المحتملة وسلوكها الديناميكي في الخلايا قد أعاقت إلى حد كبير فهم مفصل للأدوار المحددة لهذه الآلات مرافقة. ولذلك، فإن الأدوات البيولوجية التي تسمح بالتتبع الانتقائي للتجمعات المتميزة Hsp70 مطلوبة لتشريح الأسلاك العامة لهذه الشبكة النكّابية في الخلايا. تم التقاط المجمعات مرافقJDP-JDP-Hsp70 التي تم تشكيلها بشكل عابر بشكل فعال في الخلايا مع جيش التحرير الشعبي، مما يشير إلى أن هذه التقنية مناسبة لدراسة التفاعلات الجزيئية مع ثوابت التفكك العالية (على سبيل المثال، > 3 ميكرومتر كد ). على الرغم من ذلك، في العمل الحالي، يتم استخدام الفحص في المقام الأول كمؤشر ثنائي نوع "نعم" أو "لا" للتفاعل الشاربون، يمكن للمستخدمين استخدام هذه التقنية للحصول على قراءة شبه كمية لدرجة التفاعل عن طريق العد الرقمي للفلورة [ 15] ومع ذلك، بسبب التضخيم غير الخطي لإشارة جيش التحرير الشعبي، ينبغي توخي الحذر عند تفسير بيانات جيش التحرير الشعبي بطريقة كمية16. وعلى الرغم من المزايا المذكورة أعلاه، فإن لهذه الطريقة بعض القيود. واحدة من العيوب الرئيسية لجيش التحرير الشعبي هو أن الاختبار يتطلب تثبيت الخلية وبالتالي الحد إلى حد كبير من قدرتها على حل الديناميات الزمنية لتعقيد البروتين في الخلايا الحية. في المقابل، في الجسم الحي FRET17 أو نقل الطاقة بالرنين الإنارة الحيوية (BRET)18 يسمح برصد تفاعلات البروتين مماثلة بطريقة spatio-الزمنية في الخلايا الحية مع قيم القرب أصغر نسبيا (<10 نانومتر). وعلى النقيض من جيش التحرير الشعبي، تظهر إشارة FRET ارتباطًا خطيًا صارمًا مع مستويات التعبير البروتيني16 مما يجعل FRET المعيار الذهبي في التحليل الكمي لتفاعلات البروتين. ومع ذلك، على عكس اعتماد فريتعلى عامل التوجه الغامض 2، لا يتأثر جيش التحرير الشعبي بتوجه تحقيقات جيش التحرير الشعبي، مما يزيد من احتمال التقاط مجمع البروتين19. ومن حيث سهولة استخدام المستخدمين، تحتاج فريت وبريت سخبرة فريدة مما يحد عموما من إمكانية الوصول إلى هذه المنهجيات بالنسبة لمجتمع البحوث الأوسع نطاقا. وعلاوة على ذلك، كل من هذه التقنيات تتطلب تعديل البروتينات المتفاعلة عن طريق إرفاق علامات البروتين الإنارة /الفلورسنت الضخمة التي يمكن أن تتداخل مع وظيفة البروتين وتشكيل معقدة.

تتطلب الخطوات التالية (1-4) دراسة متأنية للتنفيذ الناجح لجيش التحرير الشعبي في الخلايا. (1) اختيار الأجسام المضادة: مجموعة جيش التحرير الشعبى الصينى المتاحة تجاريا متوافقمع الأجسام المضادة الأولية التي أثيرت ضد الماوس والأرانب والماعز فقط. يتطلب جيش التحرير الشعبي الأمريكي أجسامًا مضادة أساسية محددة للغاية لا ترتبط بالأهداف. بالإضافة إلى ذلك، من المهم اختيار الأجسام المضادة الأولية التي تتوافق مع تطبيقات مثل الكيمياء المناعية (IHC)، والفحص المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA)، و/أو هطول الأمطار المناعية (IP) لضمان أن الأجسام المضادة يمكن أن تعترف تسلسل الأحماض الأمينية المضادة للجينات المكشوفة على سطح البروتينات مطوية. قبل الاستخدام، ينصح بشدة اختبار جميع الأجسام المضادة الأولية لخصوصيتها. ويمكن أن يتم ذلك عن طريق تحليل وصمة عار الغربية من lysates الخلية بأكملها. في الحالات التي يكون فيها للبروتينات المستهدفة متجانسات مع اختلافات صغيرة في الحجم وتشابه التسلسل (على سبيل المثال، Hsp70 وJDP paralogs)، يمكن اختبار خصوصية الأجسام المضادة مع نهج ضربة قاضية/خروج المغلوب الجينات أو عن طريق التحقيق ضد تنقية المثلية لاستبعاد أي اعتراف عبر المحتملة. إذا لم تتوفر الأجسام المضادة المناسبة، يمكن وضع علامة على البروتينات المستهدفة مع epitopes التي لديها الأجسام المضادة ذات الجودة المقبولة (الشكل 2 واو). (2) تثبيت ونفاذ الخلايا: يمكن استخدام علاج 4٪ بارافورمالهايد و 0.1-0.5٪ تريتون-X100 لإصلاح ونفاذ الخلايا، على التوالي. استخدام 4٪ بارافورمالدهايد هو علاج أفضل للحفاظ على تفاعلات البروتين البروتين والبنية الفائقة الخلوية مقارنة مع الظروف المثبتة التي تستخدم 99٪ الميثانول20,21,22. إصلاح الخلايا مع الميثانول 99٪، ومع ذلك، تسفر عن أقل تلطيخ الخلفية السيتوبلازمية، وربما هو أكثر ملاءمة لحالات محددة مثل الكشف عن الهياكل الخلوية المرتبطة جمعيات البروتين21,22. ويمكن تحقيق نفاذية فعالة لكل من غشاء البلازما وكذلك الأغشية العضوية لزيادة إمكانية الوصول إلى الأجسام المضادة مع غير الأيونية السطحي تريتون-X100. Triton-X100 يمكن، ومع ذلك، غير محدد إزالة البروتينات من غشاء البلازما23,24. لذلك، لتحليل جمعيات البروتين المرتبطة بالأغشية الخلوية، يمكن تطبيق المنظفات البديلة مثل الصابونين أو الرقمية التي تستهدف الستيرول لنفاذ الأغشية21,22,25. (3) تعطيل جدار الخلية: قبل نفاذية الغشاء، هناك حاجة إلى خطوة إضافية تنطوي على إنزيمات اللتيك محددة لزيادة قابلية الأجسام المضادة في أنواع الخلايا مع جدران الخلايا (مثل الفطريات والخلايا النباتية والبكتيرية). على سبيل المثال، وظفنا lyticase، الذي يحط β-glucan لتعطيل جدار الخلية منS. cerevisiae26. وبالمثل، فإنE. coliتم تعطيل جدار الخلية باستخدام lysozyme، وهو إنزيم يستهدف peptidoglycans27,28. يختلف تكوين جدار الخلية وحساسية إنزيم اللتيك مع ظروف نمو مختلفة26والثقافة التقاء29,30. ولذلك، فإن تركيز الإنزيمات اللاتيك وأوقات الهضم قد تختلف ويجب توخي الحذر لمنع الإفراط في عسر الهضم أو نقص الخلايا. بعد هضم جدار الخلية، والخلايا هشة نسبيا وتتطلب عوامل الازدحام مثل السوربيتول بالنسبة لهم أن تبقى سليمة خلال خطوات الغسيل. (4) تضخيم الحمض النووي: ربط الحمض النووي وخطوات رد فعل PCR الدائرة المتداول حساسة لتقلبات درجة الحرارة والرطوبة. لضمان تضخيم الحمض النووي قوية واستنساخ من فحص، ومطلوب هذه ردود الفعل ليتم تنفيذها في 37 درجة مئوية في غرفة الرطوبة. الأهم من ذلك، ينبغي منع الخلايا proccessed من التجفيف أثناء إجراء الاختبار لتجنب أي غير محددة الأجسام المضادة ملزمة والحمض النووي تضخيم الأحداث التي يمكن أن تؤدي إلى زيادة في إشارة الخلفية.

كل شيء في الاعتبار، وتنفيذ هذا الاختبار لا يتطلب خبرة فريدة من نوعها والأجهزة المتطورة. الرصد الناجح لمجمعات JDP-JDP وJDP-Hsp70 chaperone توضح التطبيق المحتمل لهذه التقنية لتتبع جمعيات البروتين شكلت بشكل عابر في جميع أنواع الخلايا. تنفيذنا لهذه التقنية في الخميرة والبكتيريا يزيد بشكل كبير من إمكانية تطبيق جيش التحرير الشعبى الصينى لدراسة مختلف العمليات البيولوجية التي توسطت فيها جمعيات البروتين المتميزة في مجموعة واسعة من الكائنات الحية. وعلاوة على ذلك، يسلط عملنا الضوء على جيش التحرير الشعبي كأداةجديدة واعدة للتفاعل البروتين يُنظر في التغيرات التطورية التي تحدث على المستوى الجزيئي عبر الأنواع 8.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

ويتلقى البرنامج دعما من منحة توظيف خاصة من كلية الطب في جامعة موناش للتمريض والعلوم الصحية بتمويل من حكومة ولاية فيكتوريا والحكومة الأسترالية. نشكر بيرند بوكو (ZMBH، جامعة هايدلبرغ، ألمانيا) وهارم ه. كامبينجا (قسم العلوم الطبية الحيوية للخلايا والنظم، جامعة خرونينغين، هولندا) على دعمهما ومشاركة الكواشف التي لا تقدر بثمن، هولغر لورنز (ZMBH) مرفق التصوير، جامعة هايدلبرغ، ألمانيا) لدعمه في الفحص المجهري البؤري ومعالجة الصور، وكلير هيرست (ARMI، جامعة موناش، أستراليا) للقراءة النقدية للمخطوطة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
37% Formaldehyde Merck 103999
Acetone Sigma-Aldrich 32201
anti-DNAJA2 antibody Abcam ab157216
anti-DNAJB1 Antibody Enzo Life Sciences ADI-SPA-450
anti-DnaK antibody In house
anti-mCherry antibody Abcam ab125096
anti-Sis1 Antibody Cosmo Bio Corp COP-080051
anti-Ydj1 antibody StressMarq Biosciences  SMC-150,
anti-YFP antibody In house
Coplin slide-staining jar Sigma-Aldrich S5516
Diagnostic slides Marienfeld 1216530
DMEM Thermo-Fischer 31966021
DuoLink In Situ Detection Reagents Orange Sigma-Aldrich DUO92007
DuoLink In Situ Mounting Medium + DAPI Sigma-Aldrich DUO82040
DuoLink In Situ PLA Probe Anti-Mouse MINUS Sigma-Aldrich DUO92004
DuoLink In Situ PLA Probe Anti-Rabbit PLUS Sigma-Aldrich DUO92002
DuoLink In Situ Wash Buffers, Fluorescence Sigma-Aldrich DUO82049
Fetal Calf Serum Thermo-Fischer 10082147
Lysozyme Sigma-Aldrich 62971
Methanol Sigma-Aldrich 32213
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148
Penicillin/Streptomycin Thermo-Fischer 15070063
Poly-L-Lysine Sigma-Aldrich P47-07
Sorbitol Sigma-Aldrich S7547
Triton-X100 Merck 108643
Trypsin Thermo-Fischer 25300096
Tween-20 Sigma-Aldrich P1379
Zymolase 100T / / Lyticase United States Biological Z1004

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Soderberg, O., et al. Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation. Nature Methods. 3 (12), 995-1000 (2006).
  2. Weibrecht, I., et al. Proximity ligation assays: a recent addition to the proteomics toolbox. Expert Review of Proteomics. 7 (3), 401-409 (2010).
  3. Mayer, M. P., Gierasch, L. M. Recent advances in the structural and mechanistic aspects of Hsp70 molecular chaperones. Journal of Biological Chemistry. 294 (6), 2085-2097 (2019).
  4. Kampinga, H. H., Craig, E. A. The HSP70 chaperone machinery: J proteins as drivers of functional specificity. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11 (8), 579-592 (2010).
  5. Nillegoda, N. B., Bukau, B. Metazoan Hsp70-based protein disaggregases: emergence and mechanisms. Frontiers in Molecular Biosciences. 2, (2015).
  6. Bracher, A., Verghese, J. The nucleotide exchange factors of Hsp70 molecular chaperones. Frontiers in Molecular Biosciences. 2, (2015).
  7. Nillegoda, N. B., et al. Crucial HSP70 co-chaperone complex unlocks metazoan protein disaggregation. Nature. 524 (7564), 247-251 (2015).
  8. Nillegoda, N. B., et al. Evolution of an intricate J-protein network driving protein disaggregation in eukaryotes. Elife. 6, (2017).
  9. Kirstein, J., et al. In vivo properties of the disaggregase function of J-proteins and Hsc70 in Caenorhabditis elegans stress and aging. Aging Cell. 16 (6), 1414-1424 (2017).
  10. Nillegoda, N. B., Wentink, A. S., Bukau, B. Protein Disaggregation in multicellular organisms. Trends in Biochemical Sciences. 43 (4), 285-300 (2018).
  11. Chae, C., Sharma, S., Hoskins, J. R., Wickner, S. CbpA, a DnaJ homolog, is a DnaK co-chaperone, and its activity is modulated by CbpM. Journal of Biological Chemistry. 279 (32), 33147-33153 (2004).
  12. Kityk, R., Kopp, J., Mayer, M. P. Molecular Mechanism of J-domain-Triggered ATP Hydrolysis by Hsp70 Chaperones. Molecular Cell. 69 (2), 227-237 (2018).
  13. Söderberg, O., et al. Characterizing proteins and their interactions in cells and tissues using the in situ proximity ligation assay. Methods. 45 (3), 227-232 (2008).
  14. Benschop, J. J., et al. A consensus of core protein complex compositions for Saccharomyces cerevisiae. Molecular Cell. 38 (6), 916-928 (2010).
  15. Jung, J., et al. Quantifying RNA-protein interactions in situ using modified-MTRIPs and proximity ligation. Nucleic Acids Research. 41 (1), (2013).
  16. Mocanu, M. M., Váradi, T., Szöllosi, J., Nagy, P. Comparative analysis of fluorescence resonance energy transfer (FRET) and proximity ligation assay (PLA). Proteomics. 11 (10), 2063-2070 (2011).
  17. Sekar, R. B., Periasamy, A. Fluorescence resonance energy transfer (FRET) microscopy imaging of live cell protein localizations. Journal of Cell Biology. 160 (5), 629-633 (2003).
  18. Deriziotis, P., Graham, S. A., Estruch, S. B., Fisher, S. E. Investigating protein-protein interactions in live cells using bioluminescence resonance energy transfer. Journal of Visualized Experiments. 87, (2014).
  19. Nagy, P., Szöllosi, J. Proximity or no proximity: that is the question – but the answer is more complex. Cytometry. 75 (10), 813-815 (2009).
  20. Hoetelmans, R. W., et al. Effects of acetone, methanol, or paraformaldehyde on cellular structure, visualized by reflection contrast microscopy and transmission and scanning electron microscopy. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 9 (4), 346-351 (2001).
  21. Schnell, U., Dijk, F., Sjollema, K. A., Giepmans, B. N. Immunolabeling artifacts and the need for live-cell imaging. Nature Methods. 9 (2), 152-158 (2012).
  22. Stadler, C., Skogs, M., Brismar, H., Uhlen, M., Lundberg, E. A single fixation protocol for proteome-wide immunofluorescence localization studies. Journal of Proteomics. 73 (6), 1067-1078 (2010).
  23. Goldenthal, K. L., Hedman, K., Chen, J. W., August, J. T., Willingham, M. C. Postfixation detergent treatment for immunofluorescence suppresses localization of some integral membrane proteins. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 33 (8), 813-820 (1985).
  24. Schrader, M., Almeida, M., Grille, S. Postfixation detergent treatment liberates the membrane modelling protein Pex11beta from peroxisomal membranes. Histochemistry & Cell Biology. 138 (3), 541-547 (2012).
  25. Willingham, M. C., Yamada, S. S., Pastan, I. Ultrastructural antibody localization of alpha2-macroglobulin in membrane-limited vesicles in cultured cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 75 (9), 4359-4363 (1978).
  26. Aguilar-Uscanga, B., Francois, J. M. A study of the yeast cell wall composition and structure in response to growth conditions and mode of cultivation. Letters in Applied Microbiology. 37 (3), 268-274 (2003).
  27. Romaniuk, J. A., Cegelski, L. Bacterial cell wall composition and the influence of antibiotics by cell-wall and whole-cell NMR. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 370, 1679 (2015).
  28. Salazar, O., Asenjo, J. A. Enzymatic lysis of microbial cells. Biotechnology Letters. 29 (7), 985-994 (2007).
  29. Cunningham, A. F., Spreadbury, C. L. Mycobacterial stationary phase induced by low oxygen tension: cell wall thickening and localization of the 16-kilodalton alpha-crystallin homolog. Journal of Bacteriology. 180 (4), 801-808 (1998).
  30. Werner-Washburne, M., Braun, E., Johnston, G. C., Singer, R. A. Stationary phase in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Microbiological Reviews. 57 (2), 383-401 (1993).

Tags

هذا الشهر في JoVE العدد 151 القرب الربط اختبار Chaperone J-المجال البروتين Hsp70 الإنسان البكتيريا الخميرة E. القولونية S. سيريفيسياي تفاعل البروتين بروتويستاسيس
الرصد في الموقع للجمعيات النكّيّازة الجزيئية المشكلة بشكل عابر في البكتيريا والخميرة والخلايا البشرية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Alberts, N., Mathangasinghe, Y.,… More

Alberts, N., Mathangasinghe, Y., Nillegoda, N. B. In Situ Monitoring of Transiently Formed Molecular Chaperone Assemblies in Bacteria, Yeast, and Human Cells. J. Vis. Exp. (151), e60172, doi:10.3791/60172 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter