Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

In situ overvåking av midlertidig dannet Molecular Anstandsdame forsamlinger i bakterier, gjær, og menneskelige celler

Published: September 2, 2019 doi: 10.3791/60172
Automatic Translation
*1, *2, 3
1Department of Biomedical Sciences of Cells & Systems, University of Groningen, 2Department of Anatomy, Faculty of Medicine, University of Colombo, 3Australian Regenerative Medicine Institute (ARMI), Monash University
* These authors contributed equally

Summary

Beslektet J-Domain proteiner samarbeide med Hsp70 Anstandsdame å bistå i en myriade av biologiske prosesser som spenner fra protein folding til fornedrelse. Her beskriver vi en in situ nærhet ligation analysen, som tillater overvåking av disse midlertidig dannet Anstandsdame machineries i bakteriell, gjær og menneskelige celler.

Abstract

J-Domain proteiner (JDPs) danner den største og mest varierte co-Anstandsdame familie i eukaryote celler. Nylige funn viser at bestemte medlemmer av JDP-familien kan danne forbigående heterocomplexes i Landplantenes for å finjustere substrat valg for 70-Hsp70 kDa varme sjokk protein Anstandsdame. JDP-komplekser målet akutt/kronisk stress indusert aggregerte proteiner og antagelig hjelpe montere disaggregases ved å rekruttere flere Hsp70s til overflaten av protein aggregater. Omfanget av protein kvalitetskontroll (PQC) nettverk dannet av disse fysisk samspill JDPs fortsatt i stor grad uncharacterized in vivo. Her beskriver vi en mikroskopi-basert in situ protein interaksjon analysen navngitt nærhet ligation analysen (PLA), som er i stand til å robust fange disse midlertidig dannet Anstandsdame komplekser i distinkte cellulære rom av eukaryote celler. Vårt arbeid utvider ansettelse av PLA fra menneskelige celler til gjær (Saccharomyces cerevisiae) og bakterier (Escherichia coli), og dermed gjengi et viktig verktøy for å overvåke dynamikken i midlertidig dannet protein forsamlinger i både prokaryote og eukaryote celler.

Introduction

En enorm mengde genomisk informasjon forblir uninterpretable på grunn av vår ufullstendige forståelse av mobilnettet interactomes. Konvensjonelle protein-protein interaksjon deteksjon metoder som protein co-immunutfelling med/uten kjemiske kryss-linking og protein co-lokalisering, men mye brukt, utgjør en rekke ulemper. Noen av de viktigste ulempene inkluderer dårlig kvantifisering av interaksjoner og den potensielle innføringen av ikke-innfødte bindende hendelser. Til sammenligning, nye nærhet-baserte teknikker gir et alternativ og en kraftig tilnærming for å fange protein interaksjoner i celler. Den nærhet ligation analysen (PLA)1, nå tilgjengelig som en proprietær Kit, sysselsetter antistoffer mot spesifikt mål protein komplekser basert på nærhet av samspill under enheter.

PLA er initiert av dannelsen av et stillas bestående av primære og sekundære antistoffer med små DNA-koder (PLA-sonder) på overflaten av målrettede protein kompleks (figur 1, trinn 1-3). Deretter bestemmes av nærhet av DNA-koder, en sirkulær DNA molekyl genereres via hybridisering med kontakten oligonukleotider (figur 1, trinn 4). Dannelsen av sirkulær DNA er fullført av et DNA ligation trinn. Den nyopprettede sirkulære stykke DNA fungerer som en mal for den påfølgende rullende sirkel forsterkning (RCA)-baserte polymerase kjedere reaksjon (PCR) primet av en av de bøyd oligonukleotid koder. Dette genererer en enkelt-strandet concatemeric DNA-molekyl festet til proteinet kompleks via antistoff stillaset (figur 1, trinn 6). Det concatemeric DNA-molekylet er visualisere ved hjelp av fluorescensmerkete merket oligonukleotider som hybridize til flere unike sekvenser spredt over forsterket DNA (figur 1, trinn 7)2. Den genererte PLA signal, som vises som et fluorescerende prikk (figur 1, trinn 7), tilsvarer plasseringen av målrettede protein kompleks i cellen. Som et resultat, analysen kunne oppdage protein komplekser med høy romlig nøyaktighet. Teknikken er ikke begrenset til å bare fange protein interaksjoner, men kan også utnyttes til å oppdage enkelt molekyler eller protein modifikasjoner på proteiner med høy følsomhet1,2.

Hsp70 danner et svært allsidig Anstandsdame system fundamentalt viktig for å opprettholde cellulær protein homeostase ved å delta i en rekke housekeeping og stress-tilknyttede funksjoner. Housekeeping aktiviteter i Hsp70 Anstandsdame systemet inkluderer de Novo protein folding, protein translokasjon over cellulære membraner, montering og demontering av protein komplekser, regulering av protein aktivitet og linking ulike protein folding/ kvalitetskontroll machineries3. Det samme Anstandsdame systemet også refolds misfolded/utfoldet proteiner, forebygger protein aggregering, fremmer protein Disaggregation og samarbeider med cellulære proteaser for å svekke døds misfolded/skadede proteiner for å lette cellulær reparasjon etter proteotoxic understreker4,5. For å oppnå dette funksjonelle mangfoldet er Hsp70-Anstandsdame avhengig av partnerskap med chaperones av JDP-familien og nukleotid utvekslings faktorer (NEFs) som finjusterer Hsp70's ATP-avhengige nukleosid kontroll av substrat binding og Release3, 6i den. Videre spiller JDP co-chaperones en viktig rolle i valg av underlag for dette allsidige Anstandsdame systemet. Medlemmer av denne familien er inndelt i tre klasser (A, B og C) basert på deres strukturelle homologi til prototypen JDP, E. coli DnaJ. Klasse A JDPs inneholder en N-Terminal J-domene, som samhandler med Hsp70, en Glycine-fenylalanin rike regionen, et substrat bindende region bestående av en sink finger-lignende region (ZFLR) og to β-fat domener, og en C-terminal dimerization domene. JDPs med N-Terminal J-domene og et Glycine-fenylalanin rikt område, men mangler ZFLR, faller i klasse B. Generelt er medlemmer av disse to klassene involvert i passe funksjoner. Medlemmer faller under oppsamlingsadresse klasse C, som inneholder JDPs som bare deler J-domene4, rekruttere Hsp70s å utføre en rekke ikke-passe funksjoner. Den viktige rollen JDPs som utskiftbare substrat anerkjennelse "adaptere" av Hsp70 systemet gjenspeiles av en utvidelse av familiemedlemmer under evolusjon. For eksempel, mennesker har over 42 distinkte JDP medlemmer4. Disse JDPs fungere som monomerer, homodimers og/eller homo/hetero oligomers4,5. Nylig, et funksjonelt samarbeid via forbigående kompleks formasjon mellom klasse A (f. eks H. sapiens DNAJA2; S. cerevisiae Ydj1) og klasse B (f. eks H. sapiens DNAJB1; S. cerevisiae Sis1) eukaryote JDPs ble rapportert å fremme effektiv anerkjennelse av amorfe protein aggregater i vitro7,8. Disse blandede klasse JDP komplekser antagelig montere på overflaten av aggregerte proteiner for å lette dannelsen av Hsp70-og Hsp70 + Hsp100-basert protein disaggregases7,8,9, 10. den kritiske bevis for å støtte eksistensen av disse midlertidig dannet blandet klasse JDP komplekser i eukaryote celler ble UTSTYRT med PLA8.

PLA er i økende grad ansatt for å vurdere protein interaksjoner i metazoa, hovedsakelig i pattedyrceller. Her rapporterer vi den vellykkede utvidelsen av denne teknikken til å overvåke midlertidig dannet Anstandsdame komplekser i eukaryote og prokaryote encellede organismer som spirende gjær S. cerevisiae og bakterien E. coli. Viktigere, denne utvidelsen fremhever den potensielle bruken av PLA i å oppdage og analysere mikrober som infiserer menneske-og dyreceller.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. HeLa Cell forberedelse

  1. Forbered følgende materialer: PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM na2HPO4, 1,8 mm KH2PO4), pH 7,4; DMEM, supplert med 10% FCS og 1% pen-strep; 4% paraformaldehyde i PBS; 0,5% Triton-X100 i PBS; TBS-T (150 mM NaCl, 20 mM Tris, 0,05% mellom), pH 7,4; 0,0001% steril Poly-L-lysin løsning; 10-brønn diagnostiske lysbilder; et fuktig kammer; vevs papir; og Coplin Slide-farging krukker.
    Merk: For å sikre optimal fiksering effektivitet, paraformaldehyde løsninger bør tilberedes friskt før hvert eksperiment.
  2. Forbered et fuktig kammer ved å dekke bunnen av en lukket boks med vått vev. Plasser fuktig kammer ved 37 ° c før du starter eksperimentet, for å sikre at kammertemperaturen er på 37 ° c mens du incubating enzymatisk reaksjon.
  3. Kultur HeLa celler i T25 flasker, i 5 mL DMEM (høy glukose, glutamat og natrium Pyruvat supplert) supplert med 10% FCS og 1% pen-strep, i en 37 ° c CO2 inkubator som inneholder 5% co2. Distansere tilhenger celler ved hjelp 0,05% Trypsin-EDTA. Etter tilsetning av ferske DMEM til dissosiert celler, telle celler ved hjelp av en celle telling kammer og vokse på diagnostiske lysbilder inne i et fuktig kammer.
  4. Sterilisere diagnostiske lysbilder ved UV-bestråling i en steril cellekultur hette i 30 min.
  5. Tilsett 100 μL av steril, filtrert 0,0001% Poly-L-lysin til hver brønn som kreves for eksperimentet. Ruge i 30 min. vask bort overflødig Poly-L-lysin ved å vaske hver brønn 3x med 50 μL ultrarent vann.
  6. Trypsinize jakten cellene og legge til ca 15 000 celler til hver brønn. Om nødvendig, fortynne celler til minst 30-50 μL av DMEM per brønn.
  7. Vokse celler i et fuktig kammer innenfor en 37 ° c 5% CO2 inkubator for ca 24 h. celler skal være 60%-80% confluent før du starter PLA.
    Merk: For høyt en confluency reduserer absorpsjonen av reagenser, noe som reduserer det oppnådde signalet på slutten av protokollen.
  8. Fjern medium ved å plassere et silkepapir på kanten av brønnen. Vask brønner 3x med 50 μL av PBS.
    Merk: Celler er gjenstand for frakobling når væsker tilsettes strengt. Dette kan forebygges ved ikke å la brønnene tørke helt før du legger til ny væske og ved å legge den nye væsken forsiktig til kanten av brønnen.
  9. Fiks celler ved å legge til 50 μL av ferskt tilberedte 4% paraformaldehyde i PBS til hver brønn. Ruge i 10 minutter ved romtemperatur.
  10. Vask lysbilder 3x i PBS. Utfør vasker i en Coplin Slide-farging jar som inneholder 100 mL av PBS. For hver vask, ruge i 5 min ved romtemperatur uten risting.
  11. Permeabilize cellemembranen ved å submerging lysbildene i 100 mL 0,5% Triton-X100 i PBS i en Coplin Slide-farging jar. Ruge i 10 minutter ved romtemperatur uten risting.
  12. Vask lysbilder 3x i TBS-T. Utfør vasker i en Coplin Slide-farging jar som inneholder 100 mL av TBS-T. For hver vask, ruge i 5 min ved romtemperatur uten risting.
  13. Etter siste vask, fjerne overflødig buffer med en silkepapir. På dette punktet cellene er klar for nærhets ligation analysen protokollen som vil bli diskutert i § 4.

2. S. cerevisiae celle forberedelse

  1. Forbered følgende materialer: 100 mM KPO4, pH 6,5, referert til som vaske buffer; 37% formaldehyd; 4% paraformaldehyde i 100 mM KPO4, pH 6,5; 1,2 M Sorbitol i 100 mM KPO4, pH 6,5; lyticase oppløsning (500 μg/mL lyticase, 20 mM β-mercaptoethanol, 100 mM KPO4, pH 6,5); 0,0001% Poly-L-lysin løsning; 1% Triton-X100 i 100 mM KPO4, pH 6,5; 10-brønn diagnostiske lysbilder; et fuktig kammer (fremstilt som i trinn 1,2); vevs papir; og Coplin Slide-farging krukker.
    Merk: For å sikre optimal fiksering effektivitet, paraformaldehyde løsninger bør tilberedes friskt før hvert eksperiment.
  2. Grow en overnatting kultur i ikke-selektiv gjærekstrakt, Peptone og druesukker (YPD) medium ved 30 ° c mens risting.
    Merk: Avhengig av eksperimentelle krav S. cerevisiae celler kan dyrkes i syntetisk Complete (SC) medium eller Selektiv syntetisk MINIMAL (SM) medium i stedet.
  3. Fortynne den stasjonære kulturen til en OD600 av 0,1 i 20 ml medium. Øk cellene ved 30 ° c mens du rister til OD600 når 0,5.
  4. Overfør den 20 mL kultur til et 50 mL sentrifugerør. Pellets cellene ved sentrifugering ved 665 x g i 3 min. Fjern supernatanten. Resuspend cellene i 5 mL friskt medium.
  5. Fix cellene ved å legge 550 μL av 37% formaldehyd til kulturen. Ruge ved romtemperatur i 15 min.
  6. Pellets cellene ved sentrifugering ved 665 x g i 3 min. Fjern supernatanten. Resuspend pellet i 1 mL ferskt tilberedte 4% paraformaldehyde i vaske buffer. Ruge i 45 min. ved romtemperatur.
  7. Under inkubasjons forbereder du diagnose lysbildene ved å legge til 100 μL av 0,01% Poly-L-lysin-løsning i hver brønn. Ruge lysbildene i 30 minutter ved romtemperatur.
  8. Etter 30 min, vaske bort overflødig Poly-L-lysin med ultrarent vann og la lysbildene lufttørke. De tørre lysbildene er klare til bruk.
  9. Vask celler to ganger med 1 mL vaske buffer. Utfør vasker ved sentrifugering av cellene ved 665 x g i 3 min. Fjern supernatanten og resuspend cellene i vaske buffer.
  10. Pellets cellene ved sentrifugering ved 665 x g i 3 min. Fjern supernatanten. Resuspend cellene i 1 mL 1,2 M Sorbitol i vaske buffer.
  11. Pellets cellene ved sentrifugering ved 665 x g i 3 min. Fjern supernatanten. Resuspend pellet i 250 μL av fersk tilberedt Lyticase løsning for å fordøye celle veggen. Ruge cellene i Lyticase-løsningen i 15 minutter ved 30 ° c mens du rister.
  12. Etter fordøyelsen, vaske celler 3x ved sentrifugering ved 665 x g i 3 min og fjerne supernatanten. Resuspend cellene i 250, μL av 1,2 M Sorbitol i vaske buffer.
    Merk: Fordi cellene er skjøre etter celle veggen fordøyelsen, resuspend dem veldig nøye for å ikke skade cellene.
  13. Tilsett 20 μL av resuspendert celler til Poly-L-lysin belagt lysbilder. Tillat dem å feste til lysbildene i 30 min. vask bort ikke-tilhenger celler ved å vaske brønnene 3x med 50 μL av vaske buffer.
  14. Permeabilize cellemembranen ved å vaske 3x med 50 μL av 1% Triton-X i vaske buffer.
    Merk: På dette punktet cellene er klar for nærhet ligation analysen protokollen som vil bli diskutert i § 4.

3. E. coli Cell forberedelse

  1. Forbered følgende materialer: PBS-T (140 mM NaCl, 2 mM KCl, 8 mM K2HPO4, 1,5 mm KH2PO4, 0,05% mellom-20), pH 7,4; Lysozyme løsning (2 mg/mL lysozyme, 25 mM Tris-HCl pH 8,0, 50 mM glukose, 10 mM EDTA); 0,0001% Poly-L-lysin løsning; 99% iskald metanol; 99% romtemperatur metanol; 99% aceton; 10-brønn diagnostiske lysbilder; et fuktig kammer (fremstilt som i trinn 1.1.1); vevs papir; og Coplin Slide-farging krukker.
  2. Vokse en overnatting kultur i Luria-Bertani (LB) medium ved 30 ° c mens risting.
  3. Fortynne den stasjonære kulturen til en OD600 av 0,02 i fersk lb medium. Vokse cellene ved 30 ° c mens risting til OD600 når 0,4 for log fase celler.
  4. Omtrent 15 min før cellene når en OD600 av 0,4, forberede Poly-L-lysin belagt lysbilder ved å legge til 100 μL av 0,0001% Poly-L-lysin til hver brønn. Ruge lysbildene i 30 minutter ved romtemperatur.
  5. Etter 30 min vaske bort overflødig Poly-L-lysin med ultrarent vann og la lysbildene lufttørke. De tørre lysbildene er klare til bruk.
  6. Når cellene når en OD600 på 0,4, overføring 1 ml av kulturen til en steril mikrosentrifugen tube og pellet celler ved 2 650 x g for 2 min.
  7. Resuspend celler i 50 μL av LB medium.
  8. Fix celler ved å legge 1 mL iskald 99% metanol. Bland veldig forsiktig for hånd. Ruge celler i 30 minutter ved-20 ° c.
  9. Etter fiksering tilsett 20 μL av cellene til Poly-L-lysin belagt lysbilder. La lysbildene lufttørke i 30 min.
  10. Tilsett 50 μL av ferskt forberedt lysozyme løsning på hver brønn for å fordøye celle veggen. Ruge i et fuktig kammer i 30 minutter ved 25 ° c.
  11. Fjern den lysozyme løsningen fra brønnene ved å legge til en vevs papir på kanten av brønnen. Vask lysbildene 3x i 100 mL av PBS-T. Utfør hver vask i en Coplin Slide-farging jar for 30 s, uten risting.
  12. Fjern vaske bufferen fra lysbildene ved å trykke på lysbildene på et papir.
  13. Permeabilize cellemembraner ved å tilsette 50 μL av 99% metanol i hver brønn. Ruge i 1 min ved romtemperatur.
  14. Fjern metanol ved å plassere en silkepapir til kanten av brønnen.
  15. Tilsett 50 μL av 99% aceton til hver brønn. Ruge i 1 min.
  16. Fjern overflødig aceton ved å plassere et silkepapir på kanten av brønnen. La lysbildene lufttørke. På dette punktet cellene er klar for nærhet ligation analysen protokollen som vil bli diskutert i § 4.

4. nærhet ligation analysen

  1. Forbered følgende materialer: blokkering buffer; En Fortynnings buffer for antistoff; Vaske buffer ' A ' – (10 mM Tris, 150 mM NaCl, 0,05% mellom-20) pH 7,4; Vaske buffer ' B ' – (200 mM Tris, 100 mM NaCl) pH 7,4; Anti-Rabbit sekundær antistoff pluss; Anti-Mouse sekundær antistoff MINUS; 5x ligation buffer; ligase; 5x forsterkning buffer (oransje: λex 554 NM; λEM 576 NM); polymerase ultrarent vann; og monterings medium som inneholder DAPI.
    Merk: de er også tilgjengelige i variantene Green (λex 495 NM; λEM 527 NM), rød (λex 594 NM; λEM 624 NM), FarRed (λex 644 NM; λEM 669 NM) eller Brightfield (pepperrot peroksidase (HRP) bøyd).
  2. Blokker cellene ved å legge til en dråpe blokkerings buffer i hver brønn. Ruge i 30 min ved 37 ° c i et fuktig kammer.
  3. Klargjør antistoff løsninger ved å fortynne lager antistoffer i antistoff Fortynnings buffer. For hver brønn 40 skal μL av antistoff oppløsning kreves.
  4. Fjern blokkerings bufferen ved å plassere et silkepapir på kanten av brønnen. Tilsett 40 μL av antistoff fortynnet i antistoff Fortynnings buffer i hver brønn. Ruge for 60 min i et fuktig kammer ved 37 ° c eller over natten ved 4 ° c.
  5. Fjern antistoff oppløsning fra brønnene ved å plassere et papir på kanten av brønnen. Vask lysbildene 2x i 100 mL vaske buffer ' A ' i en Coplin Slide-farging jar i 5 min, uten risting.
  6. Under vaske trinnene, fortynne 5x sekundære antistoff sonder, anti-kanin PLUS & anti-mus MINUS (arten spesifisitet av sonder avhenger av primære antistoffer brukes), i antistoff fortynning buffer. Forbered 40 μL av antistoff oppløsning per brønn.
  7. Tilsett 40 μL av sekundær antistoff løsning på hver brønn. Ruge for 60 min ved 37 ° c i et fuktig kammer.
  8. Fjern sekundær antistoff løsning fra brønnene ved å plassere en vevs papir på kanten av brønnen. Vask lysbildene 2x i 100 mL vaske buffer ' A ' i en Coplin Slide-farging jar i 5 min, uten risting.
  9. Under vasken tilberedes 40 μL av ligation blanding per brønn, ved å blande 8 μL av 5x ligation buffer, 31 μL av ultrarent vann og 1 μL av ligase.
  10. Tilsett 40 μL av ligation blanding til hver brønn. Ruge i 30 min ved 37 ° c i et fuktig kammer.
  11. Fjern ligation blandingen fra brønnene ved å plassere et silkepapir på kanten av brønnen. Vask lysbildene 2x i 100 mL vaske buffer ' A ' i en Coplin Slide-farging jar for 2 min, uten risting.
  12. Under vasken tilberedes 40 μL av forsterknings blanding per brønn, ved å blande 8 μL av 5x forsterknings løsning, 31,5 μL av ultrarent vann og 0,5 μL av polymerase.
    Merk: Den 5x forsterkning inneholder fluorescerende sonder. Beskytt denne blandingen fra lys. Du bør også beskytte lysbildene mot lys under hvert av de følgende trinnene. Hvis du bruker gjennomskinnelig Coplin Slide-farging krukker og fuktige kamre, pakk dem i aluminiumsfolie.
  13. Tilsett 40 μL av forsterknings blanding per brønn. Ruge for 100 min ved 37 ° c i et fuktig kammer.
  14. Fjern forsterknings blandingen fra brønnene. Vask lysbildene 2x i 100 mL vaske buffer ' B ' i en Coplin Slide-farging jar for 10 min uten risting.
  15. Vask lysbilder i 100 mL vaske buffer ' B ' fortynnet 1:100 i ultrarent vann i en Coplin Slide-farging jar for 30 s.
  16. Tilsett 20 μL av DAPI som inneholder monterings medium per brønn til lysbildene. Lukk lysbilder med en dekkglass og forsegle lysbilder med neglelakk.
  17. Hvis bildebehandling, umiddelbart ruge DAPI som inneholder festemiddel i 10 – 15 min, mens beskyttet mot lys. Hvis ikke, Oppbevar lysbildene ved-20 ° c i opptil 1 uke, beskyttet mot lys.

5. oppdagelse

  1. Bruk konfokalmikroskopi mikroskopi å erverve bilder av HeLa, S. cerevisiae og E. coli celler med 20x/0.8 na, 63x/1.4 na og 100-/1.4 na plan Apochromat mål, henholdsvis. Opphisse DNA-farget DAPI med en 405 NM pulserende Diode Laser. For PLA signal (for denne studien) opphisse med en 561 NM Solid-State laser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Våre tidligere in vitro-studier med renset proteiner avslørte at en undergruppe av menneskelig klasse A og klasse B JDPs form forbigående blandet klasse JDP komplekser for effektivt å målrette et bredt spekter av aggregerte proteiner og muligens lette monteringen av Hsp70-baserte protein disaggregases7. Vi sysselsatte PLA å avgjøre om blandet klasse (A + B) JDP komplekser forekomme i humane livmorhalskreft celler (HeLa). Human JDPs DNAJA2 (klasse A) og DNAJB1 (klasse B) var målrettet med svært spesifikke primære antistoffer og sekundære PLA sonder (figur 2a-C). Utseendet av røde fluorescerende punctae indikerte tilstedeværelsen av blandet klasse DNAJA2 og DNAJB1 komplekser i HeLa celler (figur 2C) bekrefter våre tidligere biokjemiske funn7. Hver punctum representerer en individuell protein interaksjon hendelse i HeLa cellen stoffer/nucleus.

Forrige biokjemiske resultater Hentet fra Förster resonans energi overføring (bånd), som oppdager protein interaksjoner som en avlesning av mengden energi overføres fra en spent donor fluoroforen knyttet til ett protein til en passende Acceptor fluoroforen festet til det andre proteinet, indikerte at tilsvarende blandet klasse komplekser kan også oppstå mellom gjær JDPs, in vitro8. Bekrefter våre biokjemiske funn, observerte vi dannelsen av blandede klasse komplekser mellom Ydj1 (klasse A) og Sis1 (klasse B) i encellede eukaryote S. cerevisiae (Baker gjær) celler med PLA (figur 2F). I gjær, på grunn av sin lille Cellestørrelse og Koalesens av flere punctae, de enkelte fluorescerende prikker generert av PLA kan ofte være mindre gjenkjennelig. En betydelig reduksjon i fluorescerende punctae formasjon ble observert etter knockout eller knockdown av samspill JDPs i både menneskelige og gjærceller8, som demonstrerer den høye spesifisitet av PLA i å fange disse co-Anstandsdame komplekser i ulike celletyper. I motsetning til sine eukaryote kolleger, prokaryote (E. coli) JDPs manglet evnen til å danne blandet klasse JDP komplekser og funksjonelt samarbeide for å øke protein Disaggregation, in vitro8. I samråd med den biokjemiske analyse, vi ikke observere blandet klasse JDP kompleks formasjon mellom bakteriell DnaJ-YFP (klasse A) og CbpA-mCherry (klasse B), den eneste JDPs i E. coli (figur 2i). Men vår PLA oppsett var i stand til å fange opp andre Anstandsdame forsamlinger som involverer de to JDPs. For eksempel har vi oppdaget Anstandsdame komplekser mellom DnaJ-YFP og DnaK (bakteriell Hsp70) (figur 2L) og CbpA-MCherry og DnaK8 (data ikke vist). Disse to bakterielle Anstandsdame komplekser er omfattende karakterisert både in vitro og in vivo8,11,12 og dermed bekrefter våre PLA resultater. Sammen, disse observasjonene demonstrere evne til PLA å robust fange midlertidig dannet Anstandsdame machineries i encellede/flercellede eukaryote og prokaryote celler. De tekniske kontrollene mangler en primær antistoff mot en av de samspill JDPs/chaperones, men inneholder både mus og kanin avledet sekundære PLA sonder, viste liten eller ingen bakgrunn fluorescens signal (figur 2a, B, D, E, G, H, J, K) indikerer en mangel på falsk positiv signal forsterkning i vårt eksperimentelle oppsett.

Figure 1
Figur 1: skjematisk fremstilling av de kronologisk trinnene i nærhets ligation analysen. (1) kompleks mellom protein A og protein B. (2) binding av primær (1 °) antistoffer (grønn og lys brun) til proteiner A og B. De to primære Antistoffene må heves i forskjellige verts arter (f. eks mus, kanin eller geit). (3) primære antistoffer er anerkjent av arter-spesifikke sekundære (2 °) antistoffer covalently festet med DNA oligo koder (PLA sonder). (4) når proteiner A og B er i komplekse, er de bundne PLA-sonder i umiddelbar nærhet for å lette DNA-oligos til å hybridize med kontakt DNA-tråder, noe som resulterer i dannelsen av en sirkulær DNA-molekyl. Deretter Letter en DNA ligase sammenføyning av DNA-tråder sammen ved katalyserende dannelsen av en phosphodiester obligasjon. (5) initiering av Rolling Circle forsterkning (RCA) av det sirkulære DNA-molekylet ved en bakteriell DNA-polymerase ved 37 ° C. RCA reaksjonen er primet av en av de antistoff-bøyd DNA oligo koder. (6) generering av en enkelt-strandet concatemeric DNA-molekyl festet til en av de sekundære antistoffer. (7) hybridisering av fluorescensmerkete-merket komplementære oligonukleotid sonder til en unik repeterende sekvens i det concatemeric DNA-molekylet. Etter hybridisering trinnet, concatemeric DNA-molekylet kan bli sett på som en lys fluorescerende prikk på plasseringen av målrettede protein kompleks i faste celler. Bunn betegner de prokaryote og eukaryote celle typene som PLA-teknikken gjelder for. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2. Molekylær Anstandsdame forsamlinger tatt av PLA i prokaryote og eukaryote celler. (A-C) påvisning av blandet klasse JDP KOMPLEKSER dannet mellom DNAJA2 (klasse A) og DNAJB1 (klasse B) i menneskets livmorhalskreft cellelinje HeLa. PLA utført med (A) anti-DNAJA2 antistoff alene (negativ teknisk kontroll); (B) anti-DNAJB1 antistoff alene (negativ teknisk kontroll); (C) anti-DNAJB1 og anti-DNAJA2 antistoffer sammen. Utseendet til flere fluorescerende prikker i panel C (positivt signal) indikerer tilstedeværelsen av protein komplekser DANNET mellom DNAJA2 og DNAJB1. Hver rød fluorescerende prikk/punctum representerer en enkelt interaksjon. Kjerner (DNA) farget med DAPI (cyan). (D-F) Påvisning av blandet klasse JDP komplekser dannet mellom Ydj1 (klasse A) og Sis1 (klasse B) i S. cerevisiae celler. (D) PLA utført med anti-Ydj1 antistoff alene (negativ teknisk kontroll); (E) PLA utført med anti-Sis1 antistoff alene (negativ teknisk kontroll); (F) PLA utført med anti-Ydj1 og anti-Sis1 antistoffer sammen. Den positive fluorescerende signal betegner tilstedeværelsen av Ydj1 og Sis1 komplekser i S. cerevisiae. Gjær kjerner beiset med DAPI (cyan). (G-L) Påvisning av Anstandsdame komplekser dannet mellom prokaryote Hsp70 (DnaK) og JDPs (DnaJ og CbpA) i E. coli celler. På grunn av mangelen på spesifikke primære antistoffer mot prokaryote JDPs, E. coli DnaJ (klasse A) og CbpA (klasse B) ble merket med YFP og mCherry, henholdsvis. (G, J) PLA utført med anti-YFP alene (negativ teknisk kontroll); (H) PLA utført med anti-mCherry alene (negativ teknisk kontroll). (I) PLA utført med anti-YFP og anti-mCherry antistoff. Mangelen på fluorescerende punkt formasjon indikerer ingen kompleks dannelse mellom DnaJ og CbpA. (K) PLA utført med anti-DnaK antistoff alene (negativ teknisk kontroll). (L) PLA utført med anti-YFP og anti-DnaK antistoffer sammen. Det positive fluorescerende signalet indikerer kompleks dannelse mellom DnaK og DnaJ. Bakteriell DNA farget med DAPI (cyan). I tillegg til å inneholde ett enkelt primært antistoff, ble alle de negative tekniske kontrollene utført i nærvær av de respektive sekundære PLA-sonder. Vektstenger = 10 μm.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Co-immunutfelling og co-lokalisering basert tilnærminger har blitt brukt som langvarige metoder for å karakterisere protein samler. Påvisning av midlertidig dannet spesifikke Anstandsdame komplekser er en stor utfordring med slike konvensjonelle metoder, og som et resultat, tidligere funn er i stor grad begrenset til kvalitative tolkninger. Cellen lyse-baserte co-immunutfelling teknikker krever ofte kryss-linking å stabilisere protein-protein interaksjoner. Cellelyse øker risikoen for å forstyrre midlertidig dannet Anstandsdame komplekser, mens kryss-Linking kan innføre ikke-innfødte interaksjoner, spesielt drevet av den iboende "klebrige" av de fleste chaperones. Når analysere Hsp70 Anstandsdame systemet ved hjelp av co-immunutfelling, potensielle gjenstander kan oppstå fra (a) høye uttrykk nivåer av Anstandsdame og (b) løselighet problemer knyttet til membran eller protein samlet bundet Anstandsdame machineries. Dessuten gir co-immunutfelling teknikker ingen informasjon om mobilnettet lokalisering av fanget protein forsamlinger, som kan være viktig for opptegning de tilhørende funksjoner. Ulempene med å bruke co-immunutfelling teknikker er noe redusert i co-lokalisering-baserte tilnærminger som bevarer protein lokalisering informasjon. Men co-lokalisering av to eller flere proteiner kan indikere enten direkte protein-protein forening eller partisjonering av proteiner i samme microdomain i cellene. Derfor co-lokalisering analyse er i beste fall spekulativ i forutsi protein interaksjoner og mangler noen nærhet verdi. På grunn av bulk og vilkårlig påvisning av målrettede proteiner, er teknikken svært begrenset i å studere spesifikke protein forsamlinger i celler. Dette er spesielt problematisk når målrettede proteinet (e) kan, parallelt, danne et bredt spekter av distinkte protein forsamlinger som i tilfellet med Hsp70 Anstandsdame systemet. Sammenlignet med disse konvensjonelle metoder, er PLA en mer raffinert in situ teknikk utviklet for å robust oppdage og kvantifisere innfødte protein foreninger i celler med bevart protein lokalisering informasjon. Et protein interaksjon er avslørt av denne analysen basert på nærhet (ca 10-30 NM) mellom målrettede proteiner. PLA er "tunable" i at rekkevidden av nærhet avstand kan reduseres for å få en strengere avlesning av (a) redusere lengden på oligonukleotid koder festet til PLA sonder og/eller (b) bøye kodene direkte til primære antistoffer. Forsiktighet bør utvises når tolke en positiv PLA signal. Ideelt sett bør en protein interaksjon bekreftes med to eller flere uavhengige metoder. Intensiteten av fluorescerende signal i PLA er ikke så deterministically knyttet til protein Cluster størrelse eller skille avstand mellom samspill proteiner som er tilfellet med bånd. Imidlertid har PLA en høy grad av spesifisitet og følsomhet, og kan også brukes til å analysere svært lave rikelig proteiner som vekstfaktorer eller cytokiner og deres interaksjoner i sjeldne celletyper eller kliniske eksemplarer13.

Den Hsp70 Anstandsdame partnere med flere co-chaperones (f. eks, JDPs og NEFs) under sin mobilnettet levetid14 til å drive distinkte biologiske funksjoner. Det store antallet sannsynlige Hsp70-JDP-NEF-maskin konfigurasjoner og deres dynamiske adferd i celler har i stor grad hindret en detaljert forståelse av de spesifikke rollene til disse Anstandsdame maskinene. Biological verktøy det tillate selektiv tracing av adskilt Hsp70 forsamlinger er, derfor, krevde å analysere det total ledningene av denne Anstandsdame nettverk inne celler. Midlertidig dannet JDP-JDP og JDP-Hsp70 Anstandsdame komplekser7 ble effektivt fanget i celler med PLA, noe som indikerer at denne teknikken er egnet for å studere molekylær interaksjon med høy dissosiasjon konstanter (f. eks ≫ 3 μM Kd ). Skjønt, inne det aktuelle arbeide, det analysen er opprinnelig anvendt som "ja" eller "nei" type binær indikatoren for Anstandsdame vekselvirkningen, det brukernes kanne ansette denne teknikk å få halv-kvantitativ readouts av graden av vekselvirkningen av digital opptellingen det fluorescens signal intensitet15. På grunn av den ikke-lineære forsterkningen til PLA-signalet, bør det utvises forsiktighet ved tolking av PLA-data på en kvantitativ måte16. Til tross for de nevnte fordelene, har denne metoden visse begrensninger. En av de viktigste ulempene med PLA er at analysen krever celle fiksering dermed i stor grad begrense sin evne til å løse timelige dynamikken i protein kompleks i levende celler. Til sammenligning, in vivo bånd17 eller bioluminesens resonans Energy Transfer (BRET)18 tillater overvåking av lignende protein interaksjoner i en spatio-Temporal måte i levende celler med relativt mindre nærhet verdier (< 10 NM). I motsetning til PLA, et bånd signal viser en streng lineær korrelasjon med protein uttrykk nivåer16 gjør bånd gullstandarden i kvantitativ analyse av protein interaksjoner. Men i motsetning bånd avhengighet av den gåtefulle orientering faktor ĸ2, er PLA ikke påvirket av ORIENTERINGEN av PLA sonder, noe som øker sannsynligheten for å fange et protein kompleks19. Når det gjelder brukervennlighet, bånd og BRET krever unik kompetanse dermed generelt begrense tilgjengeligheten av disse metodene til bredere forskning samfunnet. Videre, begge disse teknikkene krever modifisering av samspill proteiner ved å feste klumpete selvlysende/fluorescerende protein koder som potensielt kan forstyrre protein funksjon og kompleks formasjon.

Følgende trinn (1-4) krever nøye overveielse for vellykket gjennomføring av PLA i celler. (1) antistoff valg: det kommersielt tilgjengelige PLA-settet er kompatibelt med primære antistoffer som er hevet mot mus, kanin og geit. PLA krever svært spesifikke primære antistoffer som ikke binder seg til av mål. I tillegg er det viktig å velge primære antistoffer som er kompatible med applikasjoner som immunhistokjemi (IHC), enzym-koblet immunosorbentanalyse-analysen (ELISA), og/eller immunutfelling (IP) for å sikre at Antistoffene kan gjenkjenne antigen amino acid sekvenser eksponert på overflaten av foldet proteiner. Før bruk, testing av alle primære antistoffer for spesifisitet deres er sterkt anbefalt. Dette kan utføres via Western Blot analyse av hele cellen lysater. I tilfeller der målrettede proteiner har homologs med små variasjoner i størrelse og sekvens likhet (for eksempel Hsp70 og JDP paralogs), kan spesifisitet av Antistoffene testes med Gen knockdown/knockout tilnærminger eller ved undersøkelser mot renset homologs til å utelukke potensielle kors-anerkjennelse. Hvis egnede antistoffer ikke er tilgjengelige, kan de målrettede proteinene merkes med epitopes som har antistoffer av akseptabel kvalitet (Figur 2F). (2) fiksering og permeabilization av celler: en behandling av 4% paraformaldehyde og 0,1-0,5% Triton-X100 kan brukes til å fikse og permeabilize celler, henholdsvis. Bruken av 4% paraformaldehyde er en bedre behandling for å bevare protein-protein interaksjoner og cellulære Ultrastructure sammenlignet med bindemiddel forhold sysselsetter 99% metanol20,21,22. Fikse celler med 99% metanol, men gir mindre cytoplasmatiske bakgrunnen flekker, og kanskje er mer egnet for spesielle tilfeller som påvisning av cytoskeleton tilhørende protein forsamlinger21,22. Effektiv permeabilization av både plasma membranen og organelle membraner for å øke antistoff tilgjengeligheten kan oppnås med ikke-ioniske overflateaktivt middel Triton-X100. Triton-X100 kan imidlertid ikke-spesifikt fjerne proteiner fra plasma membranen23,24. Derfor, for analyse av protein forsamlinger forbundet med cellulære membraner, alternative vaskemidler som saponin eller digitonin som mål steroler til permeabilize membraner kan påføres21,22,25. (3) forstyrrelse av celle veggen: før membran permeabilization, er et ekstra trinn som involverer spesifikke lytisk enzymer nødvendig for å øke penetrability av antistoffer i celletyper med celle vegger (f. eks sopp, plante og bakterielle celler). For eksempel har vi benyttet lyticase, som forringer β-Glukan for å forstyrre celle veggen iS. cerevisiae26. På samme måte erE. colicelle veggen ble forstyrret ved hjelp lysozyme, et enzym som mål peptidoglycans27,28. Celle veggen sammensetning og lytisk enzym følsomhet varierer med ulike vekstforhold26og kultur samløpet29,30. Derfor kan konsentrasjonen av lytisk enzymer og fordøyelsen ganger variere og forsiktighet må tas for å hindre over-eller underdigestion av celler. Etter at celle veggen fordøyelsen, cellene er relativt skjøre og krever trengsel agenter som Sorbitol for dem å forbli intakt under vaske trinnene. (4) DNA-forsterkning: DNA-ligation og den rullende sirkelen PCR reaksjons trinnene er følsomme for temperatur og luftfuktighet svingninger. For å sikre robust DNA-forsterkning og reproduserbarhet for analysen, må disse reaksjonene utføres ved 37 ° c i et luft fuktighets kammer. Viktigere, bør proccessed cellene hindres fra å tørke ut mens du utfører analysen for å unngå ikke-spesifikke antistoff binding og DNA forsterkning hendelser som kan føre til økt i bakgrunnen signal.

Alle ting vurderes, gjennomføringen av denne analysen ikke krever unik ekspertise og sofistikert instrumentering. Vellykket overvåking av JDP-JDP og JDP-Hsp70 Anstandsdame komplekser illustrere den potensielle anvendelsen av denne teknikken til å spore midlertidig dannet protein forsamlinger i alle celletyper. Vår implementering av teknikken i gjær og bakterier øker betydelig anvendelsen av PLA å studere ulike biologiske prosesser formidlet av distinkte protein forsamlinger i et bredt spekter av organismer. Videre fremhever vårt arbeid PLA som et lovende nytt protein interaksjons verktøy for å studere evolusjonære forandringer som forekommer på molekylær nivå på tvers av arter8.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

NBN støttes av en spesiell rekruttering Grant fra Monash University Faculty of Medicine Nursing and Health Sciences med midler fra staten regjeringen i Victoria og den australske regjeringen. Vi takker Bernd Bukau (ZMBH, Heidelberg University, Tyskland) og Harm H. Kampinga (Institutt for biomedisinsk vitenskap av celler & Systems, Universitetet i Groningen, Nederland) for deres uvurderlig støtte og deling av reagenser, Holger Lorenz (ZMBH Imaging Facility, Universitetet i Heidelberg, Tyskland) for sin støtte med konfokalmikroskopi mikroskopi og bildebehandling, og Claire Hirst (ARMI, Monash University, Australia) for kritisk lesning av manuskriptet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
37% Formaldehyde Merck 103999
Acetone Sigma-Aldrich 32201
anti-DNAJA2 antibody Abcam ab157216
anti-DNAJB1 Antibody Enzo Life Sciences ADI-SPA-450
anti-DnaK antibody In house
anti-mCherry antibody Abcam ab125096
anti-Sis1 Antibody Cosmo Bio Corp COP-080051
anti-Ydj1 antibody StressMarq Biosciences  SMC-150,
anti-YFP antibody In house
Coplin slide-staining jar Sigma-Aldrich S5516
Diagnostic slides Marienfeld 1216530
DMEM Thermo-Fischer 31966021
DuoLink In Situ Detection Reagents Orange Sigma-Aldrich DUO92007
DuoLink In Situ Mounting Medium + DAPI Sigma-Aldrich DUO82040
DuoLink In Situ PLA Probe Anti-Mouse MINUS Sigma-Aldrich DUO92004
DuoLink In Situ PLA Probe Anti-Rabbit PLUS Sigma-Aldrich DUO92002
DuoLink In Situ Wash Buffers, Fluorescence Sigma-Aldrich DUO82049
Fetal Calf Serum Thermo-Fischer 10082147
Lysozyme Sigma-Aldrich 62971
Methanol Sigma-Aldrich 32213
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148
Penicillin/Streptomycin Thermo-Fischer 15070063
Poly-L-Lysine Sigma-Aldrich P47-07
Sorbitol Sigma-Aldrich S7547
Triton-X100 Merck 108643
Trypsin Thermo-Fischer 25300096
Tween-20 Sigma-Aldrich P1379
Zymolase 100T / / Lyticase United States Biological Z1004

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Soderberg, O., et al. Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation. Nature Methods. 3 (12), 995-1000 (2006).
  2. Weibrecht, I., et al. Proximity ligation assays: a recent addition to the proteomics toolbox. Expert Review of Proteomics. 7 (3), 401-409 (2010).
  3. Mayer, M. P., Gierasch, L. M. Recent advances in the structural and mechanistic aspects of Hsp70 molecular chaperones. Journal of Biological Chemistry. 294 (6), 2085-2097 (2019).
  4. Kampinga, H. H., Craig, E. A. The HSP70 chaperone machinery: J proteins as drivers of functional specificity. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11 (8), 579-592 (2010).
  5. Nillegoda, N. B., Bukau, B. Metazoan Hsp70-based protein disaggregases: emergence and mechanisms. Frontiers in Molecular Biosciences. 2, (2015).
  6. Bracher, A., Verghese, J. The nucleotide exchange factors of Hsp70 molecular chaperones. Frontiers in Molecular Biosciences. 2, (2015).
  7. Nillegoda, N. B., et al. Crucial HSP70 co-chaperone complex unlocks metazoan protein disaggregation. Nature. 524 (7564), 247-251 (2015).
  8. Nillegoda, N. B., et al. Evolution of an intricate J-protein network driving protein disaggregation in eukaryotes. Elife. 6, (2017).
  9. Kirstein, J., et al. In vivo properties of the disaggregase function of J-proteins and Hsc70 in Caenorhabditis elegans stress and aging. Aging Cell. 16 (6), 1414-1424 (2017).
  10. Nillegoda, N. B., Wentink, A. S., Bukau, B. Protein Disaggregation in multicellular organisms. Trends in Biochemical Sciences. 43 (4), 285-300 (2018).
  11. Chae, C., Sharma, S., Hoskins, J. R., Wickner, S. CbpA, a DnaJ homolog, is a DnaK co-chaperone, and its activity is modulated by CbpM. Journal of Biological Chemistry. 279 (32), 33147-33153 (2004).
  12. Kityk, R., Kopp, J., Mayer, M. P. Molecular Mechanism of J-domain-Triggered ATP Hydrolysis by Hsp70 Chaperones. Molecular Cell. 69 (2), 227-237 (2018).
  13. Söderberg, O., et al. Characterizing proteins and their interactions in cells and tissues using the in situ proximity ligation assay. Methods. 45 (3), 227-232 (2008).
  14. Benschop, J. J., et al. A consensus of core protein complex compositions for Saccharomyces cerevisiae. Molecular Cell. 38 (6), 916-928 (2010).
  15. Jung, J., et al. Quantifying RNA-protein interactions in situ using modified-MTRIPs and proximity ligation. Nucleic Acids Research. 41 (1), (2013).
  16. Mocanu, M. M., Váradi, T., Szöllosi, J., Nagy, P. Comparative analysis of fluorescence resonance energy transfer (FRET) and proximity ligation assay (PLA). Proteomics. 11 (10), 2063-2070 (2011).
  17. Sekar, R. B., Periasamy, A. Fluorescence resonance energy transfer (FRET) microscopy imaging of live cell protein localizations. Journal of Cell Biology. 160 (5), 629-633 (2003).
  18. Deriziotis, P., Graham, S. A., Estruch, S. B., Fisher, S. E. Investigating protein-protein interactions in live cells using bioluminescence resonance energy transfer. Journal of Visualized Experiments. 87, (2014).
  19. Nagy, P., Szöllosi, J. Proximity or no proximity: that is the question – but the answer is more complex. Cytometry. 75 (10), 813-815 (2009).
  20. Hoetelmans, R. W., et al. Effects of acetone, methanol, or paraformaldehyde on cellular structure, visualized by reflection contrast microscopy and transmission and scanning electron microscopy. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 9 (4), 346-351 (2001).
  21. Schnell, U., Dijk, F., Sjollema, K. A., Giepmans, B. N. Immunolabeling artifacts and the need for live-cell imaging. Nature Methods. 9 (2), 152-158 (2012).
  22. Stadler, C., Skogs, M., Brismar, H., Uhlen, M., Lundberg, E. A single fixation protocol for proteome-wide immunofluorescence localization studies. Journal of Proteomics. 73 (6), 1067-1078 (2010).
  23. Goldenthal, K. L., Hedman, K., Chen, J. W., August, J. T., Willingham, M. C. Postfixation detergent treatment for immunofluorescence suppresses localization of some integral membrane proteins. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 33 (8), 813-820 (1985).
  24. Schrader, M., Almeida, M., Grille, S. Postfixation detergent treatment liberates the membrane modelling protein Pex11beta from peroxisomal membranes. Histochemistry & Cell Biology. 138 (3), 541-547 (2012).
  25. Willingham, M. C., Yamada, S. S., Pastan, I. Ultrastructural antibody localization of alpha2-macroglobulin in membrane-limited vesicles in cultured cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 75 (9), 4359-4363 (1978).
  26. Aguilar-Uscanga, B., Francois, J. M. A study of the yeast cell wall composition and structure in response to growth conditions and mode of cultivation. Letters in Applied Microbiology. 37 (3), 268-274 (2003).
  27. Romaniuk, J. A., Cegelski, L. Bacterial cell wall composition and the influence of antibiotics by cell-wall and whole-cell NMR. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 370, 1679 (2015).
  28. Salazar, O., Asenjo, J. A. Enzymatic lysis of microbial cells. Biotechnology Letters. 29 (7), 985-994 (2007).
  29. Cunningham, A. F., Spreadbury, C. L. Mycobacterial stationary phase induced by low oxygen tension: cell wall thickening and localization of the 16-kilodalton alpha-crystallin homolog. Journal of Bacteriology. 180 (4), 801-808 (1998).
  30. Werner-Washburne, M., Braun, E., Johnston, G. C., Singer, R. A. Stationary phase in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Microbiological Reviews. 57 (2), 383-401 (1993).

Tags

Denne måneden i JoVE nærhet ligation analysen Anstandsdame J-domene protein Hsp70 menneskelige bakterier gjær e. coli S. cerevisiae protein interaksjon proteostasis
In situ overvåking av midlertidig dannet Molecular Anstandsdame forsamlinger i bakterier, gjær, og menneskelige celler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Alberts, N., Mathangasinghe, Y.,… More

Alberts, N., Mathangasinghe, Y., Nillegoda, N. B. In Situ Monitoring of Transiently Formed Molecular Chaperone Assemblies in Bacteria, Yeast, and Human Cells. J. Vis. Exp. (151), e60172, doi:10.3791/60172 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter