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Biology

बैक्टीरिया, खमीर, और मानव कोशिकाओं में क्षणिक रूप से गठित आणविक Chaperone विधानसभाओं की सीटू निगरानी में

Published: September 2, 2019 doi: 10.3791/60172
Automatic Translation
*1, *2, 3
1Department of Biomedical Sciences of Cells & Systems, University of Groningen, 2Department of Anatomy, Faculty of Medicine, University of Colombo, 3Australian Regenerative Medicine Institute (ARMI), Monash University
* These authors contributed equally

Summary

Cognate जम्मू डोमेन प्रोटीन Hsp70 chaperone के साथ सहयोग करने के लिए प्रोटीन तह से गिरावट को लेकर जैविक प्रक्रियाओं के असंख्य में सहायता करते हैं. यहाँ, हम एक situ निकटता लिगेशन परख है, जो जीवाणु, खमीर और मानव कोशिकाओं में इन क्षणिक रूप से गठित chaperone मशीनरी की निगरानी की अनुमति देता है वर्णन.

Abstract

जे-डोमेन प्रोटीन (जेडीपी) यूकैरियोटिक कोशिकाओं में सबसे बड़ा और सबसे विविध सह-चैपरोन परिवार बनाते हैं। हाल के निष्कर्षों से पता चलता है कि जेडीपी परिवार के विशिष्ट सदस्य यूकैरियोट में क्षणिक हेटेरोकॉम्प्लेक्स बना सकते हैं, जो 70 केडीए हीट शॉक प्रोटीन (Hsp70) चैपरोन आधारित प्रोटीन डिस्ग्रेसेस के लिए ठीक धुन सब्सट्रेट चयन कर सकते हैं। JDP परिसरों तीव्र / पुरानी तनाव प्रेरित एकत्रित प्रोटीन को लक्षित और संभवतः प्रोटीन समुच्चय की सतह के लिए कई Hsp70s भर्ती द्वारा disaggregases इकट्ठा करने में मदद. इन शारीरिक रूप से बातचीत JDPs द्वारा गठित प्रोटीन गुणवत्ता नियंत्रण (PQC) नेटवर्क की हद तक काफी हद तक vivo में uncharacterized रहता है. यहाँ, हम एक माइक्रोस्कोपी का वर्णन करें- सीटू प्रोटीन इंटरैक्शन परख का नाम निकटता लिगेशन परख (पीएलए) है, जो यूकैरियोटिक कोशिकाओं के अलग-अलग सेलुलर डिब्बों में इन क्षणिक रूप से गठित चैपरोन परिसरों को मजबूत रूप से कैप्चर करने में सक्षम है। हमारा काम मानव कोशिकाओं से पीएलए के रोजगार का विस्तार खमीर (Saccharomyces cerevisiae) और बैक्टीरिया (Escherichia कोलाई), इस प्रकार दोनों में क्षणिक रूप से गठित प्रोटीन विधानसभाओं की गतिशीलता की निगरानी के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण प्रदान प्रोकैरियोटिक और यूकैरियोटिक कोशिकाएं।

Introduction

सेलुलर interactomes की हमारी अधूरी समझ के कारण जीनोमिक जानकारी का एक विशाल राशि uninterpretable रहता है. पारंपरिक प्रोटीन प्रोटीन बातचीत का पता लगाने के तरीके जैसे प्रोटीन सह-प्रतिरक्षा के साथ/बिना रासायनिक क्रॉस-लिंकिंग और प्रोटीन सह-स्थानीयकरण, हालांकि व्यापक रूप से इस्तेमाल किया जाता है, नुकसान की एक श्रृंखला पैदा करता है। कुछ मुख्य नुकसानों में बातचीत के खराब परिमाणीकरण और गैर-देशी बाध्यकारी घटनाओं की संभावित शुरूआत शामिल है। इसकी तुलना में, उभरती निकटता आधारित तकनीक कोशिकाओं में प्रोटीन बातचीत पर कब्जा करने के लिए एक विकल्प और एक शक्तिशाली दृष्टिकोण प्रदान करते हैं. निकटता लिगेशन परख (पीएलए)1,अब एक मालिकाना किट के रूप में उपलब्ध है, बातचीत subunits की निकटता के आधार पर विशेष रूप से प्रोटीन परिसरों को लक्षित करने के लिए एंटीबॉडी कार्यरत हैं।

पीएलए लक्षित प्रोटीन परिसर की सतह पर छोटे डीएनए टैग (पीएलए जांच) के साथ प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी से मिलकर एक पाड़ के गठन के द्वारा शुरू की है (चित्र1, कदम 1-3)। अगला, डीएनए टैग की निकटता से निर्धारित, एक परिपत्र डीएनए अणु संबंधक oligonucleotides के साथ संकरीकरण के माध्यम से उत्पन्न होता है (चित्र 1, चरण 4). परिपत्र डीएनए का गठन एक डीएनए लिगिंग चरण द्वारा पूरा किया जाता है। डीएनए के नवगठित परिपत्र टुकड़ा बाद रोलिंग सर्कल प्रवर्धन (आरसीए) आधारित polymerase श्रृंखला प्रतिक्रिया (पीसीआर) के लिए एक टेम्पलेट के रूप में कार्य करता है एक समयुग्मित ओलिगोन्यूक्लिओटाइड टैग में से एक द्वारा primed. यह एंटीबॉडी पाड़ के माध्यम से प्रोटीन परिसर से जुड़ी एक एकल-संक्षिप्त concatemeric डीएनए अणु उत्पन्न करता है (चित्र 1, चरण 6). संक्रांतिीय डीएनए अणु को फ्लोरोसेंटी लेबल वाले ओलिगोन्यूक्लिओटाइडों का उपयोग करके विरूपित किया जाता है जो प्रवर्धित डीएनए में बिखरे हुए अनेक अद्वितीय दृश्यों को संकरित करते हैं (चित्र 1, चरण 7 )2. उत्पन्न पीएलए संकेत, जो एक फ्लोरोसेंट डॉट के रूप में प्रकट होता है (चित्र 1, चरण 7), सेल में लक्षित प्रोटीन परिसर के स्थान से मेल खाती है। एक परिणाम के रूप में, परख उच्च स्थानिक सटीकता के साथ प्रोटीन परिसरों का पता लगा सकता है. यह तकनीक केवल प्रोटीन इंटरैक्शन पर कब्जा करने तक ही सीमित नहीं है, बल्कि इसका उपयोग उच्च संवेदनशीलता वाले प्रोटीन ों पर एकल अणुओं या प्रोटीन संशोधनों का पता लगाने के लिए भी किया जा सकताहै।

Hsp70 गृह व्यवस्था और तनाव से जुड़े कार्यों की एक सरणी में भाग लेने के द्वारा सेलुलर प्रोटीन homeostasis बनाए रखने के लिए मौलिक रूप से महत्वपूर्ण एक अत्यधिक बहुमुखी chaperone प्रणाली रूपों. Hsp70 chaperone प्रणाली के हाउसकीपिंग गतिविधियों de नोवो प्रोटीन तह, सेलुलर झिल्ली भर में प्रोटीन स्थानांतरण, विधानसभा और प्रोटीन परिसरों के disassembly, प्रोटीन गतिविधि के विनियमन और विभिन्न प्रोटीन तह जोड़ने / गुणवत्ता नियंत्रण मशीनरी3| वही चैपरोन प्रणाली भी गलत गुना/प्रकट प्रोटीन को पुन: गुना करती है, प्रोटीन एकत्रीकरण को रोकती है, प्रोटीन वियोग को बढ़ावा देती है और सेलुलर प्रोटीज़ के साथ सहयोग करती है ताकि सेलुलर मरम्मत के बाद सेलुलर मरम्मत की सुविधा के लिए घातक रूप से गलत गुना/क्षतिग्रस्त प्रोटीन को नीचा किया जा सके। प्रोटीओटॉक्सिक तनाव4,5. इस कार्यात्मक विविधता को प्राप्त करने के लिए, Hsp70 chaperone JDP परिवार और न्यूक्लिओटाइड विनिमय कारकों (NEFs) के सह-chaperones साझेदारी पर निर्भर करता है कि ठीक धुन Hsp70 के एटीपी निर्भर सब्सट्रेट बाध्यकारी और रिलीज3के allosteric नियंत्रण, 6. इसके अलावा, जेडीपी सह-चैपरोन इस बहुमुखी चैपरोन प्रणाली के लिए substrates के चयन में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। इस परिवार के सदस्यों को तीन वर्गों में विभाजित कर रहे हैं (ए, बी और सी) प्रोटोटाइप JDP, ई. कोलाई DnaJ को उनके संरचनात्मक होमोलॉजी के आधार पर. कक्षा एक JDPs एक एन-टर्मिनल जे-डोमेन, जो Hsp70 के साथ सूचना का आदान-पास होता है, एक ग्लिसिन-फेनिलएलनिन समृद्ध क्षेत्र, एक जस्ता उंगली की तरह क्षेत्र (जेडएफएलआर) और दो जेड-टर्मिनल डोमेन, और एक सी-टर्मिनल डिमराइजेशन डोमेन से मिलकर एक सब्सट्रेट बाइंडिंग क्षेत्र। एक एन-टर्मिनल जे-डोमेन और एक ग्लिसिन-फेनिलएलनिन समृद्ध क्षेत्र के साथ जेडीपी, लेकिन जेडएफएलआर की कमी, वर्ग बी में आती है। सामान्य तौर पर, इन दो वर्गों के सदस्यों chaperoning कार्यों में शामिल हैं. कैचल क्लास सी के तहत आने वाले सदस्य, जिसमें JDPs है जो केवल जे-डोमेन4का हिस्सा है, Hsp70s की भर्ती करने के लिए गैर-चैपरिंग कार्यों की एक किस्म है। विनिमेय सब्सट्रेट मान्यता के रूप में JDPs की महत्वपूर्ण भूमिका Hsp70 प्रणाली के "adaptors" विकास के दौरान परिवार के सदस्यों के एक विस्तार से परिलक्षित होता है. उदाहरण के लिए, मनुष्य 42 से अधिक विशिष्ट JDP सदस्यों4है. ये JDPs monomers, homodimers और / या homo/hetero oligomers4,5 के रूप में कार्य करतेहैं. हाल ही में, वर्ग ए के बीच क्षणिक जटिल गठन के माध्यम से एक कार्यात्मक सहयोग (उदा., एच sapiens DNAJA2; एस सेरेविसे यज1) और वर्ग बी (उदा., एच सैपिएन्स DNAJB1; एस सेरेविएसी सिस1) यूकैरियोटिक जेडीपी को इन विट्रो7,8में अक्रिस्टलीय प्रोटीन समुच्चय की कुशल मान्यता को बढ़ावा देने के लिए सूचित किया गया था . ये मिश्रित वर्ग JDP परिसरों संभवतः एकत्रित प्रोटीन की सतह पर इकट्ठा Hsp70- और Hsp70 + Hsp100 आधारित प्रोटीन disaggregas7,8,9, के गठन की सुविधा के लिए 10. इन क्षणिक रूप से गठित मिश्रित वर्ग जेडीपी परिसरों के अस्तित्व को समर्थन देने के लिए महत्वपूर्ण साक्ष्य यूकैरियोटिक कोशिकाओं में पीएलए8के साथ प्रदान किए गए थे .

पीएलए तेजी से मेटाज़ोआ में प्रोटीन बातचीत का आकलन करने के लिए कार्यरत है, मुख्य रूप से स्तनधारी कोशिकाओं में. यहाँ, हम इस तकनीक के सफल विस्तार की रिपोर्ट करने के लिए इस तरह के नवोदित खमीर एस सेरेविएसिया और जीवाणु ई. कोलाई के रूप में यूकैरियोटिक और प्रोकैरियोटिक एककोशिक जीवों में क्षणिक रूप से गठित चैपरोन परिसरों की निगरानी. महत्वपूर्ण बात, इस विस्तार का पता लगाने और मानव और पशु कोशिकाओं को संक्रमित है कि रोगाणुओं का विश्लेषण करने में पीएलए के संभावित उपयोग पर प्रकाश डाला गया.

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Protocol

1. हेला सेल तैयारी

  1. निम्नलिखित सामग्री तैयार करें: पीबीएस (137 एमएम NaCl, 2.7 mM KCl, 10 m Na2HPO4, 1.8 m KH2PO4), pH 7.4; DMEM, 10% एफसीएस और 1% पेन-स्ट्रेप के साथ पूरक; पीबीएस में 4% पैराफॉर्मेल्डिहाइड; पीबीएस में 0.5% ट्राइटन-X100; टीबीएस-टी (150 एमएम NaCl, 20 एमएम ट्रिस, 0.05% ट्वीन), पीएच 7.4; 0.0001% बाँझ पाली-L-Lysine समाधान; 10-अच्छी तरह से नैदानिक स्लाइड; एक आर्द्र कक्ष; ऊतक कागज; और Coplin स्लाइड दाग जार.
    नोट: इष्टतम निर्धारण दक्षता सुनिश्चित करने के लिए, पैराफॉर्मेल्डिहाइड समाधान ों को हर प्रयोग से पहले ताजा तैयार किया जाना चाहिए।
  2. गीले ऊतकों के साथ एक बंद बॉक्स के नीचे को कवर करके एक आर्द्र कक्ष तैयार करें। प्रयोग प्रारंभ करने से पहले आर्द्र कक्ष को 37 डिग्री सेल्सियस पर रखें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि एंजाइमी अभिक्रियाओं को इनक्यूबेट करते समय कक्ष का ताप 37 डिग्री सेल्सियस पर हो।
  3. T25 फ्लास्क में संस्कृति Hela कोशिकाओं, DMEM के 5 एमएल में (उच्च ग्लूकोज, ग्लूटामेट और सोडियम Pyruvate पूरक) 10% FCS और 1% पेन-स्ट्रेप के साथ पूरक, एक 37 डिग्री सेल्सियस सीओ2 इनक्यूबेटर में 5% सीओ2युक्त . 0.05% ट्रिप्सिन-EDTA का उपयोग करके संबद्ध अनुलग्न कक्ष। अलग कोशिकाओं के लिए ताजा DMEM के अलावा के बाद, एक सेल गिनती कक्ष का उपयोग कर कोशिकाओं की गिनती और एक आर्द्र कक्ष के अंदर नैदानिक स्लाइड पर हो जाना.
  4. 30 मिनट के लिए एक बाँझ सेल संस्कृति हुड में यूवी विकिरण द्वारा नैदानिक स्लाइड स्टरलाइज़ करें।
  5. प्रयोग के लिए आवश्यक प्रत्येक के लिए बाँझ फ़िल्टर ्ड 0.0001% पॉली-एल-लाइसिन के 100 $L जोड़ें। 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। 50 डिग्री अल्ट्राप्योर पानी के साथ प्रत्येक अच्छी तरह से 3x धोने से अतिरिक्त पॉली-एल-लाइसिन को धो लें।
  6. Hela कोशिकाओं trypsinize और प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए लगभग 15,000 कोशिकाओं को जोड़ें. यदि आवश्यक हो, तो कोशिकाओं को कम से कम 30-50 डिग्री सेल्सियस डीएमईएम प्रति अच्छी तरह से पतला करें।
  7. लगभग 24 ज के लिए एक 37 डिग्री सेल्सियस सीओ2 इनक्यूबेटर के भीतर एक आर्द्र कक्ष में कोशिकाओं को बढ़ाएँ 60%-80% पीएलए शुरू करने से पहले confluent होना चाहिए।
    नोट: बहुत अधिक संगम अभिकर्मकों के अवशोषण को कम करता है, प्रोटोकॉल के अंत में प्राप्त संकेत को कम करता है।
  8. कुएं के किनारे पर टिश्यू पेपर रखकर माध्यम को निकालें। पीबीएस के 50 डिग्री एल के साथ कुओं 3x धो लो।
    नोट: जब तरल पदार्थ कठोरता से जोड़े जाते हैं तो कोशिकाओं को अलग करने के अधीन हैं। यह नए तरल जोड़ने से पहले कुओं पूरी तरह से सूखी नहीं दे द्वारा रोका जा सकता है और अच्छी तरह से के किनारे करने के लिए धीरे से नए तरल जोड़कर.
  9. प्रत्येक अच्छी तरह से पीबीएस में ताजा तैयार 4% पैराफॉर्मेल्डिहाइड के 50 डिग्री एल जोड़कर कोशिकाओं को ठीक करें। कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट।
  10. पीबीएस में स्लाइड 3x धो लें। पीबीएस के 100 एमएल युक्त एक कोपलिन स्लाइड-स्टेनिंग जार में वॉश करें। प्रत्येक धोने के लिए, मिलाते हुए बिना कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  11. पीबीएस में 0.5% ट्राइटन-X100 के 100 एमएल में स्लाइड को कोपलिन स्लाइड-स्टेनिंग जार में डुबोकर सेल झिल्ली को जलमग्न कर दें। मिलाते हुए बिना कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट।
  12. टीबीएस-टी में स्लाइड 3x धोएं। टीबीएस-टी के 100 एमएल वाले कोपलिन स्लाइड-स्टेनिंग जार में वॉश करें। प्रत्येक धोने के लिए, मिलाते हुए बिना कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  13. पिछले धोने के बाद, एक ऊतक कागज के साथ अतिरिक्त बफर हटा दें. इस बिंदु पर कोशिकाओं निकटता Ligation परख प्रोटोकॉल है कि खंड 4 में चर्चा की जाएगी के लिए तैयार हैं.

2. एस सेरेविएसिया सेल तैयारी

  1. निम्नलिखित सामग्री तैयार करें: 100 एमएम KPO4, पीएच 6.5, धो बफर के रूप में संदर्भित; 37% फॉर्मेल्डिहाइड; 100 एमएम केपीओ4में 4% पैराफॉर्मेल्डिहाइड , पीएच 6.5; 1.2 एम sorbitol में 100 mM KPO4, पीएच 6.5; lyticase समाधान (500 g/mL lyticase, 20 m $-mercaptoethanol, 100 m KPO4, पीएच 6.5); 0.0001% पॉली-एल-Lysine समाधान; 1% Triton-X100 में 100 एम एम KPO4, पीएच 6.5; 10-अच्छी तरह से नैदानिक स्लाइड; एक आर्द्र कक्ष (चरण 1.2 के रूप में तैयार); ऊतक कागज; और Coplin स्लाइड दाग जार.
    नोट: इष्टतम निर्धारण दक्षता सुनिश्चित करने के लिए, पैराफॉर्मेल्डिहाइड समाधान ों को हर प्रयोग से पहले ताजा तैयार किया जाना चाहिए।
  2. जबकि मिलाते हुए 30 डिग्री सेल्सियस पर गैर चयनात्मक खमीर निकालें, पेपटोन और डेक्सट्रोज (YPD) माध्यम में एक रात की संस्कृति हो जाना।
    नोट: प्रयोगात्मक आवश्यकताओं के आधार पर एस cerevisiae कोशिकाओं सिंथेटिक पूरा (एससी) मध्यम या चयनात्मक सिंथेटिक मिनिमल (एसएम) मध्यम बजाय में उगाया जा सकता है।
  3. 20 एमएल माध्यम में 0.1 के एक ओडी600 के लिए स्थिर संस्कृति को पतला। OD 600 0.5 तक पहुँच जाता है जब तक मिलाते हुए 30 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को बढ़ाएँ।
  4. 20 एमएल कल्चर को 50 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें। 3 मिनट के लिए 665 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूगेशन द्वारा कोशिकाओं को गोली मार ें। सुपरनेंट निकालें। नए माध्यम के 5 एमएल में कोशिकाओं को पुन: निलंबित करें।
  5. संस्कृति के लिए 37% formaldehyde के 550 $L जोड़कर कोशिकाओं को ठीक करें। 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट।
  6. 3 मिनट के लिए 665 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूगेशन द्वारा कोशिकाओं को गोली मार ें। सुपरनेंट निकालें। धो बफर में ताजा तैयार 4% पैराफॉर्मेल्डिहाइड के 1 एमएल में गोली को पुन: निलंबित करें। कमरे के तापमान पर 45 मिनट के लिए इनक्यूबेट।
  7. ऊष्मायन के दौरान, प्रत्येक अच्छी तरह से 0.01% पॉली-एल-लाइसिन समाधान के 100 $L जोड़कर नैदानिक स्लाइड तैयार करें। कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए स्लाइडइन इनक्यूबेट करें।
  8. 30 मिनट के बाद, अतिशुद्ध पानी के साथ अतिरिक्त पॉली-एल-लाइसिन को धो लें और स्लाइड्स को हवा को सूखने दें। सूखी स्लाइड उपयोग के लिए तैयार हैं.
  9. 1 एमएल वॉश बफर के साथ दो बार कोशिकाओं को धोएं। 3 मिनट के लिए 665 x g पर कोशिकाओं के centrifugation द्वारा washes प्रदर्शन. supernatant निकालें और धो बफर में कोशिकाओं को फिर से निलंबित.
  10. 3 मिनट के लिए 665 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूगेशन द्वारा कोशिकाओं को गोली मार ें। सुपरनेंट निकालें। वॉश बफर में 1.2 M sorbitol के 1 एमएल में कोशिकाओं को पुन: निलंबित करें।
  11. 3 मिनट के लिए 665 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूगेशन द्वारा कोशिकाओं को गोली मार ें। सुपरनेंट निकालें। कोशिका की दीवार को पचाने के लिए ताजा तैयार Lyticase समाधान के 250 डिग्री सेल्सियस में गोली को पुन: निलंबित करें। मिलाते समय 30 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए Lyticase समाधान में कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
  12. पाचन के बाद, 3 मिनट के लिए 665 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूगेशन द्वारा कोशिकाओं 3x धोने और supernatant हटा दें। वॉश बफर में 1.2 M sorbitol के 250 $L में कोशिकाओं को पुन: निलंबित करें।
    नोट: क्योंकि कोशिकाओं सेल दीवार पाचन के बाद नाजुक हैं, उन्हें बहुत ध्यान से resuspend कोशिकाओं को नुकसान नहीं है.
  13. पाली-L-lysine लेपित स्लाइडों में पुनः निलंबित कोशिकाओं का 20 डिग्री सेल्सियस जोड़ें। उन्हें 30 मिनट के लिए स्लाइड्स में संलग्न करने की अनुमति दें। 50 डिग्री एल वॉश बफर के साथ कुओं 3x को धोकर गैर-अनुकूल कोशिकाओं को धो लें।
  14. वॉश बफर में 1% ट्राइटन-एक्स के 50 डिग्री एल के साथ 3x धोने से सेल झिल्ली permebilize।
    नोट: इस बिंदु पर कोशिकाओं निकटता ligation परख प्रोटोकॉल है कि खंड 4 में चर्चा की जाएगी के लिए तैयार हैं.

3. ई. कोलाई सेल तैयारी

  1. निम्नलिखित सामग्री तैयार करें: पीबीएस-टी (140 एमएम नैकल, 2 एमएम केसीएल, 8 एमएम के2एचपीओ4, 1.5 एमएम KH2पीओ4, 0.05% ट्वीन-20), पीएच 7.4; लाइसोजाइम समाधान (2 मिलीग्राम/एमएल लाइसोजाइम, 25 एमएम ट्रास-एचसीएल पीएच 8.0, 50 एमएम ग्लूकोज, 10 एमएम एड्टा); 0.0001% पॉली-एल-Lysine समाधान; 99% बर्फ ठंडा मेथनॉल; 99% कमरे के तापमान मेथनॉल; 99% एसीटोन; 10-अच्छी तरह से नैदानिक स्लाइड; एक आर्द्र कक्ष (चरण 1.1.1 के रूप में तैयार); ऊतक कागज; और Coplin स्लाइड दाग जार.
  2. हिलते समय 30 डिग्री सेल्सियस पर लुरिया-बरटानी (एलबी) माध्यम में एक रात की संस्कृति विकसित करें।
  3. ताजा LB माध्यम में 0.02 के एक OD600 के लिए स्थिर संस्कृति को पतला. OD 600 लॉग चरण कोशिकाओं के लिए 0.4 तक पहुँच जाता है जब तक मिलाते हुए 30 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को बढ़ाएँ।
  4. कोशिकाओं के एक OD600 तक पहुँचने से पहले लगभग 15 मिनट 0.4 के एक OD 600, प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए 0.0001% पाली-L-lysine के 100 $L जोड़कर पाली-L-lysine लेपित स्लाइड तैयार करते हैं। कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए स्लाइडइन इनक्यूबेट करें।
  5. 30 मिनट के बाद अतिशुद्ध पानी के साथ अतिरिक्त पॉली-एल-लाइसिन को धो लें और स्लाइड्स को सूखी दें। सूखी स्लाइड उपयोग के लिए तैयार हैं.
  6. जब कोशिकाओं 0.4 के एक OD600 तक पहुँचने, एक बाँझ microcentrifuge ट्यूब और गोली कोशिकाओं को 2,650 x ग्राम पर 2 मिनट के लिए संस्कृति के 1 एमएल हस्तांतरण.
  7. एलबी माध्यम के 50 डिग्री एल में कोशिकाओं को पुन: निलंबित करें।
  8. बर्फ ठंडा 99% मेथनॉल के 1 एमएल जोड़कर कोशिकाओं को ठीक करें। हाथ से बहुत धीरे मिलाएं. -20 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट कोशिकाओं।
  9. निर्धारण के बाद पाली-L-lysine लेपित स्लाइड करने के लिए कोशिकाओं के 20 डिग्री एल जोड़ें। स्लाइड 30 मिनट के लिए हवा सूखी करते हैं।
  10. कोशिका की दीवार को पचाने के लिए प्रत्येक कुएं में 50 डिग्री सेल्सियस ताजा तैयार लाइसोजाइम घोल डालें। 25 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए एक आर्द्र कक्ष में इनक्यूबेट।
  11. कुएं के किनारे पर टिशू पेपर जोड़कर लाइसोजाइम घोल को कुओं से निकालें। पीबीएस-टी के 100 एमएल में 3x स्लाइड ्स्वण करें। मिलाते हुए बिना 30 s के लिए एक Coplin स्लाइड दाग जार में प्रत्येक धोने प्रदर्शन करते हैं।
  12. एक टिशू पेपर पर स्लाइड ्स्स टैप करके वॉश बफर को स्लाइड्स से निकालें।
  13. प्रत्येक अच्छी तरह से 99% मेथनॉल के 50 डिग्री सेल्सियस जोड़कर कोशिका झिल्ली permebilize. कमरे के तापमान पर 1 मिनट के लिए इनक्यूबेट।
  14. कुएं के किनारे पर टिशू पेपर रखकर मेथनॉल निकालें।
  15. प्रत्येक अच्छी तरह से 99% एसीटोन के 50 डिग्री एल जोड़ें. 1 मिनट के लिए इनक्यूबेट।
  16. अच्छी तरह से के किनारे करने के लिए एक ऊतक कागज रखकर अतिरिक्त एसीटोन निकालें। स्लाइड्स को शुष्क हवा में जाने दें. इस बिंदु पर कोशिकाओं निकटता ligation परख प्रोटोकॉल है कि खंड 4 में चर्चा की जाएगी के लिए तैयार हैं.

4. निकटता लिगेशन परख

  1. निम्नलिखित सामग्री तैयार करें: बफर अवरुद्ध; एंटीबॉडी Dilution बफर; धो बफर 'ए' - (10 एमएम ट्रिस, 150 एमएम NaCl, 0.05% ट्वीन-20) पीएच 7.4; धो बफर 'बी' - (200 mM Tris, 100 m NaCl) pH 7.4; एंटी-रैबिट माध्यमिक एंटीबॉडी प्लस; एंटी-माउस सेकेंडरी एंटीबॉडी MINUS; 5x लिगेशन बफर; लिगेज़; 5x प्रवर्धन बफर (ऑरेंज: [पूर्व 554 एनएम;उन्हें 576 एनएम); पॉलिमरेज; अतिपुरे पानी; और बढ़ते माध्यम युक्त DAPI.
    नोट: PLA का पता लगाने अभिकर्मकों भी वेरिएंट में उपलब्ध हैं ग्रीन (पूर्व 495 एनएम;एम 527 एनएम), लाल ([पूर्व 594 एनएम;] एम 624 एनएम), Farred ([ex 64 nm;] em 669 nm) या Brightfield (horsadish peroxase (HRP) संयुग्मी)।
  2. प्रत्येक अच्छी तरह से बफर अवरुद्ध की एक बूंद जोड़कर कोशिकाओं को ब्लॉक. एक आर्द्र कक्ष में 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट।
  3. एंटीबॉडी Dilution बफर में स्टॉक एंटीबॉडी को कम करके एंटीबॉडी समाधान तैयार करें। प्रत्येक अच्छी तरह से के लिए 40 डिग्री सेल्सियस एंटीबॉडी समाधान की आवश्यकता है.
  4. कुएं के किनारे पर टिशू पेपर रखकर बफर को अवरुद्ध करें। प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए एंटीबॉडी Dilution बफर में पतला एंटीबॉडी के 40 डिग्री एल जोड़ें. 37 डिग्री सेल्सियस पर एक आर्द्र कक्ष में 60 मिनट के लिए इनक्यूबेट या रात 4 डिग्री सेल्सियस पर।
  5. कुएं के किनारे पर एक टिशू पेपर रखकर कुएं से एंटीबॉडी समाधान निकालें। 5 मिनट के लिए एक Coplin स्लाइड दाग जार में धो बफर 'ए' के 100 एमएल में 2x स्लाइड, मिलाते हुए बिना.
  6. धोने के चरणों के दौरान, 5x माध्यमिक एंटीबॉडी जांच, एंटी-रैबिट प्लस और एंटी-माउस MINUS (जांच की प्रजातियों की विशिष्टता का इस्तेमाल किया प्राथमिक एंटीबॉडी पर निर्भर करता है), एंटीबॉडी Dilution बफर में पतला। प्रति अच्छी तरह से एंटीबॉडी समाधान के 40 डिग्री एल तैयार करें।
  7. प्रत्येक अच्छी तरह से माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान के 40 डिग्री सेल्सियस जोड़ें. एक आर्द्र कक्ष में 37 डिग्री सेल्सियस पर 60 मिनट के लिए इनक्यूबेट।
  8. कुएं के किनारे पर एक टिशू पेपर रखकर कुओं से द्वितीयक एंटीबॉडी समाधान निकालें। 5 मिनट के लिए एक Coplin स्लाइड दाग जार में धो बफर 'ए' के 100 एमएल में 2x स्लाइड, मिलाते हुए बिना.
  9. washes के दौरान प्रति अच्छी तरह से 40 डिग्री एल लिगिंग मिश्रण तैयार करते हैं, 5x लिगेशन बफर के 8 डिग्री सेल्सियस, अल्ट्राप्यूर पानी के 31 डिग्री एल और लिगेके के 1 डिग्री एल मिश्रण से।
  10. प्रत्येक कुएं में 40 डिग्री सेल्सियस लिगिंग मिश्रण डालें। एक आर्द्र कक्ष में 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट।
  11. कुएं के किनारे एक टिशू पेपर रखकर कुओं से लिगेशन मिश्रण को निकालें। वॉश बफर 'ए' के 100 एमएल में 2x स्लाइड को 2 मिनट के लिए एक कोपलिन स्लाइड-स्टेनिंग जार में, बिना मिलाते हुए।
  12. washes के दौरान अच्छी तरह से प्रति प्रवर्धन मिश्रण के 40 डिग्री सेल्सियस तैयार, 5x प्रवर्धन समाधान के 8 डिग्री सेल्सियस मिश्रण द्वारा, 31.5 ultrapure पानी के , और 0.5 बहुलक के 5 $L.
    नोट: 5x प्रवर्धन फ्लोरोसेंट जांच शामिल हैं. प्रकाश से इस मिश्रण को सुरक्षित रखें. साथ ही, निम्न चरणों में से प्रत्येक के दौरान प्रकाश से स्लाइड की रक्षा करें। यदि पारदर्शी Coplin स्लाइड दाग जार और आर्द्र कक्षों का उपयोग कर, उन्हें एल्यूमीनियम पन्नी में लपेटो.
  13. प्रति अच्छी तरह से प्रवर्धन मिश्रण के 40 डिग्री एल जोड़ें. एक आर्द्र कक्ष में 37 डिग्री सेल्सियस पर 100 मिनट के लिए इनक्यूबेट।
  14. कुओं से प्रवर्धन मिश्रण निकालें. 10 मिनट के लिए एक Coplin स्लाइड दाग जार में धो बफर 'बी' के 100 एमएल में 2x स्लाइड को हिलाने के बिना।
  15. वॉश बफर 'बी' के 100 एमएल में स्लाइड को 30 एस के लिए कोपलिन स्लाइड दागने वाले जार में अल्ट्रापरे पानी में पतला 1:100।
  16. स्लाइड ्स्स ्स्स्स्स्स-ब-याने डीएपी आई के 20 डिग्री एल को अच्छी तरह से बढ़ाकर लें। नेल पॉलिश के साथ एक कवरस्लिप और सील स्लाइड के साथ स्लाइड बंद करें।
  17. यदि इमेजिंग, तुरंत 10-15 मिनट के लिए बढ़ते माध्यम युक्त DAPI incubate, जबकि प्रकाश से रक्षा की. यदि नहीं, तो 1 सप्ताह तक के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर स्लाइड स्टोर, प्रकाश से सुरक्षित.

5. पता लगाना

  1. क्रमशः 20x/0.8 एनए, 63x/1.4 एनए और 100x/1.4 एनए योजना अपोक्रोमैट उद्देश्यों के साथ हेला, एस सेरेविएसिया और ई. कोलाई कोशिकाओं की छवियों को प्राप्त करने के लिए confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग करें। एक 405 एनएम स्पंदित डायोड लेजर के साथ डीएनए दाग DAPI उत्तेजित. पीएलए संकेत के लिए (इस अध्ययन के लिए) एक 561 एनएम ठोस राज्य लेजर के साथ उत्तेजित.

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Representative Results

शुद्ध प्रोटीन का उपयोग कर के हमारे पिछले इन विट्रो अध्ययन से पता चला कि मानव वर्ग ए और वर्ग बी JDPs के एक सबसेट क्षणिक मिश्रित वर्ग JDP परिसरों के रूप में कुशलतापूर्वक एकत्रित प्रोटीन की एक विस्तृत श्रृंखला को लक्षित करने और संभवतः Hsp70 आधारित विधानसभा की सुविधा प्रोटीन डिस्ग्रेगैस7| हमने यह निर्धारित करने के लिए पीएलए को नियोजित किया कि मिश्रित वर्ग (ए + बी) जेडीपी परिसर मानव गर्भाशय ग्रीवा के कैंसर कोशिकाओं (हेला) में पाए जाते हैं या नहीं। मानव JDPs DNAJA2 (वर्ग ए) और DNAJB1 (वर्ग बी) अत्यधिक विशिष्ट प्राथमिक एंटीबॉडी और माध्यमिक पीएलए जांच के साथ लक्षित किया गया (चित्र 2A-C)। लाल फ्लोरोसेंट पाण्डक की उपस्थिति ने हेला कोशिकाओं में मिश्रित वर्ग डी एन ए जे 2 और डी एन ए बी बी 1 परिसरों की उपस्थिति का संकेत दिया (चित्र 2 सी) हमारे पिछले जैव रासायनिक निष्कर्षों की पुष्टि7. प्रत्येक punctum HeLa सेल cytosol में एक व्यक्ति प्रोटीन बातचीत घटना का प्रतिनिधित्व करता है /

पिछले जैव रासायनिक परिणाम से प्राप्त एफजेडर्स्टर अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण (FRET), जो एक उपयुक्त ग्राही फ्लोरोफोर के लिए एक प्रोटीन से जुड़े एक उत्साहित दाता fluorophore से स्थानांतरित ऊर्जा की मात्रा का एक readout के रूप में प्रोटीन बातचीत का पता लगाता है दूसरे प्रोटीन से जुड़ा, संकेत दिया है कि इसी तरह मिश्रित वर्ग परिसरों भी खमीर JDPs के बीच हो सकता है, इन विट्रो8में. हमारे जैव रासायनिक निष्कर्षों की पुष्टि करते हुए, हमने पी एल ए (चित्र2एफ) के साथ एककोशिकीय यूकैरिओट एस सेरेविएसियाई (बेकर खमीर) कोशिकाओं में YdJ1 (वर्ग A) और Sis1 (वर्ग B) के बीच मिश्रित वर्ग परिसरों के गठन को देखा। खमीर में, उनके छोटे सेल आकार और कई punctae के coalscence के कारण, व्यक्तिगत फ्लोरोसेंट पीएलए द्वारा उत्पन्न डॉट्स अक्सर कम भेद हो सकता है. फ्लोरोसेंट punctae गठन में काफी कमी मानव और खमीर कोशिकाओं 8, जो विभिन्नमें इन सह-चैपरोन परिसरों पर कब्जा करने में पीएलए की उच्च विशिष्टता को दर्शाता है दोनों में JDPs बातचीत के नॉकआउट या दस्तक के बाद मनाया गया था सेल प्रकार. अपने यूकैरियोटिक समकक्षों के विपरीत , प्रोकैरियोटिक (ई. कोली) जेडीपी में मिश्रित वर्ग जेडीपी परिसरबनाने की क्षमता का अभाव था और इन विट्रो8में प्रोटीन वियोग को बढ़ावा देने के लिए कार्यात्मक सहयोग करते थे . जैव रासायनिक विश्लेषण के साथ समझौते में, हम जीवाणु DnaJ-YFP (वर्ग ए) और CbpA-MCherry (वर्ग बी), ई. कोलाई में केवल JDPs के बीच मिश्रित वर्ग JDP जटिल गठन का पालन नहीं किया (चित्र 2I)। हालांकि, हमारे पीएलए सेटअप दो JDPs शामिल अन्य chaperone विधानसभाओं पर कब्जा करने में सक्षम था. उदाहरण के लिए, हमने DnaJ-YFP और DnaK (बैक्टीरियल Hsp70) (चित्र 2L) और CbpA-mCherry और DnaK8 (डेटा नहीं दिखाया गया) के बीच चैपरोन कॉम्प्लेक्स का पता लगाया। इन दो जीवाणु चैपरोन परिसरों में इन दोनों इन विट्रो में और विवो8,11,12 में बड़े पैमाने पर विशेषता है इस प्रकार हमारे पीएलए परिणामों की पुष्टि. एक साथ, इन प्रेक्षणों को एककोशिक/बहुकोशिकीय और प्रोकैरियोटिक कोशिकाओं में क्षणिक रूप से गठित चैपरोन मशीनरी को मजबूती से कैप्चर करने की क्षमता प्रदर्शित होती है। तकनीकी नियंत्रण बातचीत JDPs/chaperones में से एक के खिलाफ एक प्राथमिक एंटीबॉडी की कमी है, लेकिन दोनों माउस और खरगोश व्युत्पन्न माध्यमिक पीएलए जांच युक्त, कोई पृष्ठभूमि फ्लोरोसेंट संकेत करने के लिए थोड़ा दिखाया (चित्र2ए, बी, डी, ई, जी, एच, जम्मू,कश्मीर) हमारे प्रयोगात्मक सेटअप में झूठी सकारात्मक संकेत प्रवर्धन की कमी का संकेत.

Figure 1
चित्र 1: निकटता लिगेशन परख के कालानुक्रमिक चरणों का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। (1) प्रोटीन ए और प्रोटीन बी के बीच परिसर (2) प्राथमिक (1 डिग्री) एंटीबॉडी (हरे और हल्के भूरे रंग) के बीच का परिसर प्रोटीन ए और बी के लिए। दो प्राथमिक एंटीबॉडी विभिन्न मेजबान प्रजातियों (उदा. माउस, खरगोश या बकरी) में उठाया जाना चाहिए। (3) प्राथमिक एंटीबॉडी प्रजातियों-विशिष्ट माध्यमिक (2 डिग्री) एंटीबॉडी सहसंयोजक डीएनए ओलिगो टैग (पीएलए जांच) के साथ संलग्न द्वारा मान्यता प्राप्त कर रहे हैं। (4) जब प्रोटीन ए और बी जटिल हैं, बाध्य पीएलए जांच करीब निकटता में हैं डीएनए oligos की सुविधा के लिए संबंधक डीएनए किस्में, जो एक परिपत्र डीएनए अणु के गठन में परिणाम के साथ संकर. बाद में, एक डीएनए लिगेस फॉस्फोडेस्टर बांड के गठन को उत्प्रेरित करके डीएनए किस्में एक साथ शामिल होने की सुविधा प्रदान करता है। (5) 37 डिग्री सेल्सियस पर एक जीवाणु डीएनए पॉलिमरेज द्वारा परिपत्र डीएनए अणु के रोलिंग सर्कल प्रवर्धन (आरसीए) की शुरुआत एक एंटीबॉडी-संयुग्मी डीएनए ओलिगो टैग में से एक द्वारा primed है। (6) एक एकल-संक्षिप्त concatemeric डीएनए अणु का उत्पादन माध्यमिक एंटीबॉडी में से एक से जुड़ी. (7) फ्लोरोसेंट-लेबल पूरक ओलिगोन्यूक्लिओटाइड का संकरीकरण कॉन्टेमरिक डीएनए अणु में एक अद्वितीय दोहराव वाले अनुक्रम की जांच करता है। संकरीकरण कदम के बाद, concatemeric डीएनए अणु निश्चित कोशिकाओं में लक्षित प्रोटीन परिसर के स्थान पर एक उज्ज्वल फ्लोरोसेंट डॉट के रूप में कल्पना की जा सकती है. तल प्रोकैरियोटिक और यूकैरियोटिक सेल प्रकारों को निरूपित करता है जिसमें पीएलए तकनीक लागू होती है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2. आण्विक चैपरोन विधानसभाओं प्रोकैरियोटिक और यूकैरियोटिक कोशिकाओं में पीएलए द्वारा कब्जा कर लिया। (ए-सी)मानव गर्भाशय ग्रीवा के कैंसर सेल लाइन हेला में डीएनएजे2 (वर्ग ए) और डी.एन.ए.जेबी1 (वर्ग बी) के बीच गठित मिश्रित वर्ग जेडीपी परिसरों की जांच। पीएलए के साथ प्रदर्शन किया (एक) विरोधी DNAJA2 एंटीबॉडी अकेले (नकारात्मक तकनीकी नियंत्रण); (बी) विरोधी DNAJB1 अकेले एंटीबॉडी (नकारात्मक तकनीकी नियंत्रण); (सी) विरोधी DNAJB1 और विरोधी DNAJA2 एंटीबॉडी एक साथ. पैनल सी (सकारात्मक संकेत) में कई फ्लोरोसेंट डॉट्स की उपस्थिति DNAJA2 और DNAJB1 के बीच गठित प्रोटीन परिसरों की उपस्थिति को इंगित करता है। प्रत्येक लाल फ्लोरोसेंट डॉट / न्यूक्लिय (डीएनए) डीएपीआई (सायन) के साथ दाग। (डी-एफ) एस सेरेविएसिया कोशिकाओं में YdJ1 (वर्ग ए) और Sis1 (वर्ग बी) के बीच गठित मिश्रित वर्ग JDP परिसरों की जांच। (डी) पीएलए अकेले विरोधी YdJ1 एंटीबॉडी (नकारात्मक तकनीकी नियंत्रण) के साथ प्रदर्शन किया; (ई) पीएलए अकेले विरोधी Sis1 एंटीबॉडी (नकारात्मक तकनीकी नियंत्रण) के साथ प्रदर्शन किया; (च) पीएलए ने यदज1 और एंटी-सिस1 एंटीबॉडी के साथ एक साथ प्रदर्शन किया। सकारात्मक फ्लोरोसेंट संकेत एस सेरेविएसियामें YdJ1 और Sis1 परिसरों की उपस्थिति को दर्शाता है. खमीर नाभिक DAPI (सियान) के साथ दाग. (जी-एल) ई. कोलाई कोशिकाओं में प्रोकैरियोटिक Hsp70 (DnaK) और JDPs (DnaJ और CbpA) के बीच गठित चैपरोन परिसरों की जांच। प्रोकैरियोटिक जेडीपी के खिलाफ विशिष्ट प्राथमिक एंटीबॉडी की कमी के कारण, ई. कोलाई डीएनएजे (क्लास ए) और सीबीपीए (क्लास बी) को क्रमशः वाईएफपी और एमचेरी के साथ टैग किया गया था। (जी, जम्मू) पीएलए अकेले विरोधी YFP (नकारात्मक तकनीकी नियंत्रण) के साथ प्रदर्शन किया; (एच) पीएलए अकेले (नकारात्मक तकनीकी नियंत्रण) के साथ प्रदर्शन किया। (I) पीएलए ने वाईएफपी और एंटी-मेचेरी एंटीबॉडी के साथ प्रदर्शन किया। फ्लोरोसेंट डॉट गठन की कमी DnaJ और CbpA के बीच कोई जटिल गठन इंगित करता है. (K) पीएलए अकेले एंटी-डीएनएके एंटीबॉडी (नकारात्मक तकनीकी नियंत्रण) के साथ किया जाता है। (एल) पीएलए ने एंटी-वाईएफपी और एंटी-डीएनएके एंटीबॉडी के साथ एक साथ प्रदर्शन किया। सकारात्मक फ्लोरोसेंट संकेत DnaK और DnaJ के बीच जटिल गठन इंगित करता है. डीएपीआई (सायन) के साथ दाग जीवाणु डीएनए। एक एकल प्राथमिक एंटीबॉडी को रोकने के अलावा, सभी नकारात्मक तकनीकी नियंत्रण संबंधित माध्यमिक पीएलए जांच की उपस्थिति में प्रदर्शन किया गया. स्केल बार ] 10 डिग्री मी.

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Discussion

सह-प्रतिरक्षा और सह-स्थानीयकरण आधारित दृष्टिकोण प्रोटीन assembles की विशेषता के लिए लंबे समय से चली आ रही तरीकों के रूप में इस्तेमाल किया गया है। क्षणिक रूप से गठित विशिष्ट चैपरोन परिसरों का पता लगाना इस तरह के पारंपरिक तरीकों के साथ एक बड़ी चुनौती है, और परिणामस्वरूप, पिछले निष्कर्ष काफी हद तक गुणात्मक व्याख्याओं तक ही सीमित हैं। सेल lysis-आधारित सह-प्रतिरक्षा तकनीक अक्सर पार से जोड़ने प्रोटीन प्रोटीन बातचीत को स्थिर करने की आवश्यकता है. सेल lysis क्षणिक रूप से गठित Chaperone परिसरों को बाधित करने का खतरा बढ़ जाता है, जबकि पार से जोड़ने गैर देशी बातचीत परिचय सकता है, विशेष रूप से सबसे chaperones के निहित "स्थिरता" द्वारा संचालित. सह-प्रतिरक्षा का उपयोग करHsp70 चैपरोन प्रणाली का विश्लेषण करते समय, संभावित कलाकृतियों से उत्पन्न हो सकता है (क) चैपरोन के उच्च अभिव्यक्ति स्तर और (ख) झिल्ली या प्रोटीन कुल बाध्य चैपरोन मशीनरी से संबंधित घुलनशीलता मुद्दों. इसके अलावा, सह-प्रतिरक्षा-आधारित तकनीक कैप्चर किए गए प्रोटीन असेंबली के सेलुलर स्थानीयकरण के बारे में कोई जानकारी प्रदान करती है, जो संबद्ध कार्यों को बताए जाने के लिए महत्वपूर्ण हो सकती है। सह-प्रतिरक्षा तकनीकों का उपयोग करने की कमियां सह-स्थानीयकरण-आधारित दृष्टिकोणों में कुछ हद तक कम हो जाती हैं जो प्रोटीन स्थानीयकरण जानकारी को संरक्षित करती हैं। हालांकि, दो या दो से अधिक प्रोटीन के सह-स्थानीयकरण या तो प्रत्यक्ष प्रोटीन प्रोटीन एसोसिएशन या कोशिकाओं में एक ही microdomain में प्रोटीन के विभाजन का संकेत हो सकता है. इसलिए, सह स्थानीयकरण विश्लेषण है, सबसे अच्छा में, प्रोटीन बातचीत की भविष्यवाणी में सट्टा और किसी भी निकटता मूल्य का अभाव है. लक्षित प्रोटीन के थोक और अंधाधुंध पता लगाने के कारण, तकनीक कोशिकाओं में विशिष्ट प्रोटीन विधानसभाओं का अध्ययन करने में अत्यधिक सीमित है। यह विशेष रूप से समस्याग्रस्त है जब लक्षित प्रोटीन (ओं) सकता है, समानांतर में, Hsp70 chaperone प्रणाली के साथ मामले में के रूप में अलग प्रोटीन विधानसभाओं की एक विस्तृत श्रृंखला के रूप में. इन पारंपरिक पद्धतियों की तुलना में, पीएलए संरक्षित प्रोटीन स्थानीयकरण जानकारी के साथ कोशिकाओं में देशी प्रोटीन संघों का मजबूती से पता लगाने और मात्रा निर्धारित करने के लिए विकसित की गई सीटू तकनीक में अधिक परिष्कृत है। एक प्रोटीन बातचीत लक्षित प्रोटीन के बीच निकटता (लगभग 10-30 एनएम) के आधार पर इस परख से पता चला है. पीएलए "टूनाबल" है कि निकटता दूरी की सीमा से एक और अधिक कड़े readout प्राप्त करने के लिए कम किया जा सकता है (क) पीएलए जांच से जुड़े ओलिगोन्यूक्लिओटाइड टैग की लंबाई को कम करने और / एक सकारात्मक पीएलए संकेत की व्याख्या करते समय ध्यान रखा जाना चाहिए। आदर्श रूप में, एक प्रोटीन बातचीत दो या दो से अधिक स्वतंत्र तरीकों के साथ पुष्टि की जानी चाहिए. पीएलए में फ्लोरोसेंट सिग्नल की तीव्रता प्रोटीन क्लस्टर आकार या बातचीत प्रोटीन के बीच जुदाई दूरी से संबंधित नहीं है क्योंकि FRET के साथ मामला है। हालांकि, पीएलए विशिष्टता और संवेदनशीलता का एक उच्च डिग्री है, और यहां तक कि इस तरह के विकास कारक या साइटोकिन्स और दुर्लभ सेल प्रकार या नैदानिक नमूनों13में उनकी बातचीत के रूप में बहुत कम प्रचुर मात्रा में प्रोटीन का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

अपने सेलुलर जीवनकाल 14 के दौरान कई सह-चैपरोन (उदा., JDPs और NEFs) के साथ Hsp70 chaperone भागीदारों अलग जैविक कार्यों ड्राइव करने के लिए। संभावित Hsp70-JDP-NEF मशीन विन्यास और कोशिकाओं में उनके गतिशील व्यवहार की सरासर संख्या काफी हद तक इन chaperone मशीनों की विशिष्ट भूमिकाओं की एक विस्तृत समझ बाधित है. जैविक उपकरण है कि अलग Hsp70 विधानसभाओं के चयनात्मक अनुरेखण की अनुमति है, इसलिए, कोशिकाओं में इस chaperone नेटवर्क के समग्र तारों विच्छेदन के लिए आवश्यक हैं. क्षणिक रूप से गठित JDP-JDP और JDP-Hsp70 chaperone परिसरों7 प्रभावी ढंग से पीएलए के साथ कोशिकाओं में कब्जा कर लिया गया, यह दर्शाता है कि इस तकनीक उच्च वियोजन स्थिरांक के साथ आणविक बातचीत का अध्ययन करने के लिए उपयुक्त है (उदाहरण के लिए, gt;3 $ Kडी ). हालांकि, वर्तमान काम में, परख मुख्य रूप से एक "हाँ" या "नहीं" प्रकार chaperone बातचीत के लिए द्विआधारी सूचक के रूप में प्रयोग किया जाता है, उपयोगकर्ताओं को डिजिटल रूप से फ्लोरोसेंट गिनती द्वारा बातचीत की डिग्री के अर्द्ध मात्रात्मक readouts प्राप्त करने के लिए इस तकनीक को रोजगार कर सकते हैं संकेत तीव्रता15| तथापि, पीएलए संकेत के अरैखिक प्रवर्धन के कारण, मात्रात्मकतरीकेसे पीएलए के आंकड़ों की व्याख्या करते समय सावधानी बरती जानी चाहिए। ऊपर बताए गए लाभों के बावजूद, इस विधि की कुछ सीमाएं हैं। पीएलए के मुख्य नुकसान में से एक यह है कि परख सेल निर्धारण की आवश्यकता है इस प्रकार काफी हद तक जीवित कोशिकाओं में प्रोटीन complexation के लौकिक गतिशीलता को हल करने की क्षमता सीमित. इसकी तुलना में, विवो FRET17 या Bioluminescence अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण (BRET)18 में अपेक्षाकृत छोटे निकटता मूल्यों के साथ रहने वाले कोशिकाओं में एक spatio-अस्थायी तरीके से इसी तरह के प्रोटीन बातचीत की निगरानी की अनुमति देता है (और lt;10 एनएम). पीएलए के विपरीत, एक FRET संकेत प्रोटीन अभिव्यक्ति के स्तर के साथ एक सख्त रैखिक सहसंबंध दर्शातीहै 16 प्रोटीन बातचीत के मात्रात्मक विश्लेषण में सोने के मानक FRET बना. हालांकि, रहस्यपूर्ण अभिविन्यास कारक पर FRET की निर्भरता के विपरीत -2, पीएलए जांच के अभिविन्यास से प्रभावित नहीं है, जो एक प्रोटीन परिसर पर कब्जा करने की संभावना बढ़ जाती है19. उपयोगकर्ता मित्रता के संदर्भ में, FRET और BRET अद्वितीय विशेषज्ञता की आवश्यकता है इस प्रकार आम तौर पर व्यापक अनुसंधान समुदाय के लिए इन तरीकों की पहुँच सीमित. इसके अलावा, इन दोनों तकनीकों के भारी luminescent / फ्लोरोसेंट प्रोटीन टैग है कि संभवतः प्रोटीन समारोह और जटिल गठन के साथ हस्तक्षेप कर सकता संलग्न द्वारा बातचीत प्रोटीन के संशोधन की आवश्यकता है.

निम्नलिखित चरणों (1-4) कोशिकाओं में पीएलए के सफल कार्यान्वयन के लिए सावधानीपूर्वक विचार करने की आवश्यकता है। (1) एंटीबॉडी चयन: व्यावसायिक रूप से उपलब्ध पीएलए किट केवल माउस, खरगोश और बकरी के खिलाफ उठाए गए प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ संगत है। पीएलए को अत्यधिक विशिष्ट प्राथमिक एंटीबॉडी की आवश्यकता होती है जो लक्ष्य से बांधे नहीं जाते हैं। इसके अतिरिक्त, प्राथमिक एंटीबॉडी का चयन करना महत्वपूर्ण है जो इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री (आईएचसी), एंजाइम से जुड़े इम्यूनोसोरबेंट परख (एलिसा) और/या इम्यूनोप्रीसेशन (आईपी) जैसे अनुप्रयोगों के साथ संगत हैं ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि एंटीबॉडी पहचान सके जोड़ प्रोटीन की सतह पर उजागर एंटीजेनिक एमिनो एसिड दृश्यों. उपयोग करने से पहले, उनकी विशिष्टता के लिए सभी प्राथमिक एंटीबॉडी का परीक्षण अत्यधिक अनुशंसित है। यह पूरे सेल lysates के पश्चिमी धब्बा विश्लेषण के माध्यम से किया जा सकता है. ऐसे मामलों में जहां लक्षित प्रोटीन आकार और अनुक्रम समानता (उदाहरण के लिए, Hsp70 और JDP paralogs) में छोटी विविधताओं के साथ homologs है, एंटीबॉडी की विशिष्टता जीन knockdown के साथ परीक्षण किया जा सकता है / किसी भी संभावित पार मान्यता से बाहर शासन करने के लिए homologs. यदि उपयुक्त एंटीबॉडी उपलब्ध नहीं हैं, तो लक्षित प्रोटीन को प्रतीक के साथ टैग किया जा सकता है जिनके पास स्वीकार्य गुणवत्ता के एंटीबॉडी हैं (चित्र 2F). (2) कोशिकाओं का निर्धारण और परिमंडलीकरण: 4% पैराफॉर्मेल्डिहाइड और 0.1-0.5% ट्राइटन-एक्स100 का उपचार क्रमशः कोशिकाओं को ठीक करने और permeabilize करने के लिए किया जा सकता है। 4% पैराफॉर्मेल्डिहाइड का उपयोग प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन और सेलुलर अल्ट्रास्ट्रक्चर के संरक्षण के लिए एक बेहतर उपचार है जो 99% मेथनॉल को नियोजित करने वाली स्थिर स्थितियों की तुलना में है।20,21,22. 99% मेथनॉल के साथ कोशिकाओं फिक्सिंग, तथापि, कम साइटोप्लाज्मिक पृष्ठभूमि धुंधला पैदावार, और शायद इस तरह के cytoskeleton जुड़े प्रोटीन विधानसभाओं का पता लगाने के रूप में विशिष्ट मामलों के लिए अधिक उपयुक्त है21,22. एंटीबॉडी पहुंच बढ़ाने के लिए प्लाज्मा झिल्ली के साथ-साथ ऑर्गेनेल झिल्ली दोनों के कुशल permeabilization गैर-आयनिक सर्फैक्टेंट ट्राइटन-X100 के साथ प्राप्त किया जा सकता है। Triton-X100 कर सकते हैं, तथापि, गैर विशेष रूप से प्लाज्मा झिल्ली से प्रोटीन को दूर23,24. इसलिए, सेलुलर झिल्ली के साथ जुड़े प्रोटीन विधानसभाओं के विश्लेषण के लिए, इस तरह के saponin या digitonin के रूप में वैकल्पिक डिटर्जेंट है कि sterols को लक्षित करने के लिए permeabilize झिल्ली लागू किया जा सकता है21,22,25. (3) कोशिका की दीवार का विघटन: झिल्ली permeabilization से पहले, विशिष्ट lytic एंजाइमों को शामिल एक अतिरिक्त कदम कोशिका दीवारों के साथ सेल प्रकार में एंटीबॉडी की penetrability बढ़ाने की जरूरत है (जैसे कवक, संयंत्र और जीवाणु कोशिकाओं). उदाहरण के लिए, हमने लाइटिकेस का इस्तेमाल किया, जो सेल की दीवार को बाधित करने के लिए $-ग्लूकन को नीचा दिखाता हैS. cerevisiae26. इसी तरह,E. coliकोशिका दीवार lysozyme, एक एंजाइम है कि peptidoglycans लक्ष्य का उपयोग कर बाधित किया गया था27,28. कोशिका दीवार संरचना और lytic एंजाइम संवेदनशीलता विभिन्न विकास की स्थिति के साथ बदलता रहता है26और संस्कृति संगम29,30. इसलिए, lytic एंजाइमों और पाचन समय की एकाग्रता भिन्न हो सकते हैं और देखभाल के लिए अधिक या कोशिकाओं के underच को रोकने के लिए लिया जाना है. कोशिका दीवार पाचन के बाद, कोशिकाओं को अपेक्षाकृत नाजुक होते हैं और उन्हें धोने के चरणों के दौरान बरकरार रहने के लिए sorbitol जैसे भीड़ एजेंटों की आवश्यकता होती है। (4) डीएनए प्रवर्धन: डीएनए लिगेशन और रोलिंग सर्कल पीसीआर प्रतिक्रिया कदम तापमान और आर्द्रता में उतार-चढ़ाव के प्रति संवेदनशील हैं। मजबूत डीएनए प्रवर्धन और परख की reproducibility सुनिश्चित करने के लिए, इन प्रतिक्रियाओं को एक आर्द्रता कक्ष में 37 डिग्री सेल्सियस पर प्रदर्शन किया जा करने के लिए आवश्यक हैं। महत्वपूर्ण बात, proccessed कोशिकाओं को बाहर सुखाने से रोका जाना चाहिए, जबकि परख प्रदर्शन करने के लिए किसी भी गैर विशिष्ट एंटीबॉडी बाध्यकारी और डीएनए प्रवर्धन की घटनाओं है कि पृष्ठभूमि संकेत में वृद्धि करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं से बचने के लिए.

सभी बातों पर विचार किया, इस परख के कार्यान्वयन अद्वितीय विशेषज्ञता और परिष्कृत इंस्ट्रूमेंटेशन की आवश्यकता नहीं है. JDP-JDP और JDP-Hsp70 chaperone परिसरों की सफल निगरानी सभी सेल प्रकार में क्षणिक रूप से गठित प्रोटीन विधानसभाओं का पता लगाने के लिए इस तकनीक के संभावित आवेदन को दर्शाती है। खमीर और बैक्टीरिया में तकनीक के हमारे कार्यान्वयन काफी जीवों की एक विस्तृत श्रृंखला में अलग प्रोटीन विधानसभाओं द्वारा मध्यस्थता विभिन्न जैविक प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए पीएलए की प्रयोज्यता बढ़ जाती है। इसके अलावा, हमारे काम8प्रजातियों में एक आणविक स्तर पर होने वाले विकासवादी परिवर्तनों का अध्ययन करने के लिए एक आशाजनक नए प्रोटीन बातचीत उपकरण के रूप में पीएलए पर प्रकाश डाला गया।

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Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

NBN विक्टोरिया और ऑस्ट्रेलियाई सरकार के राज्य सरकार से धन के साथ चिकित्सा नर्सिंग और स्वास्थ्य विज्ञान के मोनाश विश्वविद्यालय संकाय से एक विशेष भर्ती अनुदान द्वारा समर्थित है. हम बर्न्ड Bukau ($MBH, हीडलबर्ग विश्वविद्यालय, जर्मनी) और नुकसान एच Kampinga (सेल्स एंड सिस्टम्स के जैव चिकित्सा विज्ञान विभाग, Groningen विश्वविद्यालय, नीदरलैंड) उनके अमूल्य समर्थन और अभिकर्मकों के बंटवारे के लिए धन्यवाद, होल्गर लोरेंज ($MBH इमेजिंग सुविधा, हीडलबर्ग विश्वविद्यालय, जर्मनी) confocal माइक्रोस्कोपी और छवि प्रसंस्करण के साथ अपने समर्थन के लिए, और क्लेयर Hirst (ARMI, मोनाश विश्वविद्यालय, ऑस्ट्रेलिया) पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
37% Formaldehyde Merck 103999
Acetone Sigma-Aldrich 32201
anti-DNAJA2 antibody Abcam ab157216
anti-DNAJB1 Antibody Enzo Life Sciences ADI-SPA-450
anti-DnaK antibody In house
anti-mCherry antibody Abcam ab125096
anti-Sis1 Antibody Cosmo Bio Corp COP-080051
anti-Ydj1 antibody StressMarq Biosciences  SMC-150,
anti-YFP antibody In house
Coplin slide-staining jar Sigma-Aldrich S5516
Diagnostic slides Marienfeld 1216530
DMEM Thermo-Fischer 31966021
DuoLink In Situ Detection Reagents Orange Sigma-Aldrich DUO92007
DuoLink In Situ Mounting Medium + DAPI Sigma-Aldrich DUO82040
DuoLink In Situ PLA Probe Anti-Mouse MINUS Sigma-Aldrich DUO92004
DuoLink In Situ PLA Probe Anti-Rabbit PLUS Sigma-Aldrich DUO92002
DuoLink In Situ Wash Buffers, Fluorescence Sigma-Aldrich DUO82049
Fetal Calf Serum Thermo-Fischer 10082147
Lysozyme Sigma-Aldrich 62971
Methanol Sigma-Aldrich 32213
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148
Penicillin/Streptomycin Thermo-Fischer 15070063
Poly-L-Lysine Sigma-Aldrich P47-07
Sorbitol Sigma-Aldrich S7547
Triton-X100 Merck 108643
Trypsin Thermo-Fischer 25300096
Tween-20 Sigma-Aldrich P1379
Zymolase 100T / / Lyticase United States Biological Z1004

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References

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बैक्टीरिया, खमीर, और मानव कोशिकाओं में क्षणिक रूप से गठित आणविक Chaperone विधानसभाओं की सीटू निगरानी में
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Alberts, N., Mathangasinghe, Y.,… More

Alberts, N., Mathangasinghe, Y., Nillegoda, N. B. In Situ Monitoring of Transiently Formed Molecular Chaperone Assemblies in Bacteria, Yeast, and Human Cells. J. Vis. Exp. (151), e60172, doi:10.3791/60172 (2019).

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