Summary
Cognate J-Domain proteiner samarbejder med Hsp70 chaperone for at hjælpe i et utal af biologiske processer, der spænder fra proteinfoldning til nedbrydning. Her beskriver vi en in situ nærheds ligationsanalyse, som tillader overvågning af disse transitivt dannede chaperone-maskiner i bakterie-, gær-og humane celler.
Abstract
J-Domain proteiner (jdps) udgør den største og mest forskelligartede Co-chaperone familie i eukaryote celler. Nylige resultater viser, at specifikke medlemmer af JDP-familien kunne danne forbigående heterokomplekser i eukaryoter for at finjustere substrat valget for 70 kDa Heat Shock protein (Hsp70) chaperone-baserede protein disaggregaser. JDP komplekser Target akut/kronisk stress induceret aggregerede proteiner og formentlig hjælpe med at samle disaggregases ved at rekruttere flere Hsp70s til overfladen af protein aggregater. Omfanget af PQC-netværket (protein Quality Control), som er dannet af disse fysisk interagerende JDPs, er stort set ukarakteriseret in vivo. Her beskriver vi en mikroskopi baseret in situ-protein interaktions analyse, der kaldes nærhed ligering assay (PLA), som er i stand til robust at fange disse transitivt dannede chaperone komplekser i særskilte cellulære rum af eukaryote celler. Vores arbejde udvider beskæftigelsen af PLA fra humane celler til gær (Saccharomyces cerevisiae) og bakterier (Escherichia coli), hvilket gør et vigtigt redskab til at overvåge dynamikken i transitivt dannede protein samlinger i både prokaryotiske og eukaryotiske celler.
Introduction
En enorm mængde af genomisk information forbliver ufortoldelig på grund af vores ufuldstændige forståelse af cellulære interactomes. Konventionelle protein-protein interaktion påvisning metoder såsom protein Co-immunoprecipitation med/uden kemisk Cross-linking og protein Co-lokalisering, selv om udbredte, udgør en række ulemper. Nogle af de største ulemper omfatter dårlig kvantificering af samspillet og den potentielle indførelse af ikke-indfødte bindende begivenheder. Til sammenligning giver nye nærheds baserede teknikker et alternativ og en stærk tilgang til at opfange protein interaktioner i celler. Nærhed ligering assay (PLA)1, nu tilgængelig som en proprietær kit, beskæftiger antistoffer til specifikt målrette protein komplekser baseret på nærhed af de interagerende under enheder.
PLA initieres ved dannelsen af et stillads bestående af primære og sekundære antistoffer med små DNA-Tags (PLA-sonder) på overfladen af det målrettede protein kompleks (figur 1, trin 1-3). Dernæst, bestemt af nærheden af DNA-Tags, et cirkulært DNA-molekyle genereres via hybridisering med konnektor oligonukleotider (figur 1, trin 4). Dannelsen af det cirkulære DNA er afsluttet med et DNA-ligations trin. Det nyligt dannede cirkulære stykke DNA fungerer som en skabelon for den efterfølgende rullende cirkel amplifikation (RCA)-baseret polymerasekæde reaktion (PCR) primet af en af de konjugeret oligonukleotid Tags. Dette genererer et enkeltstrenget koncatemerisk DNA-molekyle, der er fastgjort til protein komplekset via antistof stilladset (figur 1, trin 6). Det concatemeriske DNA-molekyle visualiseres ved hjælp af fluorescently mærkede oligonukleotider, der hybridiserer til flere unikke sekvenser spredt over det forstærkede DNA (figur 1, trin 7)2. Det genererede PLA-signal, der vises som en fluorescerende prik (figur 1, trin 7), svarer til placeringen af det målrettede protein kompleks i cellen. Som et resultat, analysen kunne detektere protein komplekser med høj rumlig nøjagtighed. Teknikken er ikke begrænset til blot at opfange protein interaktioner, men kan også udnyttes til at detektere enkelte molekyler eller protein modifikationer på proteiner med høj følsomhed1,2.
Hsp70 danner et meget alsidigt chaperone system, der er fundamentalt vigtigt for at opretholde cellulær protein homøostase ved at deltage i en vifte af husholdning og stress-relaterede funktioner. Husholdnings aktiviteterne i Hsp70 chaperone-systemet omfatter de Novo proteinfoldning, protein translokation på tværs af cellemembraner, montage og demontering af protein komplekser, regulering af protein aktivitet og sammenkædning af forskellige proteinfoldning/ kvalitetskontrol machineries3. Det samme chaperone-system omfolder også sammenfoldet/udfoldet proteiner, forhindrer protein sammenlægning, fremmer protein opdeling og samarbejder med cellulære proteaser om at nedbryde terminalt misfoldede/beskadigede proteiner for at lette cellulær reparation efter proteotoksiske belastninger4,5. For at opnå denne funktionelle mangfoldighed, er Hsp70 chaperone afhængig af partnerskab Co-Chaperones af JDP familie og nucleotid Exchange faktorer (nefs) at finjustere Hsp70's ATP-afhængige allosterisk kontrol af substrat binding og Release3, 6. Desuden spiller JDP Co-Chaperones en afgørende rolle i udvælgelsen af substrater til dette alsidige chaperone system. Medlemmer af denne familie er inddelt i tre klasser (A, B og C) baseret på deres strukturelle homologi til prototypen JDP, E. coli dnaj. Klasse A jdps indeholder en N-terminal J-domæne, som interagerer med Hsp70, en glycin-phenylalanin rige region, en substrat binding region bestående af en zink finger-lignende region (zflr) og to β-tønde domæner, og en C-Terminal denne domæne. JDPs med en N-terminal J-domæne og en glycin-phenylalanin rige region, men mangler ZFLR, falder i klasse B. Generelt er medlemmer af disse to klasser involveret i chaperoning funktioner. Medlemmer falder ind under paraplywebadresse klasse C, som indeholder jdps, der kun deler J-domæne4, rekruttere Hsp70s til at udføre en række ikke-chaperoning funktioner. JDPs ' vigtige rolle som udskiftelige substrat anerkendelse "adaptorer" af Hsp70 system afspejles af en udvidelse af familiens medlemmer under Evolution. For eksempel, mennesker har over 42 forskellige JDP medlemmer4. Disse jdps fungerer som monomerer, homodimers og/eller homo/hetero oligomerer4,5. For nylig et funktionelt samarbejde via forbigående kompleksdannelse mellemklasse A (f. eks. H. sapiens DNAJA2; S. cerevisiae Ydj1) og klasse B (f. eks. H. sapiens DNAJB1; S. cerevisiae Sis1) eukaryotiske jdps blev rapporteret til at fremme effektiv anerkendelse af amorfe protein aggregater in vitro7,8. Disse blandede klasse JDP-komplekser samles formentlig på overfladen af aggregerede proteiner for at lette dannelsen af Hsp70-og Hsp70 + Hsp100-baserede protein-disaggregaser7,8,9, 10. de kritiske beviser til støtte for eksistensen af disse transitivt dannede blandede klasse JDP komplekser i eukaryote celler blev forsynet med PLA8.
PLA er i stigende grad ansat til at vurdere protein interaktioner i metazoa, primært i pattedyrceller. Her rapporterer vi den vellykkede udvidelse af denne teknik til at overvåge transitivt dannede chaperone komplekser i eukaryote og prokaryote unicellulære organismer som den spirende gær S. cerevisiae og bakterien E. coli. Vigtigere, denne ekspansion fremhæver den potentielle brug af PLA i at opdage og analysere mikrober, der inficere menneskelige og animalske celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. HeLa-celle præparat
- Forbered følgende materialer: PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM na2HPO4, 1,8 mm KH2po4), pH 7,4; DMEM suppleret med 10% FCS og 1% pen-STREP; 4% PARAFORMALDEHYD i PBS; 0,5% Triton-X100 i PBS; TBS-T (150 mM NaCl, 20 mM Tris, 0,05% Tween), pH 7,4; 0,0001% steril poly-L-lysin opløsning; 10-brønd diagnostiske slides; et fugtigt kammer silkepapir; og Coplin slide-farvning krukker.
Bemærk: For at sikre optimal fikserings effektivitet bør PARAFORMALDEHYD opløsninger tilberedes frisk før hvert eksperiment. - Forbered et fugtigt kammer ved at dække bunden af en lukket æske med vådt væv. Det fugtige kammer placeres ved 37 °C, før forsøget påbegyndes, for at sikre, at kammerets temperatur er på 37 °C, mens de enzymatiske reaktioner inkuberet.
- Kultur HeLa celler i T25 kolber, i 5 mL DMEM (høj glukose, glutamat og Natriumpyruvat suppleret) suppleret med 10% FCS og 1% pen-STREP, i en 37 °C CO2 inkubator indeholdende 5% Co2. Dissociere vedlige celler ved hjælp af 0,05% trypsin-EDTA. Efter tilsætning af frisk DMEM til dissocierede celler, tælle celler ved hjælp af en celle tælle kammer og vokse på diagnostiske slides inde i et fugtigt kammer.
- Steriliser diagnostiske slides ved UV-bestråling i en steril cellekultur hætte i 30 minutter.
- Tilsæt 100 μL sterilfiltreret 0,0001% poly-L-lysin til hver brønd, der kræves til eksperimentet. Inkuber i 30 min. vask overskydende poly-L-lysin væk ved at vaske hver brønd 3x med 50 μl ultrarent vand.
- Trypsinize HeLa cellerne og tilsæt ca. 15.000 celler til hver brønd. Hvis det er nødvendigt, fortyndes cellerne til mindst 30-50 μL DMEM pr. brønd.
- Vokse celler i et fugtigt kammer inden for en 37 °C 5% CO2 inkubator i ca. 24 h. cellerne skal være 60% – 80% konflydende, før PLA påbegyndes.
Bemærk: For høj konflughed nedsætter absorptionen af reagenser, hvilket mindsker det opnåede signal ved slutningen af protokollen. - Fjern medium ved at placere et silkepapir i kanten af brønden. Vask brønde 3x med 50 μL PBS.
Bemærk: Celler er genstand for afmontering, når væsker tilsættes hårdt. Dette kan forhindres ved ikke at lade brøndene tørre helt, før du tilføjer ny væske og ved at tilføje den nye væske forsigtigt til kanten af brønden. - Fastgør cellerne ved at tilsætte 50 μL frisklavet 4% PARAFORMALDEHYD i PBS til hver brønd. Inkuber i 10 minutter ved stuetemperatur.
- Vask slides 3x i PBS. Udfør skyller i en Coplin slide-farvning krukke indeholdende 100 mL PBS. For hver vask Inkuber du i 5 minutter ved stuetemperatur uden at ryste.
- Permeabilize cellemembranen ved at nedsænke diasene i 100 mL 0,5% Triton-X100 i PBS i et Coplin-glas-farvnings glas. Inkuber i 10 minutter ved stuetemperatur uden at ryste.
- Vask slides 3x i TBS-T. Udfør skyller i en Coplin slide-farvning krukke indeholdende 100 mL TBS-T. For hver vask Inkuber du i 5 minutter ved stuetemperatur uden at ryste.
- Efter den sidste vask, fjerne overskydende buffer med et silkepapir. På dette tidspunkt cellerne er klar til nærhed ligation assay protokol, der vil blive drøftet i afsnit 4.
2. S. cerevisiae celle præparat
- Forbered følgende materialer: 100 mM KPO4, ph 6,5, benævnt vaske buffer; 37% formaldehyd; 4% PARAFORMALDEHYD i 100 mM KPO4, ph 6,5; 1,2 M sorbitol i 100 mM KPO4, ph 6,5; lyticase opløsning (500 μg/mL lytikase, 20 mM β-mercaptoethanol, 100 mM KPO4, ph 6,5); 0,0001% poly-L-lysin opløsning; 1% Triton-X100 i 100 mM KPO4, ph 6,5; 10-brønd diagnostiske slides; et fugtigt kammer (fremstillet som i trin 1,2) silkepapir; og Coplin slide-farvning krukker.
Bemærk: For at sikre optimal fikserings effektivitet bør PARAFORMALDEHYD opløsninger tilberedes frisk før hvert eksperiment. - Vokse en overnight kultur i ikke-selektive gær ekstrakt, Peptone og dextrose (YPD) medium ved 30 °C under omrystning.
Bemærk: Afhængigt af eksperimentelle krav S. cerevisiae celler kan dyrkes i syntetisk komplet (SC) medium eller selektiv syntetisk minimal (SM) medium i stedet. - Den stationære kultur fortyndes til en OD600 af 0,1 i 20 ml medium. Cellerne vokser ved 30 °C under omrystning, indtil OD600 når 0,5.
- 20 mL-kulturen overføres til et 50 mL centrifugeglas. Pellet cellerne ved centrifugering ved 665 x g i 3 min. Fjern supernatanten. Cellerne opslæmmes i 5 mL frisk medium.
- Fastgør cellerne ved at tilsætte 550 μL 37% formaldehyd til kulturen. Inkuber ved stuetemperatur i 15 minutter.
- Pellet cellerne ved centrifugering ved 665 x g i 3 min. Fjern supernatanten. Resuspension af pellet i 1 mL frisklavet 4% PARAFORMALDEHYD i vaske buffer. Inkuber i 45 min ved stuetemperatur.
- Under inkubationen skal du forberede diagnosticerings diasene ved at tilføje 100 μL 0,01% poly-L-lysin-opløsning til hver brønd. Inkuber diasene i 30 minutter ved stuetemperatur.
- Efter 30 min, vask væk overskydende poly-L-lysin med ultrarent vand og lad glider lufttørre. De tørre slides er klar til brug.
- Vask cellerne to gange med 1 mL vaske buffer. Udfør skylning ved centrifugering af cellerne ved 665 x g i 3 min. Fjern supernatanten, og gensuspender cellerne i vaskebufferen.
- Pellet cellerne ved centrifugering ved 665 x g i 3 min. Fjern supernatanten. Cellerne opslæmmes i 1 mL 1,2 M sorbitol i vaske buffer.
- Pellet cellerne ved centrifugering ved 665 x g i 3 min. Fjern supernatanten. Resuspension af pellet i 250 μL frisk tilberedt Lyticase opløsning til at fordøje cellevæggen. Cellerne i Lyticaseopløsningen inkubates i 15 min ved 30 °C under omrystning.
- Efter fordøjelsen vaskes cellerne 3x ved centrifugering ved 665 x g i 3 minutter og fjernes supernatanten. Cellerne opslæmmes i 250 μL 1,2 M sorbitol i vaske buffer.
Bemærk: Fordi cellerne er skrøbelige efter cellevæg fordøjelsen, resuspendere dem meget omhyggeligt for ikke at beskadige cellerne. - Tilsæt 20 μL resuspenderede celler til poly-L-lysin coatede slides. Lad dem vedhæfte til diasene i 30 min. vask ikke-klædige celler væk ved at vaske brøndene 3x med 50 μL vaske buffer.
- Permeabilize cellemembranen ved at vaske 3x med 50 μL af 1% Triton-X i vaske buffer.
Bemærk: På dette tidspunkt cellerne er klar til nærhed ligering assay protokol, der vil blive drøftet i afsnit 4.
3. E. coli -celle præparat
- Forbered følgende materialer: PBS-T (140 mM NaCl, 2 mM KCl, 8 mM K2HPO4, 1,5 mm KH2po4, 0,05% Tween-20), pH 7,4; Lysozym opløsning (2 mg/ml Lysozym, 25 mm Tris-HCL pH 8,0, 50 mm glucose, 10 mm EDTA); 0,0001% poly-L-lysin opløsning; 99% iskold methanol; 99% methanol i stuetemperatur; 99% acetone; 10-brønd diagnostiske slides; et fugtigt kammer (fremstillet som i trin 1.1.1) silkepapir; og Coplin slide-farvning krukker.
- Dyrk en overnight kultur i Luria-Bertani (LB) medium ved 30 °C under omrystning.
- Den stationære kultur fortyndes til en OD600 af 0,02 i frisk lb-medium. Cellerne vokser ved 30 °C under omrystning, indtil OD600 når 0,4 for logfase celler.
- Ca. 15 min før cellerne når en OD600 af 0,4, forberede poly-L-lysin belagte slides ved at tilføje 100 μL af 0,0001% poly-l-lysin til hver brønd. Inkuber diasene i 30 minutter ved stuetemperatur.
- Efter 30 min vaske væk overskydende poly-L-lysin med ultrarent vand og lad slides lufttørre. De tørre slides er klar til brug.
- Når cellerne når en OD600 af 0,4, overføres 1 ml af kulturen til et sterilt mikrocentrifuge glas og pellet celler ved 2.650 x g i 2 min.
- Resuspendering af celler i 50 μL LB-medium.
- Fix cellerne ved at tilføje 1 mL iskold 99% methanol. Bland forsigtigt med hånden. Inkuber cellerne i 30 minutter ved-20 °C.
- Efter fiksering tilsættes 20 μL af cellerne til poly-L-lysin coatede slides. Lad slides lufttørre i 30 min.
- Tilsæt 50 μl frisk tilberedt lysozym-opløsning til hver brønd for at fordøje cellevæggen. Der inkubates i et fugtigt kammer i 30 minutter ved 25 °C.
- Fjern lysozym-opløsningen fra brøndene ved at tilføje et silkepapir til kanten af brønden. Vask slides 3x i 100 mL PBS-T. Udfør hver vask i en Coplin slide-farvning jar for 30 s, uden at ryste.
- Fjern vaskebufferen fra diasene ved at tappe på diasene på et silkepapir.
- Permeabilize cellemembranerne ved at tilføje 50 μL 99% methanol til hver brønd. Inkuber 1 min ved stuetemperatur.
- Fjern methanol ved at placere et silkepapir til kanten af brønden.
- Tilsæt 50 μL 99% acetone til hver brønd. Inkuber i 1 min.
- Fjern overskydende acetone ved at placere et silkepapir til kanten af brønden. Lad slides lufttørre. På dette tidspunkt cellerne er klar til nærhed ligering assay protokol, der vil blive drøftet i afsnit 4.
4. analyse af nærheds Ligationen
- Forbered følgende materialer: blokerende buffer; Antistof fortyndings buffer; Vaske buffer ' A ' – (10 mM Tris, 150 mM NaCl, 0,05% Tween-20) pH 7,4; Vaske buffer» B «– (200 mM Tris, 100 mM NaCl) pH 7,4; Anti-kanin sekundært antistof PLUS; Anti-mus sekundært antistof MINUS; 5x Ligations buffer; ubiquitinligase 5x forstærknings buffer (orange: λex 554 nm; λ576 nm ); polymerase ultrarent vand; og monterings medium, der indeholder DAPI.
Bemærk: PLA-detektionsreagenserne findes også i varianterne grøn (λex 495 nm;λ 527 nm ), rød (λex 594 nm; λEM 624 nm), farred (λex 644 nm ; λEM 669 nm) eller brightfield (peberrod peroxidase (HRP) konjugeret). - Bloker cellerne ved at tilføje en dråbe blokerende buffer til hver brønd. Der inkubates i 30 min ved 37 °C i et fugtigt kammer.
- Forbered antistof opløsninger ved fortynding af Stam antistoffer i antistof fortyndings buffer. For hver brønd er 40 μL antistof opløsning påkrævet.
- Fjern blokerende buffer ved at placere et silkepapir i kanten af brønden. Tilsæt 40 μL antistof fortyndet i antistof fortyndings buffer til hver brønd. Der inkubates i 60 min i et fugtigt kammer ved 37 °C eller natten over ved 4 °C.
- Fjern antistof opløsning fra brøndene ved at placere et silkepapir i kanten af brønden. Vask slides 2x i 100 mL vaske buffer ' A ' i en Coplin slide-farvning jar i 5 min, uden at ryste.
- Under vask trin, fortyndet 5x sekundære antistof sonder, anti-kanin PLUS & anti-mus MINUS (arten specificitet af sonder afhænger af de primære antistoffer anvendes), i antistof fortyndings buffer. Forbered 40 μL antistof opløsning pr. brønd.
- Tilsæt 40 μL sekundær antistof opløsning til hver brønd. Inkuber i 60 min ved 37 °C i et fugtigt kammer.
- Fjern sekundær antistof opløsning fra brøndene ved at placere et silkepapir i kanten af brønden. Vask slides 2x i 100 mL vaske buffer ' A ' i en Coplin slide-farvning jar i 5 min, uden at ryste.
- Under vaskene klargør 40 μl ligations blanding pr. brønd ved at blande 8 μl 5x ligations buffer, 31 μl ultrarent vand og 1 μl Ligase.
- Tilsæt 40 μL ligations blanding til hver brønd. Der inkubates i 30 min ved 37 °C i et fugtigt kammer.
- Fjern ligations blandingen fra brøndene ved at placere et silkepapir i kanten af brønden. Vask slides 2x i 100 mL vaske buffer ' A ' i en Coplin slide-farvning krukke i 2 min, uden at ryste.
- Under vask klargør 40 μl amplifikationsvæske pr. brønd ved at blande 8 μl 5x forstærknings opløsning, 31,5 μl ultrarent vand og 0,5 μl polymerase.
Bemærk: 5x amplificeringen indeholder fluorescerende sonder. Beskyt denne blanding mod lys. Beskyt også lysbillederne mod lys under hvert af de følgende trin. Hvis du bruger gennemskinnelig Coplin slide-farvning krukker og fugtige kamre, wrap dem i aluminiumsfolie. - Tilsæt 40 μL amplifikationblandinger pr. brønd. Inkuber i 100 min ved 37 °C i et fugtigt kammer.
- Fjern forstærknings blandingen fra brøndene. Vask slides 2x i 100 mL vaske buffer ' B ' i en Coplin slide-farvning jar i 10 min uden omrystning.
- Vask slides i 100 ml vaske buffer ' B ' fortyndet 1:100 i ultrarent vand i en coplin slide-farvning jar for 30 s.
- Tilsæt 20 μL DAPI indeholdende monterings medium pr. brønd til diasene. Luk slides med en dækseddel og forsegl slides med neglelak.
- Hvis Imaging, straks der inkuberes ved dapi indeholdende monterings medium for 10 – 15 min, mens beskyttet mod lys. Hvis ikke, skal du opbevare diasene ved-20 °C i op til 1 uge, beskyttet mod lys.
5. afsløring
- Brug confokal mikroskopi til at erhverve billeder af HeLa, S. cerevisiae og E. coli celler med henholdsvis 20x/0,8 na, 63x/1.4 na og 100X/1.4 na plan apochromat mål. Excite DNA-plettet DAPI med en 405 nm pulserende Diode Laser. For PLA signal (for denne undersøgelse) begejstre med en 561 nm solid-state laser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vores tidligere in vitro-undersøgelser med renset proteiner afslørede, at en delmængde af humane klasse A-og klasse B-Jp'er danner forbigående blandede klasse JDP-komplekser for effektivt at målrette en bred vifte af aggregerede proteiner og muligvis lette samlingen af Hsp70-baserede protein disaggregaser7. Vi har ansat PLA til at afgøre, om blandede klasse (A + B) JDP komplekser forekommer i humane cervixcancer celler (HeLa). Humane JDPs DNAJA2 (klasse A) og DNAJB1 (klasse B) var rettet mod meget specifikke primære antistoffer og sekundære PLA-sonder (figur 2a-C). Fremkomsten af rødt fluorescerende punktae indikerede tilstedeværelsen af blandede klasse DNAJA2 og DNAJB1 komplekser i HeLa celler (figur 2c) bekræfter vores tidligere biokemiske fund7. Hvert punktum repræsenterer en individuel protein interaktions hændelse i HeLa Cell cytosol/Nucleus.
Tidligere biokemiske resultater opnået fra Förster resonans energioverførsel (fret), som detekterer protein interaktioner som en aflæsning af den mængde energi, der overføres fra en spændt donor fluoroforet fastgjort til et protein til en egnet acceptor fluoroforet knyttet til det andet protein, indikerede, at lignende blandede klasse komplekser også kunne forekomme mellem gær-JDPs, in vitro8. Bekræfter vores biokemiske fund, vi observerede dannelsen af blandede klasse komplekser mellem Ydj1 (klasse A) og Sis1 (klasse B) i encellede eukaryote S. cerevisiae (bager gær) celler med PLA (figur 2F). I gær, på grund af deres lille Cellestørrelse og den kultiescens af flere punktae, de enkelte fluorescerende prikker genereret af PLA kunne ofte være mindre skelne. Et betydeligt fald i fluorescerende punktae dannelse blev observeret efter knockout eller Knockdown af interagerende JDPs i både humane og gær celler8, hvilket viser den høje specificitet af PLA i at fange disse Co-chaperone komplekser i forskellige celletyper. I modsætning til deres eukaryote modstykker, prokaryote (E. coli) jdps manglede evnen til at danne blandede klasse JDP komplekser og funktionelt samarbejde for at øge protein disaggregation, in vitro8. Efter aftale med den biokemiske analyse observerer vi ikke blandet klasse JDP kompleksdannelse mellem bakteriel DnaJ-YFP (klasse A) og CbpA-mCherry (klasse B), de eneste JDPs i E. coli (figur 2i). Men vores PLA setup var i stand til at fange andre chaperone forsamlinger involverer de to JDPs. For eksempel opdagede vi chaperone komplekser mellem DnaJ-YFP og DnaK (bakteriel Hsp70) (figur 2L) og cbpa-Mcherry og dnak8 (data ikke vist). Disse to bakterielle chaperone komplekser er udførligt karakteriseret både in vitro og in vivo8,11,12 således bekræfter vores PLA resultater. Sammen, disse observationer demonstrere evnen af PLA til robust fange transitivt dannede chaperone machineries i unicellulære/multicellulære eukaryote og Prokaryote celler. De tekniske Kontroller, der mangler et primært antistof mod en af de interagerende JDPs/Chaperones, men som indeholder både mus og kanin afledte sekundære PLA-sonder, viste kun lidt eller intet baggrunds fluorescens signal (figur 2a, B, D, E, G, H, J, K) indikerer en mangel på falsk positiv signal forstærkning i vores eksperimentelle setup.
Figur 1: skematisk gengivelse af de kronologiske trin i nærheds Ligeringtesten. (1) kompleks mellem protein A og protein B. (2) binding af primære (1 °) antistoffer (grøn og lys brun) til proteiner A og B. De to primære antistoffer skal oprejses i forskellige værtsarter (f. eks. mus, kanin eller ged). (3) primære antistoffer er anerkendt af artsspecifikke sekundære (2 °) antistoffer, der er kovalent fastgjort med DNA-oligo-Tags (PLA-sonder). (4) når proteiner A og B er i kompleks, er de bundne PLA-sonder i umiddelbar nærhed for at lette DNA-oligoserne for at hybridisere med konnektordna-tråde, hvilket resulterer i dannelsen af et cirkulært DNA-molekyle. Efterfølgende letter en DNA-ubiquitinligase sammensætning af DNA-tråde ved at katalysere dannelsen af et fosfodiesterbindinger-bånd. (5) påbegyndelse af den rullende cirkel forstærkning (RCA) af det cirkulære DNA-molekyle ved en bakteriel DNA-Polymerase ved 37 ° C. RCA-reaktionen er primet af et af de antistof-konjugeret DNA-oligo-koder. (6) generering af et enkeltstrenget koncatemerisk DNA-molekyle, der er fastgjort til et af de sekundære antistoffer. (7) hybridisering af fluorescently-mærkede komplementære oligonukleotid-sonder til en unik gentagen sekvens i det koncatemeriske DNA-molekyle. Efter hybridiserings trinnet kunne det koncatemeriske DNA-molekyle visualiseres som en lys fluorescerende prik på placeringen af det målrettede protein kompleks i faste celler. Bunden betegner de prokaryotiske og eukaryote celletyper, hvor PLA teknik er gældende. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Molekylære chaperone samlinger fanget af PLA i prokaryote og eukaryote celler. (A-C) påvisning af blandede klasse JDP KOMPLEKSER dannet mellem DNAJA2 (klasse A) og DNAJB1 (klasse B) i human livmoderhalskræft cellelinje Hela. PLA udført med (A) anti-DNAJA2 antistof alene (negativ teknisk kontrol); B) anti-DNAJB1-antistoffer alene (negativ teknisk kontrol) (C) anti-DNAJB1 og anti-DNAJA2 antistoffer sammen. Fremkomsten af flere fluorescerende prikker i panel C (positivt signal) indikerer tilstedeværelsen af protein komplekser dannet mellem DNAJA2 og DNAJB1. Hver rød fluorescerende prik/punktum repræsenterer en enkelt interaktion. Kerner (DNA) plettet med DAPI (cyan). (D-F) Påvisning af blandede klasse JDP-komplekser dannet mellem Ydj1 (klasse A) og Sis1 (klasse B) i S. cerevisiae -celler. D) PLA udført med anti-Ydj1-antistoffer alene (negativ teknisk kontrol) E) PLA udført med anti-Sis1-antistoffer alene (negativ teknisk kontrol) (F) PLA udført med anti-Ydj1 og anti-Sis1 antistoffer sammen. Det positive fluorescerende signal betegner tilstedeværelsen af Ydj1 og Sis1 komplekser i S. cerevisiae. Gærkerner farvet med DAPI (cyan). (G-L) Påvisning af chaperone-komplekser dannet mellem prokaryote Hsp70 (dnak) og jdps (dnaj og cbpa) i E. coli -celler. På grund af manglen på specifikke primære antistoffer mod prokaryotiske JDPs blev E. coli dnaj (klasse A) og cbpa (klasse B) mærket med henholdsvis Yfp og mcherry. (G, J) PLA udført med anti-YFP alene (negativ teknisk kontrol); H) PLA udført med anti-mcherry alene (negativ teknisk kontrol). (I) PLA udført med anti-yfp-og anti-mcherry-antistoffer. Manglen på fluorescerende prik dannelse indikerer ingen kompleksdannelse mellem DnaJ og CbpA. K) PLA udført med anti-dnak-antistoffer alene (negativ teknisk kontrol). (L) PLA udført med anti-yfp-og anti-dnak-antistoffer sammen. Det positive fluorescerende signal indikerer kompleksdannelse mellem DnaK og DnaJ. Bakteriel DNA farves med DAPI (cyan). Ud over at indeholde et enkelt primært antistof blev alle de negative tekniske kontroller udført under tilstedeværelse af de respektive sekundære PLA-sonder. Skala stænger = 10 μm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Co-immunoprecipitation og samlokaliserings baserede tilgange er blevet brugt som langvarige metoder til at karakterisere protein assembler. Påvisning af transitivt dannede specifikke chaperone komplekser er en stor udfordring med sådanne konventionelle metoder, og som følge heraf er tidligere resultater i vid udstrækning begrænset til kvalitative fortolkninger. Den cellelyse-baserede Co-immunoprecipitation teknikker kræver ofte Cross-Linking for at stabilisere protein-protein interaktioner. Celle lysis øger risikoen for at forstyrre transitivt dannede chaperone komplekser, mens Cross-Linking kunne introducere ikke-indfødte interaktioner, især drevet af den iboende "klæbrighed" af de fleste Chaperones. Ved analyse af Hsp70 chaperone-systemet ved hjælp af co-immunopræcipitation kunne potentielle artefakter opstå som følge af (a) høje ekspressionsniveauer for chaperone og (b) Opløselighed i forbindelse med membran-eller protein aggregat bundne chaperone-machineries. Udover, co-immunoprecipitation-baserede teknikker giver ingen oplysninger om cellulære lokalisering af de tilfangetagne protein samlinger, som kan være vigtige for afgrænsning af de tilknyttede funktioner. Ulemperne ved at bruge Co-immunoprecipitation teknikker er noget reduceret i co-lokalisering-baserede tilgange, der bevarer protein lokalisering information. Samlokaliseringen af to eller flere proteiner kunne imidlertid indikere enten direkte protein-protein Association eller opdeling af proteiner i det samme mikrodomæne i celler. Derfor er co-lokaliserings analyse i bedste fald spekulativ i forudsigelse af protein interaktioner og mangler nogen nærheds værdi. På grund af bulk og vilkårlig påvisning af de målrettede proteiner, teknikken er meget begrænset i at studere specifikke protein samlinger i celler. Dette er især problematisk, når de (t) målrettede protein (er) parallelt hermed kan danne en bred vifte af særskilte protein samlinger, som det er tilfældet med Hsp70 chaperone-systemet. Sammenlignet med disse konventionelle metoder, PLA er en mere raffineret in situ teknik udviklet til at robust opdage og kvantificere indfødte protein foreninger i celler med bevarede protein lokalisering information. En protein interaktion er afsløret af denne analyse baseret på nærhed (ca. 10-30 nm) mellem de målrettede proteiner. PLA er "tunable", idet afstanden mellem afstands afstanden kan reduceres for at opnå en strengere udaflæsning ved (a) at nedsætte længden af de oligonukleotidtags, der er knyttet til PLA-sonder, og/eller (b) at konjugere koderne direkte til primære antistoffer. Der skal udvises forsigtighed ved tolkning af et positivt PLA-signal. Ideelt set bør en protein interaktion bekræftes med to eller flere uafhængige metoder. Intensiteten af det fluorescerende signal i PLA er ikke så deterministisk relateret til protein klyngestørrelse eller separationsafstand mellem de interagerende proteiner, som det er tilfældet med FRET. Men, PLA har en høj grad af specificitet og følsomhed, og kunne endda bruges til at analysere meget lav rigelige proteiner såsom vækstfaktorer eller cytokiner og deres interaktioner i sjældne celletyper eller kliniske prøver13.
Den Hsp70 chaperone partnere med flere Co-Chaperones (f. eks, JDPs og NEFs) i sin cellulære levetid14 til at drive forskellige biologiske funktioner. Det blotte antal af sandsynlige Hsp70-JDP-NEF-maskinkonfigurationer og deres dynamiske adfærd i celler har i vid udstrækning hæmmet en detaljeret forståelse af de specifikke roller for disse chaperone-maskiner. Biologiske værktøjer, der tillader selektiv sporing af særskilte Hsp70 forsamlinger er derfor forpligtet til at dissekere den samlede ledningsføring af dette chaperone netværk i celler. De transitivt dannede JDP-JDP og JDP-Hsp70 chaperone komplekser7 blev effektivt fanget i celler med PLA, hvilket indikerer, at denne teknik er egnet til at studere molekylære interaktioner med høje dissociations konstanter (f. eks. ≫ 3 μM Kd ). Selv om, i det nuværende arbejde, analysen primært anvendes som en "ja" eller "nej" type binær indikator for chaperone interaktion, brugerne kan anvende denne teknik til at opnå semi-kvantitative udlæsninger af graden af interaktion ved digitalt tælle fluorescens signal intensiteter15. På grund af den ikke-lineære forstærkning af PLA-signalet skal der dog udvises forsigtighed ved tolkning af PLA-data på en kvantitativ måde16. På trods af de førnævnte fordele, denne metode har visse begrænsninger. En af de største ulemper ved PLA er, at analysen kræver celle fiksering således i vid udstrækning begrænser sin evne til at løse tidsmæssige dynamik protein kompleksdannelse i levende celler. Til sammenligning tillader in vivo FRET17 eller bioluminescens resonans energioverførsel (BRET)18 overvågning af lignende protein interaktioner på en rumlig tidsmæssig måde i levende celler med relativt mindre nærheds værdier (< 10 nm). I modsætning til PLA, et FRET signal udviser en streng lineær korrelation med protein ekspression niveauer16 gør fret guldstandarden i kvantitativ analyse af protein interaktioner. Men i modsætning til FRET afhængighed af den gådefulde orienterings faktor κ2påvirkes PLA ikke af RETNINGEN af PLA-sonder, hvilket øger sandsynligheden for at fange et protein kompleks19. Med hensyn til brugervenlighed kræver FRET og BRET en unik ekspertise, hvilket generelt begrænser tilgængeligheden af disse metoder til det bredere forskersamfund. Yderligere, begge disse teknikker kræver modifikation af de interagerende proteiner ved at vedhæfte voluminøse luminescerende/fluorescerende protein Tags, der potentielt kunne forstyrre protein funktion og kompleksdannelse.
Følgende trin (1-4) kræver omhyggelig overvejelse for en vellykket gennemførelse af PLA i celler. (1) valg af antistof: det kommercielt tilgængelige PLA-kit er kun kompatibelt med primære antistoffer, der er opvokset mod mus, kanin og ged. PLA kræver meget specifikke primære antistoffer, der ikke binder til off-mål. Derudover er det vigtigt at udvælge primære antistoffer, der er kompatible med applikationer såsom Immunhistokemi (IHC), enzym relateret immunosorbent assay (ELISA) og/eller immunopræcipitation (IP) for at sikre, at antistofferne kan genkende antigene aminosyresekvenser, som eksponeres på overfladen af foldede proteiner. Før brug anbefales det stærkt at teste alle primære antistoffer for deres specificitet. Dette kan udføres via Western blot analyse af hele celle lysates. I tilfælde, hvor de målrettede proteiner har homologer med små variationer i størrelse og sekvens lighed (f. eks. Hsp70 og JDP paralogs), kan de specifikke antistoffer testes med gen-Knockdown/knockout-tilgange eller ved sondering mod renset homologer til at udelukke enhver potentiel kryds genkendelse. Hvis der ikke findes egnede antistoffer, kan de målrettede proteiner mærkes med epitoper, der har antistoffer af acceptabel kvalitet (Figur 2F). (2) fiksering og permeabilisering af celler: en behandling af 4% PARAFORMALDEHYD og 0,1-0,5% Triton-X100 kan anvendes til at fastsætte og permeabilize celler, hhv. Brugen af 4% PARAFORMALDEHYD er en bedre behandling for at bevare protein-protein interaktioner og cellulære ultrastruktur sammenlignet med fikative betingelser beskæftiger 99% methanol20,21,22. Fastsættelse af celler med 99% methanol, giver dog mindre cytoplasmisk baggrund farvning, og måske er mere egnet til specifikke tilfælde såsom påvisning af cytoskelet associerede protein samlinger21,22. Effektiv permeabilisering af både plasma membranen og organelle membraner for at øge antistof tilgængelighed kunne opnås med non-ionisk overfladeaktivt stof Triton-X100. Triton-X100 kan dog ikke specifikt fjerne proteiner fra plasma membranen23,24. Derfor, til analyse af protein samlinger forbundet med cellemembraner, alternative rengøringsmidler såsom saponin eller digitonin, der er rettet mod steroler til permeabilize membraner kunne anvendes21,22,25. (3) afbrydelse af cellevæggen: før membran permeabilisering er der behov for et yderligere trin, som involverer specifikke lytiske enzymer for at øge gennemtrængelighed af antistoffer i celletyper med cellevægge (f. eks. svampe, plante-og bakterieceller). For eksempel beskæftigede vi lyticase, som nedbryder β-glucan for at forstyrre cellevæggenS. cerevisiae26. På samme mådeE. colicellevæg blev forstyrret ved hjælp af Lysozym, et enzym, der er rettet mod peptidoglycans27,28. Cellevæggens sammensætning og lytisk enzym følsomhed varierer med forskellige vækstbetingelser26og kultur Confluence29,30. Derfor kan koncentrationen af de lytiske enzymer og fordøjelsestiderne variere, og der skal udvises forsigtighed for at forhindre over-eller under fordøjelse af celler. Efter cellevæggen fordøjelsen, cellerne er relativt skrøbelige og kræver fortrængning agenter såsom sorbitol for dem at forblive intakt under vaske trinene. (4) DNA-forstærkning: DNA-ligationen og den rullende cirkels PCR-reaktionstrin er følsomme over for temperatur-og fugtigheds udsving. For at sikre en robust DNA-forstærkning og reproducerbarhed af analysen skal disse reaktioner udføres ved 37 °C i et fugtighedskammer. Det er vigtigt, at de indkøbede celler forhindres i at tørre ud, mens de udfører analysen for at undgå ikke-specifik antistof binding og DNA-amplifikationhændelser, der kan føre til en øget baggrunds signal.
Alt taget i betragtning, gennemførelsen af denne analyse kræver ikke unik ekspertise og sofistikeret instrumentering. Den vellykkede overvågning af JDP-JDP og JDP-Hsp70 chaperone komplekser illustrerer den potentielle anvendelse af denne teknik til at spore transitivt dannede protein samlinger i alle celletyper. Vores implementering af teknikken i gær og bakterier øger anvendeligheden af PLA til at studere forskellige biologiske processer medieret af særskilte protein samlinger i en bred vifte af organismer. Desuden fremhæver vores arbejde PLA som et lovende nyt protein interaktions værktøj til at studere evolutionære ændringer, der forekommer på molekylært niveau på tværs af arter8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
NBN er understøttet af en særlig rekruttering tilskud fra Monash University Faculty of Medicine Nursing and Health Sciences med støtte fra staten regeringen i Victoria og den australske regering. Vi takker Bernd Bukau (ZMBH, Heidelberg Universitet, Tyskland) og harm H. Kampinga (Institut for biomedicinsk videnskab i celler & systemer, universitetet i Groningen, Nederlandene) for deres uvurderlige støtte og deling af reagenser, Holger Lorenz (ZMBH Imaging Facility, Heidelberg Universitet, Tyskland) for hans støtte med confokal mikroskopi og billedbehandling, og Claire Hirst (ARMI, Monash University, Australien) til kritisk læsning af manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 37% Formaldehyde | Merck | 103999 | |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 32201 | |
| anti-DNAJA2 antibody | Abcam | ab157216 | |
| anti-DNAJB1 Antibody | Enzo Life Sciences | ADI-SPA-450 | |
| anti-DnaK antibody | In house | ||
| anti-mCherry antibody | Abcam | ab125096 | |
| anti-Sis1 Antibody | Cosmo Bio Corp | COP-080051 | |
| anti-Ydj1 antibody | StressMarq Biosciences | SMC-150, | |
| anti-YFP antibody | In house | ||
| Coplin slide-staining jar | Sigma-Aldrich | S5516 | |
| Diagnostic slides | Marienfeld | 1216530 | |
| DMEM | Thermo-Fischer | 31966021 | |
| DuoLink In Situ Detection Reagents Orange | Sigma-Aldrich | DUO92007 | |
| DuoLink In Situ Mounting Medium + DAPI | Sigma-Aldrich | DUO82040 | |
| DuoLink In Situ PLA Probe Anti-Mouse MINUS | Sigma-Aldrich | DUO92004 | |
| DuoLink In Situ PLA Probe Anti-Rabbit PLUS | Sigma-Aldrich | DUO92002 | |
| DuoLink In Situ Wash Buffers, Fluorescence | Sigma-Aldrich | DUO82049 | |
| Fetal Calf Serum | Thermo-Fischer | 10082147 | |
| Lysozyme | Sigma-Aldrich | 62971 | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 32213 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo-Fischer | 15070063 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma-Aldrich | P47-07 | |
| Sorbitol | Sigma-Aldrich | S7547 | |
| Triton-X100 | Merck | 108643 | |
| Trypsin | Thermo-Fischer | 25300096 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Zymolase 100T / / Lyticase | United States Biological | Z1004 |
References
- Soderberg, O., et al. Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation. Nature Methods. 3 (12), 995-1000 (2006).
- Weibrecht, I., et al. Proximity ligation assays: a recent addition to the proteomics toolbox. Expert Review of Proteomics. 7 (3), 401-409 (2010).
- Mayer, M. P., Gierasch, L. M. Recent advances in the structural and mechanistic aspects of Hsp70 molecular chaperones. Journal of Biological Chemistry. 294 (6), 2085-2097 (2019).
- Kampinga, H. H., Craig, E. A. The HSP70 chaperone machinery: J proteins as drivers of functional specificity. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11 (8), 579-592 (2010).
- Nillegoda, N. B., Bukau, B. Metazoan Hsp70-based protein disaggregases: emergence and mechanisms. Frontiers in Molecular Biosciences. 2, (2015).
- Bracher, A., Verghese, J. The nucleotide exchange factors of Hsp70 molecular chaperones. Frontiers in Molecular Biosciences. 2, (2015).
- Nillegoda, N. B., et al. Crucial HSP70 co-chaperone complex unlocks metazoan protein disaggregation. Nature. 524 (7564), 247-251 (2015).
- Nillegoda, N. B., et al. Evolution of an intricate J-protein network driving protein disaggregation in eukaryotes. Elife. 6, (2017).
- Kirstein, J., et al. In vivo properties of the disaggregase function of J-proteins and Hsc70 in Caenorhabditis elegans stress and aging. Aging Cell. 16 (6), 1414-1424 (2017).
- Nillegoda, N. B., Wentink, A. S., Bukau, B.
- Chae, C., Sharma, S., Hoskins, J. R., Wickner, S. CbpA, a DnaJ homolog, is a DnaK co-chaperone, and its activity is modulated by CbpM. Journal of Biological Chemistry. 279 (32), 33147-33153 (2004).
- Kityk, R., Kopp, J., Mayer, M. P. Molecular Mechanism of J-domain-Triggered ATP Hydrolysis by Hsp70 Chaperones. Molecular Cell. 69 (2), 227-237 (2018).
- Söderberg, O., et al. Characterizing proteins and their interactions in cells and tissues using the in situ proximity ligation assay. Methods. 45 (3), 227-232 (2008).
- Benschop, J. J., et al. A consensus of core protein complex compositions for Saccharomyces cerevisiae. Molecular Cell. 38 (6), 916-928 (2010).
- Jung, J., et al. Quantifying RNA-protein interactions in situ using modified-MTRIPs and proximity ligation. Nucleic Acids Research. 41 (1), (2013).
- Mocanu, M. M., Váradi, T., Szöllosi, J., Nagy, P. Comparative analysis of fluorescence resonance energy transfer (FRET) and proximity ligation assay (PLA). Proteomics. 11 (10), 2063-2070 (2011).
- Sekar, R. B., Periasamy, A. Fluorescence resonance energy transfer (FRET) microscopy imaging of live cell protein localizations. Journal of Cell Biology. 160 (5), 629-633 (2003).
- Deriziotis, P., Graham, S. A., Estruch, S. B., Fisher, S. E. Investigating protein-protein interactions in live cells using bioluminescence resonance energy transfer. Journal of Visualized Experiments. 87, (2014).
- Nagy, P., Szöllosi, J. Proximity or no proximity: that is the question – but the answer is more complex. Cytometry. 75 (10), 813-815 (2009).
- Hoetelmans, R. W., et al. Effects of acetone, methanol, or paraformaldehyde on cellular structure, visualized by reflection contrast microscopy and transmission and scanning electron microscopy. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 9 (4), 346-351 (2001).
- Schnell, U., Dijk, F., Sjollema, K. A., Giepmans, B. N. Immunolabeling artifacts and the need for live-cell imaging. Nature Methods. 9 (2), 152-158 (2012).
- Stadler, C., Skogs, M., Brismar, H., Uhlen, M., Lundberg, E. A single fixation protocol for proteome-wide immunofluorescence localization studies. Journal of Proteomics. 73 (6), 1067-1078 (2010).
- Goldenthal, K. L., Hedman, K., Chen, J. W., August, J. T., Willingham, M. C. Postfixation detergent treatment for immunofluorescence suppresses localization of some integral membrane proteins. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 33 (8), 813-820 (1985).
- Schrader, M., Almeida, M., Grille, S. Postfixation detergent treatment liberates the membrane modelling protein Pex11beta from peroxisomal membranes. Histochemistry & Cell Biology. 138 (3), 541-547 (2012).
- Willingham, M. C., Yamada, S. S., Pastan, I. Ultrastructural antibody localization of alpha2-macroglobulin in membrane-limited vesicles in cultured cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 75 (9), 4359-4363 (1978).
- Aguilar-Uscanga, B., Francois, J. M. A study of the yeast cell wall composition and structure in response to growth conditions and mode of cultivation. Letters in Applied Microbiology. 37 (3), 268-274 (2003).
- Romaniuk, J. A., Cegelski, L. Bacterial cell wall composition and the influence of antibiotics by cell-wall and whole-cell NMR. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 370, 1679 (2015).
- Salazar, O., Asenjo, J. A.
- Cunningham, A. F., Spreadbury, C. L. Mycobacterial stationary phase induced by low oxygen tension: cell wall thickening and localization of the 16-kilodalton alpha-crystallin homolog. Journal of Bacteriology. 180 (4), 801-808 (1998).
- Werner-Washburne, M., Braun, E., Johnston, G. C., Singer, R. A. Stationary phase in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Microbiological Reviews. 57 (2), 383-401 (1993).
