Summary
Cognate J-Domain eiwitten werken samen met de Hsp70 chaperonne om te helpen bij een groot aantal biologische processen, variërend van eiwit vouwen tot afbraak. Hier beschrijven we een in-situ proximity ligatie test, die het mogelijk maakt om deze transitieve gevormde chaperonne machinerie in bacteriële, gist en menselijke cellen te monitoren.
Abstract
J-Domain proteïnen (JDPs) vormen de grootste en meest diverse co-Chaperone familie in eukaryote cellen. Uit recente bevindingen blijkt dat specifieke leden van de JDP-familie voorbijgaande heterocomplexen in eukaryoten kunnen vormen om de substraat keuze voor de 70 kDa-warmteshock proteïne (Hsp70) chaperongebaseerde eiwit disaggregassen te verfijnen. De JDP-complexen richten op acute/chronische stress geïnduceerde geaggregeerde eiwitten en helpen vermoedelijk de disaggregassen samen te stellen door meerdere Hsp70s aan het oppervlak van eiwit aggregaten te rekruteren. De omvang van het door deze fysiek werkende JDPs gevormde netwerk van eiwit kwaliteitscontrole (PQC) blijft in vivo grotendeels onkarakteriseerd. Hier beschrijven we een microscopie gebaseerde in-situ proteïne-interactie test genaamd de Proximity ligatie assay (PLA), die in staat is om deze transitieve gevormde chaperonne-complexen robuust te vangen in verschillende cellulaire compartimenten van eukaryotische cellen. Ons werk breidt de tewerkstelling van Pla uit menselijke cellen naar gist (Saccharomyces cerevisiae) en bacteriën (Escherichia coli), waardoor een belangrijk instrument om de dynamiek van tijdelijk gevormde eiwit assemblages in beide prokaryotische en eukaryote cellen.
Introduction
Een enorme hoeveelheid genomische informatie blijft oninterpreteerbaar vanwege ons onvolledige begrip van cellulaire interactomes. Conventionele eiwit-eiwit interactie detectie methodieken zoals eiwit co-immunoprecipitatie met/zonder chemische cross-linking en eiwit co-lokalisatie, hoewel op grote schaal gebruikt, vormen een scala aan nadelen. Enkele van de belangrijkste nadelen zijn een slechte kwantificering van de interacties en de potentiële introductie van niet-inheemse bindende gebeurtenissen. Ter vergelijking, opkomende proximity-gebaseerde technieken bieden een alternatief en een krachtige aanpak voor het vastleggen van eiwit interacties in cellen. De Proximity ligatie test (PLA)1, nu beschikbaar als een gepatenteerde Kit, gebruikt antilichamen om specifiek te richten op eiwitcomplexen op basis van de nabijheid van de interagerende subeenheden.
PLA wordt geïnitieerd door de vorming van een steiger bestaande uit primaire en secundaire antilichamen met kleine DNA-Tags (PLA-sondes) op het oppervlak van het gerichte proteïne complex (Figuur 1, stappen 1-3). Vervolgens wordt, bepaald door de nabijheid van de DNA-Tags, een circulair DNA-molecuul gegenereerd via hybridisatie met connector oligonucleotiden (Figuur 1, stap 4). De vorming van het cirkelvormige DNA wordt aangevuld door een DNA-ligatie stap. Het nieuw gevormde cirkelvormige stukje DNA fungeert als een sjabloon voor de daaropvolgende Rolling Circle Amplification (RCA)-gebaseerde polymerase kettingreactie (PCR) geprimed door een van de geconjugeerde oligonucleotide-Tags. Dit genereert een enkel-streng concatemeric DNA-molecuul verbonden aan het eiwit complex via de antilichaam steiger (Figuur 1, stap 6). Het concatemeric DNA molecuul wordt gevisualiseerd met behulp van fluorescently gelabelde oligonucleotiden die hybridiseren tot meerdere unieke sequenties verspreid over het versterkte DNA (Figuur 1, stap 7)2. Het gegenereerde PLA-signaal, dat verschijnt als een fluorescerende stip (Figuur 1, stap 7), komt overeen met de locatie van het gerichte eiwit complex in de cel. Als gevolg hiervan zou de assay eiwitcomplexen met een hoge ruimtelijke nauwkeurigheid kunnen detecteren. De techniek is niet beperkt tot het simpelweg vastleggen van eiwit interacties, maar kan ook worden gebruikt om enkelvoudige moleculen of eiwit modificaties op eiwitten met hoge gevoeligheid1,2tedetecteren.
Hsp70 vormt een zeer veelzijdig chaperonne-systeem dat fundamenteel belangrijk is voor het behoud van cellulaire eiwit homeostase door deel te nemen aan een scala aan huishoudelijke en stress-geassocieerde functies. Huishoudelijke activiteiten van het Hsp70 chaperonne-systeem omvatten de Novo-eiwit vouwen, eiwit translocatie over cellulaire membranen, assemblage en demontage van eiwitcomplexen, regulering van de eiwit activiteit en het koppelen van verschillende eiwit vouwen/ machinerie voor kwaliteitscontrole3. Hetzelfde chaperonne-systeem revouwt ook verkeerd gevouwen/ongevouwen eiwitten, voorkomt eiwit aggregatie, bevordert eiwit uitsplitsing en werkt samen met cellulaire proteasen om terminaal misgevouwen/beschadigde eiwitten te degraderen om cellulaire reparatie te vergemakkelijken na proteotoxische spanningen4,5. Om deze functionele diversiteit te bereiken, vertrouwt de Hsp70 chaperonne op samenwerking tussen co-chaperones van de JDP-familie en nucleotide-uitwisselings factoren (Nef's) die de Hsp70's ATP-afhankelijke allosterische controle van substraat binding en release3verfijnen, 6. Verder spelen de co-chaperonen van het JDP een cruciale rol bij het selecteren van substraten voor dit veelzijdige chaperonne-systeem. Leden van deze familie zijn onderverdeeld in drie klassen (A, B en C) op basis van hun structurele homologie aan het prototype JDP, de E. coli dnaJ. Klasse A jdps bevatten een N-Terminal J-domein, dat samenwerkt met Hsp70, een rijke Glycine-fenylalanine regio, een substraat bindende regio bestaande uit een zink vinger-achtige regio (zflr) en twee β-Barrel domeinen, en een C-terminale door dimerisatie domein. JDPs met een N-Terminal J-domein en een rijk Glycine-fenylalanine, maar zonder de ZFLR, vallen in klasse B. In het algemeen zijn de leden van deze twee klassen betrokken bij de chaperoning-functies. Leden die vallen onder de catchall klasse C, die JDPs bevat die alleen de J-domain4delen, rekruteren Hsp70s om een verscheidenheid aan niet-chaperoning-functies uit te voeren. De belangrijke rol van JDPs als verwisselbare substraat herkenning "adaptors" van het Hsp70 systeem wordt weerspiegeld door een uitbreiding van de familieleden tijdens de evolutie. Mensen hebben bijvoorbeeld meer dan 42 verschillende JDP-leden4. Deze jdps functioneren als monomeren, homodimers en/of homo/hetero oligomeren4,5. Onlangs een functionele samenwerking via tijdelijke complexe formatie tussen klasse A (bijv. H. sapiens DNAJA2; S. cerevisiae Ydj1) en klasse B (bijv. H. sapiens DNAJB1; S. cerevisiae Sis1) eukaryotische jdps werd gemeld ter bevordering van de efficiënte herkenning van amorfe eiwit aggregaten in vitro7,8. Deze gemengde jdp-complexen worden vermoedelijk op het oppervlak van geaggregeerde eiwitten gemonteerd om de vorming van Hsp70-en Hsp70 + Hsp100-gebaseerde eiwit disaggregassen7,8,9, 10. het kritische bewijs ter ondersteuning van het bestaan van deze transitieve gevormde gemengde jdp-complexen in eukaryote cellen was voorzien van Pla8.
PLA wordt in toenemende mate gebruikt voor het beoordelen van eiwit interacties in Metazoa, voornamelijk in zoogdiercellen. Hier rapporteren we de succesvolle uitbreiding van deze techniek om transitieve gevormde chaperonne-complexen in eukaryotische en prokaryotische unicellulaire organismen te monitoren, zoals de ontluikende gist S. cerevisiae en de bacterie E. coli. Belangrijk is dat deze uitbreiding het potentiële gebruik van PLA benadrukt bij het opsporen en analyseren van microben die menselijke en dierlijke cellen besmetten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. voorbereiding van de HeLa-cel
- Bereid de volgende materialen voor: PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM na2HPO4, 1,8 mm KH2po4), pH 7,4; DMEM, aangevuld met 10% FCS en 1% pen-Strep; 4% Paraformaldehyde in PBS; 0,5% Triton-X100 in PBS; TBS-T (150 mM NaCl, 20 mM Tris, 0,05% tween), pH 7,4; 0,0001% steriele poly-L-lysine oplossing; 10-well diagnostische dia's; een vochtige kamer; papieren zakdoekje; en Coplin glij-kleurings potten.
Opmerking: Om een optimale fixatie-efficiëntie te garanderen, moeten Paraformaldehyde-oplossingen vóór elk experiment vers worden bereid. - Maak een vochtige kamer door de onderkant van een gesloten doos met natte weefsels te bedekken. Plaats de vochtige kamer bij 37 °C voordat u met het experiment begint, om er zeker van te zijn dat de kamertemperatuur bij 37 °C ligt, terwijl de enzymatische reacties worden geïnbeend.
- Kweek HeLa cellen in T25 kolven, in 5 mL DMEM (hoge glucose, glutamaat en Natriumpyruvaat aangevuld) aangevuld met 10% FCS en 1% pen-STREP, in een 37 ° c CO2 incubator met 5% Co2. Dissociate aanhandige cellen met 0,05% trypsine-EDTA. Na toevoeging van verse DMEM aan gedisiteerde cellen, tellen cellen met behulp van een cel telkamer en groeien op diagnostische dia's in een vochtige kamer.
- Steriliseren diagnostische dia's door UV-bestraling in een steriele celkweek gedurende 30 minuten.
- Voeg 100 μL steriele gefilterde 0,0001% poly-L-lysine toe aan elk goed dat nodig is voor het experiment. Inincuberen gedurende 30 min. Spoel overtollige poly-L-lysine weg door elke goed 3x te wassen met 50 μL ultrapuur water.
- Trypsinize de HeLa cellen en voeg ongeveer 15.000 cellen aan elk goed. Verdun zo nodig de cellen tot ten minste 30-50 μL DMEM per put.
- Kweekcellen in een vochtige kamer binnen een incubator van 37 °C 5% CO2 gedurende ongeveer 24 uur. cellen moeten 60% – 80% Confluent Health zijn voordat de Pla begint.
Opmerking: Een te hoge confluentie vermindert de absorptie van reagentia, waardoor het verkregen signaal aan het einde van het protocol afneemt. - Verwijder het medium door een tissuepapier aan de rand van de put te plaatsen. Was Wells 3x met 50 μL PBS.
Opmerking: Cellen kunnen worden losgekoppeld wanneer vloeistoffen hard worden toegevoegd. Dit kan worden voorkomen door de putjes niet volledig te laten drogen voordat nieuwe vloeistof wordt toegevoegd en door de nieuwe vloeistof zachtjes aan de rand van de put toe te voegen. - Repareer cellen door elke put 50 μL vers bereide 4% Paraformaldehyde in PBS toe te voegen. Incuberen gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
- Was dia's 3x in PBS. Voer wasmiddelen uit in een Coplin-kleurings potje met 100 mL PBS. Voor elke wasbeurt, incuberen gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur zonder schudden.
- Permeabilize de celmembraan door het samenvoegen van de dia's in 100 mL 0,5% Triton-X100 in PBS in een Coplin Slide-kleuring jar. Incuberen gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur zonder te schudden.
- Spoel de glijbanen 3x in TBS-T. Voer spoelingen uit in een Coplin-kleurpot met 100 mL TBS-T. Voor elke wasbeurt, incuberen gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur zonder schudden.
- Verwijder na de laatste wasbeurt overtollige buffer met een tissuepapier. Op dit punt zijn de cellen klaar voor het nabijheids Ligatie-assay protocol dat zal worden besproken in rubriek 4.
2. S. cerevisiae voorbereiding van de cel
- Bereid de volgende materialen voor: 100 mM KPO4, pH 6,5, aangeduid als Wash buffer; 37% formaldehyde; 4% Paraformaldehyde in 100 mM KPO4, pH 6,5; 1,2 M sorbitol in 100 mM KPO4, pH 6,5; lyticase oplossing (500 μg/mL lyticase, 20 mM β-mercaptoethanol, 100 mM KPO4, pH 6,5); 0,0001% poly-L-lysine oplossing; 1% Triton-X100 in 100 mM KPO4, pH 6,5; 10-well diagnostische dia's; een vochtige kamer (bereid zoals in stap 1,2); papieren zakdoekje; en Coplin glij-kleurings potten.
Opmerking: Om een optimale fixatie-efficiëntie te garanderen, moeten Paraformaldehyde-oplossingen vóór elk experiment vers worden bereid. - Kweek een nachtelijke cultuur in niet-selectief gist extract, Peptone en dextrose (YPD) medium bij 30 °C tijdens het schudden.
Opmerking: Afhankelijk van de experimentele eisen kunnen S. cerevisiae cellen in plaats daarvan worden gekweekt in synthetisch compleet (SC) medium of selectief synthetisch minimal (SM) medium. - Verdun de stationaire cultuur tot een OD600 van 0,1 in 20 ml medium. Kweek de cellen bij 30 °C terwijl u schudt totdat de OD600 0,5 bereikt.
- Breng de 20 mL cultuur over naar een centrifugebuis van 50 mL. Pellet de cellen door centrifugeren bij 665 x g gedurende 3 min. Verwijder het supernatant. Respendeer de cellen in 5 mL vers medium.
- Bevestig de cellen door 550 μL 37% formaldehyde toe te voegen aan de kweek. Incuberen bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten.
- Pellet de cellen door centrifugeren bij 665 x g gedurende 3 min. Verwijder het supernatant. Rebreng de pellet in 1 mL vers bereide 4% Paraformaldehyde in de Wasbuffer. Incuberen voor 45 min bij kamertemperatuur.
- Bereid tijdens de incubatie de diagnostische dia's voor door elke put 100 μL 0,01% poly-L-lysine-oplossing toe te voegen. Inbroed de glaasjes gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
- Spoel na 30 minuten overtollige poly-L-lysine weg met ultrapuur water en laat de dia's lucht drogen. De droge glijbanen zijn klaar voor gebruik.
- Was de cellen tweemaal met 1 mL Wasbuffer. Voer wasmiddel uit door centrifugeren van de cellen bij 665 x g gedurende 3 min. Verwijder de supernatant en regeer de cellen in de wasbuffer.
- Pellet de cellen door centrifugeren bij 665 x g gedurende 3 min. Verwijder het supernatant. Respendeer de cellen in 1 mL van 1,2 M sorbitol in de Wasbuffer.
- Pellet de cellen door centrifugeren bij 665 x g gedurende 3 min. Verwijder het supernatant. Rebreng de pellet in 250 μL vers bereide Lyticase oplossing om de celwand te verteren. Inbroed de cellen in Lyticase oplossing gedurende 15 minuten bij 30 °C tijdens het schudden.
- Na de spijsvertering, spoel cellen 3x door centrifugeren bij 665 x g gedurende 3 minuten en verwijder het supernatant. Respendeer de cellen in 250 μL van 1,2 M sorbitol in de Wasbuffer.
Opmerking: Omdat cellen fragiel zijn na de vertering van de celwand, moeten ze zeer zorgvuldig worden doorbesteed om de cellen niet te beschadigen. - Voeg 20 μL geresuspendeerde cellen toe aan de dia's met poly-L-lysine coating. Laat ze gedurende 30 minuten aan de glaasjes bevestigen. Spoel niet-aanhandige cellen weg door de Wells 3x te wassen met 50 μL Wasbuffer.
- Permeabiliseer het celmembraan door 3x te wassen met 50 μL van 1% Triton-X in de Wasbuffer.
Opmerking: Op dit punt zijn de cellen klaar voor het nabijheids ligatie-assay protocol dat zal worden besproken in rubriek 4.
3. E. coli cel preparaat
- Bereid de volgende materialen voor: PBS-T (140 mM NaCl, 2 mM KCl, 8 mM K2HPO4, 1,5 mm KH2po4, 0,05% Tween-20), pH 7,4; lysozym oplossing (2 mg/ml lysozym, 25 mm tris-HCl pH 8,0, 50 mm glucose, 10 mm EDTA); 0,0001% poly-L-lysine oplossing; 99% ijskoude methanol; 99% kamertemperatuur methanol; 99% aceton; 10-well diagnostische dia's; een vochtige kamer (bereid zoals in stap 1.1.1); papieren zakdoekje; en Coplin glij-kleurings potten.
- Kweek een nachtelijke cultuur in Luria-Bertani (LB) medium bij 30 °C tijdens het schudden.
- Verdun de stationaire cultuur tot een OD600 van 0,02 in vers lb medium. Kweek de cellen bij 30 °C terwijl u schudt totdat de OD600 0,4 voor log fase cellen bereikt.
- Ongeveer 15 minuten voordat cellen een OD600 van 0,4 bereiken, bereiden poly-l-lysine gecoate dia's door toe te voegen 100 μL 0,0001% poly-L-lysine aan elk goed. Inbroed de glaasjes gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
- Na 30 minuten wassen overtollige poly-L-lysine met ultrapuur water en laat dia's lucht drogen. De droge glijbanen zijn klaar voor gebruik.
- Wanneer de cellen een OD600 van 0,4 bereiken, breng dan 1 ml van de cultuur over naar een steriele micro centrifugebuis en pelletcellen bij 2.650 x g gedurende 2 minuten.
- Respendeer cellen in 50 μL LB medium.
- Repareer cellen door 1 mL ijskoude 99% methanol toe te voegen. Meng heel voorzichtig met de hand. Incuberen cellen gedurende 30 min bij-20 °C.
- Na fixatie Voeg 20 μL van de cellen toe aan de poly-L-lysine gecoate dia's. Laat de dia's 30 minuten drogen.
- Voeg 50 μL vers bereide lysozym oplossing toe aan elk goed om de celwand te verteren. Inincuberen in een vochtige kamer gedurende 30 minuten bij 25 °C.
- Verwijder de lysozym oplossing uit de putjes door een tissuepapier aan de rand van de put toe te voegen. Spoel de glijbanen 3x in 100 mL PBS-T. Voer elke wasbeurt in een Coplin Slide-kleurpot voor 30 s, zonder te schudden.
- Verwijder de reinigings buffer van de dia's door op de dia's op een tissuepapier te tikken.
- Permeabilize de celmembranen door toevoeging van 50 μL 99% methanol aan elke put. Incuberen gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur.
- Verwijder methanol door een tissuepapier op de rand van de put te plaatsen.
- Voeg 50 μL 99% aceton toe aan elk goed. Incuberen gedurende 1 min.
- Verwijder overtollig aceton door een tissuepapier op de rand van de put te plaatsen. Laat dia's naar de lucht drogen. Op dit punt zijn de cellen klaar voor het nabijheids ligatie-assay protocol dat zal worden besproken in rubriek 4.
4. Ligatie test bij nabijheid
- Bereid de volgende materialen voor: blokkerende buffer; Antilichaam verdunnings buffer; Wasbuffer ' A ' – (10 mM Tris, 150 mM NaCl, 0,05% Tween-20) pH 7,4; Wasbuffer ' B ' – (200 mM Tris, 100 mM NaCl) pH 7,4; Anti-konijn secundair antilichaam PLUS; Anti-muis secundair antilichaam MINUS; 5x Ligatie buffer; Ligase 5x versterkings buffer (oranje: λex 554 nm; λem 576 nm); polymerase ultrapuur water; en het afdekmedium dat DAPI bevat.
Opmerking: de PLA-detectie reagentia zijn ook beschikbaar in de varianten groen (λ ex 495 Nm;λ em 527 nm), rood (λex 594 nm; λem 624 nm), verroerd (λex 644 nm; λem 669 nm) of brightfield (mierikswortelperoxidase (HRP) geconjugeerd). - Blokkeer de cellen door een druppel blokkerende buffer toe te voegen aan elk goed. Inincuberen gedurende 30 minuten bij 37 °C in een vochtige kamer.
- Bereid antilichaam oplossingen in door de antilichamen in de antilichaam verdunnings buffer te verdunnen. Voor elk goed is 40 μL antilichaam oplossing nodig.
- Verwijder de blokkerende buffer door een tissuepapier aan de rand van de put te plaatsen. Voeg toe 40 μL antilichaam verdund in de antilichaam verdunnings buffer aan elke put. Inbroed voor 60 min in een vochtige kamer bij 37 °C of 's nachts bij 4 °C.
- Verwijder de antilichaam oplossing uit de putjes door een tissuepapier aan de rand van de put te plaatsen. Wash schuift 2x in 100 mL Wasbuffer ' A ' in een Coplin Slide-kleurende pot gedurende 5 minuten, zonder te schudden.
- Tijdens de wasstappen verdunnen 5x secundaire antilichaam sondes, anti-konijn PLUS & anti-muis MINUS (de specificiteit van de sondes hangt af van de gebruikte primaire antilichamen) in de antilichaam verdunnings buffer. Bereid 40 μL antilichaam oplossing per put.
- Voeg aan elke put 40 μL secundaire antilichaam oplossing toe. Inincuberen voor 60 min bij 37 °C in een vochtige kamer.
- Verwijder de secundaire antilichaam oplossing uit de putjes door een tissuepapier aan de rand van de put te plaatsen. Wash schuift 2x in 100 mL Wasbuffer ' A ' in een Coplin Slide-kleurende pot gedurende 5 minuten, zonder te schudden.
- Tijdens de wassing bereiden 40 μL ligatie mengsel per put, door het mengen van 8 μL 5x Ligatie buffer, 31 μL ultrapuur water en 1 μL ligase.
- Voeg aan elke put 40 μL ligatie mengsel toe. Inincuberen gedurende 30 minuten bij 37 °C in een vochtige kamer.
- Verwijder het ligatie mengsel van de putjes door een tissuepapier aan de rand van de put te plaatsen. Wash schuift 2x in 100 mL Wasbuffer ' A ' in een Coplin Slide-kleurpot voor 2 min, zonder te schudden.
- Maak tijdens de wasses 40 μL versterkings mengsel per put, door 8 μL 5x versterkings oplossing, 31,5 μL ultrapuur water en 0,5 μL polymerase te mengen.
Opmerking: De 5x versterking bevat fluorescerende sondes. Bescherm dit mengsel tegen licht. Bescherm de dia's ook tegen licht tijdens elk van de volgende stappen. Bij het gebruik van doorschijnende Coplin Slide-kleuring potten en vochtige kamers, wikkel ze in aluminiumfolie. - Voeg per put 40 μL amplificatie mengsel toe. Inincuberen voor 100 min bij 37 °C in een vochtige kamer.
- Verwijder het versterkings mengsel uit de putjes. Wash schuift 2x in 100 mL Wasbuffer ' B ' in een Coplin Slide-kleurende pot voor 10 minuten zonder schudden.
- Wasglaasjes in 100 mL Wasbuffer ' B ' verdund 1:100 in ultrapuur water in een Coplin Slide-kleurpot voor 30 sec.
- Voeg 20 μL DAPI met afdekmedium per put toe aan de dia's. Sluit dia's met een dekslip en Seal dia's met nagellak.
- Als beeldvormende, onmiddellijk inincuberen DAPI met montage medium voor 10 – 15 min, terwijl beschermd tegen licht. Zo niet, bewaar de glaasjes bij-20 °C gedurende maximaal 1 week, beschermd tegen licht.
5. detectie
- Gebruik confocale microscopie om afbeeldingen van HeLa, S. cerevisiae en E. coli cellen met respectievelijk 20x/0.8 na, 63x/1.4 na en 100X/1.4 na plan apochromat doelstellingen te verwerven. Excite DNA-gekleurd DAPI met een 405 nm gepulseerde Diode Laser. Voor het PLA-signaal (voor deze studie) prikkelen met een 561 nm Solid-State Laser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Uit onze eerdere in vitro studies met gezuiverde eiwitten bleek dat een subset van menselijke klasse A en klasse B JDPs tijdelijke gemengde JDP-complexen vormen om efficiënt een breed scala van geaggregeerde eiwitten te targeten en mogelijk de assemblage van Hsp70-gebaseerde eiwit disaggregassen7. We hebben PLA gebruikt om te bepalen of gemengde klasse (A + B) JDP-complexen voorkomen in menselijke baarmoederhalskanker cellen (HeLa). Human JDPs DNAJA2 (klasse A) en DNAJB1 (klasse B) waren gericht op zeer specifieke primaire antilichamen en secundaire PLA-sondes (Figuur 2a-C). De verschijning van rood fluorescerende punctae aangegeven de aanwezigheid van gemengde klasse DNAJA2 en DNAJB1 complexen in HeLa cellen (figuur 2c) bevestigen van onze vorige biochemische bevindingen7. Elke punctum vertegenwoordigt een individueel eiwit interactie gebeurtenis in de HeLa Cell cytosol/Nucleus.
Eerdere biochemische resultaten verkregen van Förster Resonance Energy Transfer (fret), die eiwit interacties detecteert als een uitlezen van de hoeveelheid energie overgebracht van een opgewonden donor de gekoppeld aan één eiwit aan een geschikte acceptor de gekoppeld aan het tweede eiwit, bleek dat soortgelijke Gemengde klasse complexen ook kunnen voorkomen tussen gist-JDPs, in vitro8. Door onze biochemische bevindingen te bevestigen, observeerden we de vorming van gemengde klasse complexen tussen Ydj1 (klasse A) en Sis1 (klasse B) in unicellulaire eukaryote S. cerevisiae (bakkersgist) cellen met Pla (figuur 2F). In gist, vanwege hun kleine Celgrootte en de coalescentie van meerdere punctae, kunnen de individuele fluorescerende stippen die door PLA worden gegenereerd, vaak minder worden onderscheiden. Een aanzienlijke afname van de fluorescerende punctae vorming werd waargenomen na knock-out of knockdown van interactie JDPs in zowel menselijke als gistcellen8, die aantoont de hoge specificiteit van Pla bij het vastleggen van deze co-Chaperone complexen in verschillende celtypen. In tegenstelling tot hun eukaryote tegenhangers, miste de prokaryotische (E. coli) jdps de mogelijkheid om gemengde klasse jdp-complexen te vormen en functioneel samen te werken om eiwit-uitsplitsing te stimuleren, in vitro8. In overeenstemming met de biochemische analyse, hebben we niet observeren Gemengde klasse JDP complexe formatie tussen bacteriële DnaJ-YFP (klasse A) en CbpA-mCherry (klasse B), de enige JDPs in E. coli (figuur 2i). Echter, onze PLA Setup was in staat om andere chaperonne assemblies met betrekking tot de twee JDPs vast te leggen. We hebben bijvoorbeeld chaperonne-complexen gedetecteerd tussen DnaJ-YFP en DnaK (bacteriële Hsp70) (figuur 2L) en cbpa-Mcherry en dnaK8 (gegevens worden niet weergegeven). Deze twee bacteriële chaperonne-complexen worden uitgebreid gekenmerkt zowel in vitro als in vivo8,11,12 , waardoor onze Pla-resultaten worden bevestigd. Samen tonen deze waarnemingen het vermogen van PLA om de transitieve gevormde chaperonne-machinerie in unicellulaire/multicellulaire eukaryotische en prokaryote cellen krachtig vast te leggen. De technische controles die ontbreken aan een primair antilichaam tegen een van de interagerende JDPs/chaperones, maar die zowel de secundaire PLA-sondes met de muis als het konijn bevatten, vertoonden weinig tot geen achtergrond fluorescentie signaal (Figuur 2a, B, D, E, G, H, J, K) duidt op een gebrek aan vals-positieve signaalversterking in onze experimentele opstelling.
Figuur 1: schematische weergave van de chronologische stappen van de nabijheids Ligatie test. (1) complex tussen proteïne A en proteïne B. (2) binding van primaire (1 °) antilichamen (groen en licht bruin) aan eiwitten A en B. De twee primaire antilichamen moeten worden verhoogd in verschillende gastheer soorten (bijv. muis, konijn of geit). (3) primaire antilichamen worden herkend door soortspecifieke secundaire (2 °) antilichamen die covalent zijn bevestigd met DNA oligo-Tags (PLA-sondes). (4) wanneer eiwitten A en B in complex zijn, bevinden de gebonden PLA-sondes zich in de nabijheid van de DNA-oligos om te hybridiseren met connector-DNA-strengen, wat resulteert in de vorming van een circulair DNA-molecuul. Vervolgens vergemakkelijkt een DNA-ligase het samenvoegen van DNA-strengen door de vorming van een fosfodiësterbinding te katalyseren. (5) initiatie van de rollende cirkel versterking (RCA) van de cirkelvormige DNA-molecule door een bacteriële DNA-polymerase bij 37 ° C. de RCA-reactie wordt geprimeerd door een van de antilichamen-geconjugeerde DNA oligo-Tags. (6) generatie van een enkel-streng concatemerisch DNA-molecuul dat aan een van de secundaire antilichamen is bevestigd. (7) hybridisatie van fluorescently-gelabelde aanvullende oligonucleotide sondes aan een unieke repetitieve sequentie in het concatemeric DNA molecuul. Na de hybridisatie stap kon het concatemeric DNA-molecuul worden gevisualiseerd als een heldere fluorescerende stip op de locatie van het gerichte proteïne complex in vaste cellen. Bodem de prokaryotische en eukaryote celtypen waarin de PLA-techniek van toepassing is. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2. Moleculaire chaperonne-assemblages gevangen door PLA in prokaryotische en eukaryote cellen. (A-C) detectie van gemengde jdp-complexen gevormd tussen DNAJA2 (klasse A) en DNAJB1 (klasse B) in menselijke baarmoederhalskanker cellijn Hela. PLA uitgevoerd met (a) anti-DNAJA2 antilichaam alleen (negatieve technische controle); B) alleen anti-DNAJB1 antilichaam (negatieve technische controle); C) anti-DNAJB1 en anti-DNAJA2 antilichamen samen. Het verschijnen van meerdere fluorescerende stippen in panel C (positief signaal) geeft de aanwezigheid van eiwitcomplexen aan die gevormd zijn tussen DNAJA2 en DNAJB1. Elke rode fluorescerende stip/punctum vertegenwoordigt een enkele interactie. Nuclei (DNA) gekleurd met DAPI (cyaan). (D-F) Detectie van gemengde JDP-complexen gevormd tussen Ydj1 (klasse A) en Sis1 (klasse B) in de cellen van S. cerevisiae . D) Pla uitgevoerd met alleen anti-Ydj1 antilichaam (negatieve technische controle); E) Pla uitgevoerd met alleen anti-Sis1 antilichaam (negatieve technische controle); F) Pla uitgevoerd met anti-Ydj1 en anti-Sis1 antilichamen samen. Het positieve fluorescerende signaal duidt op de aanwezigheid van Ydj1 en Sis1 complexen in S. cerevisiae. Gist kernen bevlekt met DAPI (cyaan). (G-L) Detectie van chaperonne complexen gevormd tussen prokaryote Hsp70 (dnaK) en jdps (dnaJ en cbpa) in E. coli cellen. Vanwege het ontbreken van specifieke primaire antilichamen tegen prokaryotische JDPs, werden de E. coli dnaJ (klasse A) en cbpa (klasse B) gelabeld met respectievelijk Yfp en mcherry. (G, J) PLA uitgevoerd met anti-YFP alleen (negatieve technische controle); H) Pla uitgevoerd met alleen anti-mcherry (negatieve technische controle). I) Pla uitgevoerd met anti-yfp-en Antimcherry antilichamen. Het ontbreken van fluorescerende stip vorming duidt op geen ingewikkelde vorming tussen DnaJ en CbpA. K) Pla uitgevoerd met alleen anti-dnaK-antilichamen (negatieve technische controle). L) Pla uitgevoerd met anti-yfp-en anti-dnaK-antilichamen samen. Het positieve fluorescerende signaal duidt op een complexe formatie tussen DnaK en DnaJ. Bacterieel DNA gekleurd met DAPI (cyaan). Naast het bevatten van één primair antilichaam, werden alle negatieve technische controles uitgevoerd in aanwezigheid van de respectieve secundaire PLA-sondes. Schaal staven = 10 μm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Co-immunoprecipitatie en co-lokalisatie gebaseerde benaderingen zijn gebruikt als langdurige methoden om te karakteriseren eiwit assembleert. De detectie van transitionele gevormde specifieke chaperonne-complexen is een grote uitdaging met dergelijke conventionele methoden, en als gevolg daarvan zijn eerdere bevindingen grotendeels beperkt tot kwalitatieve interpretaties. De Co-Immunoprecipitation-technieken op basis van cel lysis vereisen vaak cross-linking om eiwit-eiwit interacties te stabiliseren. Celllysis verhoogt het risico van het verstoren van tijdelijk gevormde chaperonne-complexen, terwijl cross-linking niet-inheemse interacties kan introduceren, vooral gedreven door de inherente "kleverigheid" van de meeste chaperones. Bij het analyseren van het Hsp70 chaperonne-systeem met behulp van co-immunoprecipitatie, kunnen potentiële artefacten voortvloeien uit (a) hoge expressieniveaus van de chaperonne en (b) oplosbaarheid problemen met betrekking tot membraan of eiwit geaggregeerde gebonden chaperonne machineries. Behalve, Co-Immunoprecipitation-gebaseerde technieken bieden geen informatie over cellulaire lokalisatie van de gevangen eiwit assemblages, die belangrijk voor het afbakenen van de bijbehorende functies zou kunnen zijn. De nadelen van het gebruik van co-immunoprecipitatie technieken zijn enigszins verminderd in co-lokalisatie gebaseerde benaderingen die eiwit lokalisatie informatie te behouden. Echter, de co-lokalisatie van twee of meer eiwitten kan duiden op ofwel directe eiwit-eiwit associatie of partitioneren van eiwitten in hetzelfde micro domein in cellen. Daarom is co-lokalisatie analyse, op zijn best, speculatief bij het voorspellen van eiwit interacties en mist een nabijheids waarde. Vanwege de bulk en willekeurige detectie van de beoogde eiwitten, de techniek is zeer beperkt in het bestuderen van specifieke eiwit assemblages in cellen. Dit is met name problematisch wanneer het beoogde eiwit (en) parallel een breed scala aan verschillende eiwit assemblages kan vormen, zoals in het geval met het Hsp70 chaperonne-systeem. Vergeleken met deze conventionele methodologieën is PLA een meer verfijnde in-situ techniek die ontwikkeld is om native eiwit associaties in cellen te detecteren en te kwantificeren met bewaarde eiwit lokalisatie-informatie. Een eiwit interactie wordt onthuld door deze assay op basis van de nabijheid (ongeveer 10-30 nm) tussen de beoogde eiwitten. PLA is "instelbaar", omdat het bereik van de afstand van de nabijheid kan worden verlaagd om een strengere uitlezen te verkrijgen door (a) de lengte van de aan de PLA-sondes gehechte oligonucleotide-Tags te verlagen en/of (b) de labels rechtstreeks aan primaire antilichamen toe te dienen. Zorg moet worden genomen bij het interpreteren van een positief PLA-signaal. Idealiter moet een eiwit interactie worden bevestigd met twee of meer onafhankelijke methodologieën. De intensiteit van het fluorescerende signaal in PLA is niet zo deterministisch gerelateerd aan de grootte van het eiwit cluster of de scheidingsafstand tussen de interacties eiwitten zoals het geval is met FRET. Echter, PLA heeft een hoge mate van specificiteit en gevoeligheid, en kan zelfs worden gebruikt voor het analyseren van zeer lage overvloedige eiwitten zoals groeifactoren of cytokines en hun interacties in zeldzame celtypen of klinische specimens13.
De Hsp70 chaperonne werkt samen met meerdere co-chaperones (bijv. JDPs en Nef's) tijdens zijn cellulaire levensduur14 om verschillende biologische functies te stimuleren. Het enorme aantal waarschijnlijke Hsp70-JDP-NEF-machine configuraties en hun dynamische gedrag in cellen hebben een gedetailleerd inzicht in de specifieke rollen van deze chaperonne-machines grotendeels belemmerd. Biologische hulpmiddelen die selectieve tracering van verschillende Hsp70 assemblages mogelijk maken, zijn daarom nodig om de totale bedrading van dit chaperonne-netwerk in cellen te ontleden. De tijdelijk gevormde jdp-jdp-en jdp-Hsp70 chaperonne-complexen7 werden effectief gevangen in cellen met Pla, wat aangeeft dat deze techniek geschikt is voor het bestuderen van moleculaire interacties met hoge dissociatieconstanten (bijv. > 3 μM Kd ). Hoewel, in het huidige werk, de assay wordt voornamelijk gebruikt als een "ja" of "nee" type binaire indicator voor chaperonne interactie, de gebruikers kunnen deze techniek gebruiken om semi-kwantitatieve uitlezingen van de mate van interactie te verkrijgen door het digitaal tellen van de fluorescentie signaal intensiteiten15. Echter, als gevolg van de niet-lineaire versterking van het PLA-signaal, voorzichtigheid moet worden betracht bij het interpreteren van PLA-gegevens op een kwantitatieve manier16. Ondanks de bovengenoemde voordelen, deze methode heeft bepaalde beperkingen. Een van de belangrijkste nadelen van PLA is dat de bepaling celfixatie vereist, waardoor het vermogen om temporele dynamiek van eiwit complexatie in levende cellen op te lossen, grotendeels wordt beperkt. Ter vergelijking, in vivo FRET17 of bioluminescentie resonantie energie overdracht (BRET)18 maakt het mogelijk om vergelijkbare eiwit interacties te monitoren in een spatio-temporele manier in levende cellen met relatief kleinere nabijheids waarden (< 10 nm). In tegenstelling tot PLA vertoont een FRET-signaal een strikte lineaire correlatie met eiwit expressieniveaus16 waardoor fret de gouden standaard is in kwantitatieve analyse van eiwit interacties. Echter, in tegenstelling tot de afhankelijkheid van FRET van de raadselachtige oriëntatie factor κ2, wordt Pla niet beïnvloed door de oriëntatie van de Pla-sondes, waardoor de kans op het opvangen van een eiwit complex19toeneemt. In termen van gebruiksvriendelijkheid vereisen FRET en BRET unieke expertise, waardoor de toegankelijkheid van deze methoden in het algemeen wordt beperkt tot de bredere onderzoeksgemeenschap. Verder, beide van deze technieken vereisen modificatie van de interactie eiwitten door het hechten van volumineuze lichtgevende/fluorescerende eiwit Tags die mogelijk interfereren met de eiwit functie en complexe vorming.
De volgende stappen (1-4) vereisen een zorgvuldige afweging voor de succesvolle implementatie van PLA in cellen. (1) antilichaam selectie: de in de handel verkrijgbare PLA-Kit is compatibel met primaire antilichamen die alleen tegen muis, konijn en geit worden verhoogd. PLA vereist zeer specifieke primaire antilichamen die niet binden aan doelwitten. Daarnaast is het belangrijk om primaire antilichamen te selecteren die compatibel zijn met toepassingen zoals immunohistochemie (IHC), enzym-linked immunosorbent assay (ELISA) en/of immunoprecipitatie (IP) om ervoor te zorgen dat de antilichamen antigene aminozuur sequenties blootgesteld aan het oppervlak van gevouwen eiwitten. Voorafgaand aan het gebruik wordt het testen van alle primaire antilichamen voor hun specificiteit ten zeerste aanbevolen. Dit kan worden uitgevoerd via Western Blot analyse van hele celllysates. In gevallen waarin de beoogde eiwitten homo logs hebben met kleine variaties in grootte en sequentie gelijkenis (bijv. Hsp70 en JDP paralogs), kan de specificiteit van de antilichamen worden getest met genknockdown/Knockout-benaderingen of door het aftasten tegen gezuiverde homologs om elke mogelijke Kruis herkenning uit te buiten. Als er geen geschikte antilichamen beschikbaar zijn, kunnen de beoogde eiwitten worden getagd met epitopen die antilichamen van acceptabele kwaliteit hebben (Figuur 2F). (2) fixatie en permeisatie van cellen: een behandeling van 4% Paraformaldehyde en 0,1-0,5% Triton-X100 kan worden gebruikt om respectievelijk cellen te repareren en permeabiliseert. Het gebruik van 4% Paraformaldehyde is een betere behandeling voor het behoud van eiwit-eiwit interacties en cellulaire ultrastructuur in vergelijking met fixatieve condities die 99% methanol gebruiken20,21,22. Vaststelling van cellen met 99% methanol, echter, levert minder cytoplasmische achtergrondkleuring, en misschien is meer geschikt voor specifieke gevallen zoals detectie van cytoskelet geassocieerde eiwit assemblages21,22. Efficiënte permeisatie van zowel het plasma membraan als organel membranen om de toegankelijkheid van antilichamen te vergroten, kan worden bereikt met een niet-ionische oppervlakteactieve stof Triton-X100. Triton-X100 kan echter niet specifiek eiwitten uit het plasma membraan verwijderen23,24. Daarom kan voor de analyse van eiwit assemblages geassocieerd met cellulaire membranen, alternatieve detergenten zoals saponine of digitonine die gericht zijn op sterolen op permeabilize membranen, worden toegepast21,22,25. (3) verstoring van de celwand: voorafgaand aan membraan permeisatie is een extra stap met betrekking tot specifieke lytische enzymen nodig om de doordringbaarheid van antilichamen in celtypen met celwanden te verhogen (bijv. schimmels, planten en bacteriële cellen). Bijvoorbeeld, we werkten lyticase, die β-glucan degradeert tot het verstoren van de celwand vanS. cerevisiae26. Evenzo, deE. colicelwand werd verstoord door lysozyme, een enzym dat zich richt op peptidoglycans27,28. De celwand samenstelling en lytische enzym gevoeligheid variëren met verschillende groeiomstandigheden26en cultuur samenvloeiing29,30. Daarom kan de concentratie van de lytische enzymen en verterings tijden variëren en moet worden gezorgd om overmatige of onderverte ring van cellen te voorkomen. Na de celwand vertering, de cellen zijn relatief kwetsbaar en vereisen verdringing agenten zoals sorbitol voor hen om intact te blijven tijdens de wasstappen. (4) DNA-versterking: de DNA-ligatie en de PCR-reactie stappen van de Rolling Circle zijn gevoelig voor schommelingen in temperatuur en vochtigheid. Om een robuuste DNA-versterking en reproduceerbaarheid van de test te garanderen, moeten deze reacties worden uitgevoerd bij 37 °C in een vochtigheids kamer. Belangrijk is dat het uitdrogen van de cellen tijdens het uitvoeren van de test wordt verhinderd om niet-specifieke antilichaam binding en DNA-versterkings gebeurtenissen te voorkomen die kunnen leiden tot een verhoogd achtergrond signaal.
Alles in overweging genomen, heeft de implementatie van deze test geen unieke expertise en geavanceerde instrumentatie nodig. De succesvolle monitoring van JDP-JDP en JDP-Hsp70 chaperonne-complexen illustreren de mogelijke toepassing van deze techniek om transitieve gevormde proteïne-assemblages in alle celtypen te traceren. Onze implementatie van de techniek in gist en bacteriën verhoogt de toepasbaarheid van PLA om verschillende biologische processen te bestuderen die worden gemedieerd door verschillende eiwit assemblages in een breed scala van organismen. Verder belicht ons werk PLA als een veelbelovende nieuwe proteïne-interactie tool om evolutionaire veranderingen te bestuderen die zich voordoen op moleculair niveau tussen soorten8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
NBN wordt ondersteund door een speciale rekruterings beurs van de Monash University faculteit geneeskunde verpleging en Gezondheidswetenschappen met financiering van de overheid van Victoria en de Australische overheid. Wij danken Bernd Bukau (ZMBH, Universiteit van Heidelberg, Duitsland) en Harm H. Kampinga (departement Biomedische Wetenschappen van cellen & systemen, Rijksuniversiteit Groningen, Nederland) voor hun onschatbare ondersteuning en het delen van reagentia, Holger Lorenz (ZMBH Imaging Facility, Universiteit van Heidelberg, Duitsland) voor zijn ondersteuning met confocale microscopie en beeldverwerking, en Claire Hirst (ARMI, Monash University, Australië) voor kritische lezing van het manuscript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 37% Formaldehyde | Merck | 103999 | |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 32201 | |
| anti-DNAJA2 antibody | Abcam | ab157216 | |
| anti-DNAJB1 Antibody | Enzo Life Sciences | ADI-SPA-450 | |
| anti-DnaK antibody | In house | ||
| anti-mCherry antibody | Abcam | ab125096 | |
| anti-Sis1 Antibody | Cosmo Bio Corp | COP-080051 | |
| anti-Ydj1 antibody | StressMarq Biosciences | SMC-150, | |
| anti-YFP antibody | In house | ||
| Coplin slide-staining jar | Sigma-Aldrich | S5516 | |
| Diagnostic slides | Marienfeld | 1216530 | |
| DMEM | Thermo-Fischer | 31966021 | |
| DuoLink In Situ Detection Reagents Orange | Sigma-Aldrich | DUO92007 | |
| DuoLink In Situ Mounting Medium + DAPI | Sigma-Aldrich | DUO82040 | |
| DuoLink In Situ PLA Probe Anti-Mouse MINUS | Sigma-Aldrich | DUO92004 | |
| DuoLink In Situ PLA Probe Anti-Rabbit PLUS | Sigma-Aldrich | DUO92002 | |
| DuoLink In Situ Wash Buffers, Fluorescence | Sigma-Aldrich | DUO82049 | |
| Fetal Calf Serum | Thermo-Fischer | 10082147 | |
| Lysozyme | Sigma-Aldrich | 62971 | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 32213 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo-Fischer | 15070063 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma-Aldrich | P47-07 | |
| Sorbitol | Sigma-Aldrich | S7547 | |
| Triton-X100 | Merck | 108643 | |
| Trypsin | Thermo-Fischer | 25300096 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Zymolase 100T / / Lyticase | United States Biological | Z1004 |
References
- Soderberg, O., et al. Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation. Nature Methods. 3 (12), 995-1000 (2006).
- Weibrecht, I., et al. Proximity ligation assays: a recent addition to the proteomics toolbox. Expert Review of Proteomics. 7 (3), 401-409 (2010).
- Mayer, M. P., Gierasch, L. M. Recent advances in the structural and mechanistic aspects of Hsp70 molecular chaperones. Journal of Biological Chemistry. 294 (6), 2085-2097 (2019).
- Kampinga, H. H., Craig, E. A. The HSP70 chaperone machinery: J proteins as drivers of functional specificity. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11 (8), 579-592 (2010).
- Nillegoda, N. B., Bukau, B. Metazoan Hsp70-based protein disaggregases: emergence and mechanisms. Frontiers in Molecular Biosciences. 2, (2015).
- Bracher, A., Verghese, J. The nucleotide exchange factors of Hsp70 molecular chaperones. Frontiers in Molecular Biosciences. 2, (2015).
- Nillegoda, N. B., et al. Crucial HSP70 co-chaperone complex unlocks metazoan protein disaggregation. Nature. 524 (7564), 247-251 (2015).
- Nillegoda, N. B., et al. Evolution of an intricate J-protein network driving protein disaggregation in eukaryotes. Elife. 6, (2017).
- Kirstein, J., et al. In vivo properties of the disaggregase function of J-proteins and Hsc70 in Caenorhabditis elegans stress and aging. Aging Cell. 16 (6), 1414-1424 (2017).
- Nillegoda, N. B., Wentink, A. S., Bukau, B.
- Chae, C., Sharma, S., Hoskins, J. R., Wickner, S. CbpA, a DnaJ homolog, is a DnaK co-chaperone, and its activity is modulated by CbpM. Journal of Biological Chemistry. 279 (32), 33147-33153 (2004).
- Kityk, R., Kopp, J., Mayer, M. P. Molecular Mechanism of J-domain-Triggered ATP Hydrolysis by Hsp70 Chaperones. Molecular Cell. 69 (2), 227-237 (2018).
- Söderberg, O., et al. Characterizing proteins and their interactions in cells and tissues using the in situ proximity ligation assay. Methods. 45 (3), 227-232 (2008).
- Benschop, J. J., et al. A consensus of core protein complex compositions for Saccharomyces cerevisiae. Molecular Cell. 38 (6), 916-928 (2010).
- Jung, J., et al. Quantifying RNA-protein interactions in situ using modified-MTRIPs and proximity ligation. Nucleic Acids Research. 41 (1), (2013).
- Mocanu, M. M., Váradi, T., Szöllosi, J., Nagy, P. Comparative analysis of fluorescence resonance energy transfer (FRET) and proximity ligation assay (PLA). Proteomics. 11 (10), 2063-2070 (2011).
- Sekar, R. B., Periasamy, A. Fluorescence resonance energy transfer (FRET) microscopy imaging of live cell protein localizations. Journal of Cell Biology. 160 (5), 629-633 (2003).
- Deriziotis, P., Graham, S. A., Estruch, S. B., Fisher, S. E. Investigating protein-protein interactions in live cells using bioluminescence resonance energy transfer. Journal of Visualized Experiments. 87, (2014).
- Nagy, P., Szöllosi, J. Proximity or no proximity: that is the question – but the answer is more complex. Cytometry. 75 (10), 813-815 (2009).
- Hoetelmans, R. W., et al. Effects of acetone, methanol, or paraformaldehyde on cellular structure, visualized by reflection contrast microscopy and transmission and scanning electron microscopy. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 9 (4), 346-351 (2001).
- Schnell, U., Dijk, F., Sjollema, K. A., Giepmans, B. N. Immunolabeling artifacts and the need for live-cell imaging. Nature Methods. 9 (2), 152-158 (2012).
- Stadler, C., Skogs, M., Brismar, H., Uhlen, M., Lundberg, E. A single fixation protocol for proteome-wide immunofluorescence localization studies. Journal of Proteomics. 73 (6), 1067-1078 (2010).
- Goldenthal, K. L., Hedman, K., Chen, J. W., August, J. T., Willingham, M. C. Postfixation detergent treatment for immunofluorescence suppresses localization of some integral membrane proteins. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 33 (8), 813-820 (1985).
- Schrader, M., Almeida, M., Grille, S. Postfixation detergent treatment liberates the membrane modelling protein Pex11beta from peroxisomal membranes. Histochemistry & Cell Biology. 138 (3), 541-547 (2012).
- Willingham, M. C., Yamada, S. S., Pastan, I. Ultrastructural antibody localization of alpha2-macroglobulin in membrane-limited vesicles in cultured cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 75 (9), 4359-4363 (1978).
- Aguilar-Uscanga, B., Francois, J. M. A study of the yeast cell wall composition and structure in response to growth conditions and mode of cultivation. Letters in Applied Microbiology. 37 (3), 268-274 (2003).
- Romaniuk, J. A., Cegelski, L. Bacterial cell wall composition and the influence of antibiotics by cell-wall and whole-cell NMR. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 370, 1679 (2015).
- Salazar, O., Asenjo, J. A.
- Cunningham, A. F., Spreadbury, C. L. Mycobacterial stationary phase induced by low oxygen tension: cell wall thickening and localization of the 16-kilodalton alpha-crystallin homolog. Journal of Bacteriology. 180 (4), 801-808 (1998).
- Werner-Washburne, M., Braun, E., Johnston, G. C., Singer, R. A. Stationary phase in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Microbiological Reviews. 57 (2), 383-401 (1993).
