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Biology

Surveillance in Situ des assemblages de chaperon moléculaire s'est formé de façon transitoire dans les bactéries, les levures et les cellules humaines

Published: September 2, 2019 doi: 10.3791/60172
Automatic Translation
*1, *2, 3
1Department of Biomedical Sciences of Cells & Systems, University of Groningen, 2Department of Anatomy, Faculty of Medicine, University of Colombo, 3Australian Regenerative Medicine Institute (ARMI), Monash University
* These authors contributed equally

Summary

Les protéines cognates du domaine J coopèrent avec le chaperon Hsp70 pour aider à une myriade de processus biologiques allant du pliage des protéines à la dégradation. Ici, nous décrivons un assay in situ de ligature de proximité, qui permet la surveillance de ces machineries de chaperon transitoirement formées dans les cellules bactériennes, de levure et humaines.

Abstract

Les protéines du domaine J (PDJ) forment la plus grande et la plus diversifiée famille de co-chaperons dans les cellules eucaryotes. Des résultats récents montrent que des membres spécifiques de la famille JDP pourraient former des hétérocomplexes transitoires chez les eucaryotes pour affiner la sélection du substrat pour les désagrégations de protéines à base de chaperon de 70 kDa (Hsp70). Les complexes JDP ciblent les protéines agrégées induites par le stress aigu/chronique et aident vraisemblablement à assembler les désagrégation en recrutant plusieurs Hsp70 à la surface des agrégats protéiques. L'étendue du réseau de contrôle de la qualité des protéines (PQC) formé par ces PDJ physiquement interagissant demeure largement invivo. Ici, nous décrivons un analyse in situ d'interaction de microscopie basée sur la protéine appelée l'analyse de ligature de proximité (PLA), qui est capable de capturer vigoureusement ces complexes transitoirement formés de chaperon dans les compartiments cellulaires distincts des cellules eucaryotes. Nos travaux élargissent l'emploi de l'APL des cellules humaines à la levure (Saccharomyces cerevisiae) et les bactéries (Escherichia coli), rendant ainsi un outil important pour surveiller la dynamique des assemblages de protéines formés transitoirement dans les deux cellules procaryotes et eucaryotes.

Introduction

Une grande quantité d'information génomique reste ininterprétable en raison de notre compréhension incomplète des interactomes cellulaires. Les méthodes conventionnelles de détection de l'interaction protéines-protéines, telles que la co-immunoprécipitation des protéines avec/sans liaison sépariale chimique et la co-localisation des protéines, bien que largement utilisées, posent une série d'inconvénients. Parmi les principaux inconvénients, mentionnons la mauvaise quantification des interactions et l'introduction potentielle d'événements contraignants non autochtones. En comparaison, les techniques émergentes basées sur la proximité offrent une alternative et une approche puissante pour capturer les interactions protéiques dans les cellules. L'assay de ligature de proximité (PLA)1, maintenant disponible en tant que kit propriétaire, utilise des anticorps pour cibler spécifiquement les complexes protéiques en fonction de la proximité des sous-unités en interaction.

L'APL est initiée par la formation d'un échafaudage composé d'anticorps primaires etsecondaires munis de petites étiquettes d'ADN (sondes D'APL) à la surface du complexe protéique ciblé (figure 1, étapes 1-3). Ensuite, déterminée par la proximité des étiquettes d'ADN, une molécule circulaire d'ADN est générée par hybridation avec des oligonucléotides de connecteur (figure1, étape 4). La formation de l'ADN circulaire est complétée par une étape de ligature de l'ADN. Le morceau circulaire nouvellement formé d'ADN sert de modèle pour l'amplification de la polymériase (PCR) à base de cercle roulant subséquent (PCR) amorcée par l'une des étiquettes conjuguées d'oligonucléotide. Cela génère une molécule d'ADN concatmérique unique attachée au complexeprotéique par l'intermédiaire de l'échafaudage d'anticorps (figure 1, étape 6). La molécule d'ADN concatégorique est visualisée à l'aide d'oligonucléotides étiquetés fluorescents qui s'hybrident à de multiples séquences uniques dispersées dans l'ADN amplifié (Figure 1, étape 7)2. Le signal PLA généré, qui apparaîtsous forme de point fluorescent (figure 1, étape 7), correspond à l'emplacement du complexe protéique ciblé dans la cellule. En conséquence, l'analyse pourrait détecter des complexes protéiques avec une grande précision spatiale. La technique ne se limite pas à la simple capture des interactions protéiques, mais pourrait également être utilisée pour détecter des molécules uniques ou des modifications protéiques sur les protéines à haute sensibilité1,2.

Hsp70 forme un système de chaperon très polyvalent fondamentalement important pour maintenir l'homéostasie cellulaire de protéine en participant à une série de fonctions d'entretien ménager et de stress-associées. Les activités d'entretien ménager du système de chaperon Hsp70 comprennent le pliage des protéines de novo, la translocation des protéines à travers les membranes cellulaires, l'assemblage et le démontage des complexes protéiques, la régulation de l'activité protéique et le lien entre le pliage des protéines et les différents machines de contrôle de la qualité3. Le même système de chaperon replie également les protéines mal repliées/dépliées, empêche l'agrégation de protéine, favorise la désagrégation de protéine et coopère avec les protéases cellulaires pour dégrader les protéines en phase terminale mal repliées/endommagées pour faciliter la réparation cellulaire après souligne protéotoxique4,5. Pour atteindre cette diversité fonctionnelle, le chaperon Hsp70 s'appuie sur des co-chaperons partenaires de la famille JDP et des facteurs d'échange de nucléotides (NEF) qui affinent le contrôle allostérique dépendant de l'ATP du Hsp70 de la liaison et de la libération du substrat3, 6. De plus, les co-chaperons JDP jouent un rôle essentiel dans la sélection des substrats pour ce système de chaperon polyvalent. Les membres de cette famille sont subdivisés en trois classes (A, B et C) en fonction de leur homologie structurelle au prototype JDP, le E. coli DnaJ. Les JDP de classe A contiennent un domaine J N-terminal, qui interagit avec Hsp70, une région riche en glycine-phénylalanine, une région de liaison de substrat composée d'une région de type doigt de zinc (ZFLR) et de deux domaines de baril de canon, et d'un domaine de dimerisation C-terminal. Les PDJ avec un domaine J N-terminal et une région riche en glycine-phénylalanine, mais dépourvus de ZFLR, entrent dans la classe B. En général, les membres de ces deux classes sont impliqués dans des fonctions de chaperonnage. Les membres relevant de la classe C fourre-tout, qui contient des JDP qui ne partagent que le j-domaine4, recrutent des Hsp70 pour effectuer une variété de fonctions non chaperonnées. Le rôle important des PDJ en tant qu'« adaptateurs » interchangeables du système Hsp70 se reflète dans l'expansion des membres de la famille au cours de l'évolution. Par exemple, les humains ont plus de 42 membres distincts du PDJ4. Ces JDP fonctionnent comme des monomères, des homodimers et/ou des oligomères homo/hétéro4,5. Récemment, une coopération fonctionnelle par la formation complexe transitoire entre la classe A (p. ex., H. sapiens DNAJA2; S. cerevisiae Ydj1) et classe B (p. ex., H. sapiens DNAJB1; S. cerevisiae Sis1) JDPs eucaryotique a été rapporté pour promouvoir la reconnaissance efficace des agrégats de protéines amorphes in vitro7,8. Ces complexes mixtes de PDJ s'assemblent vraisemblablement à la surface de protéines agrégées pour faciliter la formation de disagrégations protéiques à base de Hsp70 et Hsp70-Hsp1007,8,9, 10. Les preuves essentielles à l'appui de l'existence de ces complexes de PDJ de classe mixte formés de façon transitoire dans des cellules eucaryotes ont été fournies avec pLA8.

PLA est de plus en plus utilisé pour évaluer les interactions protéiques dans les métazoaires, principalement dans les cellules de mammifères. Ici, nous rapportons l'expansion réussie de cette technique pour surveiller les complexes transitoirement formés de chaperon dans les organismes unicellulaires eucaryotes et procaryotes tels que la levure en herbe S. cerevisiae et la bactérie E. coli. Fait important, cette expansion met en évidence l'utilisation potentielle de l'APL dans la détection et l'analyse des microbes qui infectent les cellules humaines et animales.

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Protocol

1. Préparation de cellules Hela

  1. Préparer les matériaux suivants: PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4), pH 7,4; DMEM, complété par 10% FCS et 1% Pen-Strep; 4 % de paraformaldéhyde dans PBS; 0,5 % Triton-X100 en PBS; TBS-T (150 mM NaCl, 20 mM Tris, 0,05 % Tween), pH 7,4; 0,0001% solution poly-L-Lysine stérile; diapositives diagnostiques de 10 puits; une chambre humide; papier de soie; et des pots à tacher de diapositives Coplin.
    REMARQUE: Afin d'assurer une efficacité de fixation optimale, les solutions de paraformaldéhyde doivent être préparées fraîchement avant chaque expérience.
  2. Préparer une chambre humide en couvrant le fond d'une boîte fermée avec des tissus humides. Placez la chambre humide à 37 oC avant de commencer l'expérience, afin de s'assurer que la température de la chambre est de 37 oC tout en couvant les réactions enzymatiques.
  3. Culture Cellules HeLa dans les flacons T25, dans 5 ml de DMEM (High Glucose, Glutamate et Sodium Pyruvate complété) complété par 10% FCS et 1% Pen-Strep, dans un incubateur de 37 oC CO2 contenant 5% CO2. Dissocier les cellules adhérentes à l'aide de 0,05% Trypsin-EDTA. Après l'ajout de DMEM frais aux cellules dissociées, comptez les cellules à l'aide d'une chambre de comptage cellulaire et se développent sur des diapositives diagnostiques à l'intérieur d'une chambre humide.
  4. Stériliser les diapositives diagnostiques par irradiation UV dans un capuchon de culture de cellules stériles pendant 30 min.
  5. Ajouter 100 l de polylysine filtré e stérile à chaque puits requis pour l'expérience. Incuber pendant 30 min. Laver l'excès de poly-L-lysine en lavant chaque puits 3x avec de l'eau ultrapure de 50 ll.
  6. Trypsiniser les cellules HeLa et ajouter environ 15.000 cellules à chaque puits. Si nécessaire, diluer les cellules à au moins 30-50 'L de DMEM par puits.
  7. Cultivez les cellules dans une chambre humide dans un incubateur de CO2 de 37 oC de 5 % pendant environ 24 h. Les cellules doivent être des confluents de 60 % à 80 % avant de commencer l'APL.
    REMARQUE: Une confluence trop élevée diminue l'absorption des réactifs, diminuant le signal obtenu à la fin du protocole.
  8. Retirer le milieu en plaçant un papier de soie sur le bord du puits. Laver les puits 3x avec 50 oL de PBS.
    REMARQUE: Les cellules sont sujettes à se détacher lorsque les liquides sont ajoutés durement. Cela peut être évité en ne laissant pas sécher complètement les puits avant d'ajouter un nouveau liquide et en ajoutant le nouveau liquide doucement au bord du puits.
  9. Fixez les cellules en ajoutant 50 l de paraformaldéhyde fraîchement préparé de 4 % dans le PBS à chaque puits. Incuber 10 min à température ambiante.
  10. Laver les diapositives 3x dans PBS. Effectuer des lavages dans un pot de teinture de diapositives Coplin contenant 100 ml de PBS. Pour chaque lavage, incuber 5 min à température ambiante sans trembler.
  11. Perméabilisez la membrane cellulaire en submergeant les diapositives en 100 ml de 0,5 % de Triton-X100 en PBS dans un bocal à taches de glissement de Coplin. Incuber 10 min à température ambiante sans trembler.
  12. Laver les glissières 3x dans TBS-T. Effectuer des lavages dans un pot de teinture de diapositives Coplin contenant 100 ml de SCT-T. Pour chaque lavage, incuber 5 min à température ambiante sans trembler.
  13. Après le dernier lavage, retirer l'excès de tampon avec un papier de soie. À ce stade, les cellules sont prêtes pour le protocole d'évaluation de la ligation de proximité qui sera discuté à la section 4.

2. Préparation des cellules S. cerevisiae

  1. Préparer les matériaux suivants : 100 mM KPO4, pH 6.5, appelé Wash Buffer; 37 % de formaldéhyde; 4% de paraformaldéhyde en 100 mM KPO4, pH 6.5; 1,2 M sorbitol en 100 mM KPO4, pH 6,5; solution lyticase (lyticase de 500 g/mL, 20 mM de mercaptoéthanol, 100 mM KPO4, pH 6,5); 0,0001% solution poly-L-Lysine; 1% Triton-X100 en 100 mM KPO4, pH 6.5; diapositives diagnostiques de 10 puits; une chambre humide (préparée comme à l'étape 1.2); papier de soie; et des pots à tacher de diapositives Coplin.
    REMARQUE: Afin d'assurer une efficacité de fixation optimale, les solutions de paraformaldéhyde doivent être préparées fraîchement avant chaque expérience.
  2. Cultivez une culture du jour au lendemain dans le milieu non sélectif d'extrait de levure, de peptone et de dextrose (YPD) à 30 oC tout en secouant.
    REMARQUE: Selon les exigences expérimentales, les cellules S. cerevisiae peuvent être cultivées dans le milieu synthétique complet (SC) ou le milieu synthétique minimal (SM) à la place.
  3. Diluer la culture stationnaire à un OD600 de 0,1 dans 20 ml de milieu. Cultivez les cellules à 30 oC tout en secouant jusqu'à ce que l'OD600 atteigne 0,5.
  4. Transférer la culture de 20 ml dans un tube de centrifugeuse de 50 ml. Pelleter les cellules par centrifugation à 665 x g pendant 3 min. Retirez le supernatant. Resuspendre les cellules en 5 ml de milieu frais.
  5. Fixez les cellules en ajoutant 550 L de formaldéhyde de 37 % à la culture. Incuber à température ambiante pendant 15 min.
  6. Pelleter les cellules par centrifugation à 665 x g pendant 3 min. Retirez le supernatant. Resuspendre la pastille dans 1 ml de paraformaldéhyde fraîchement préparé de 4 % dans Wash Buffer. Incuber 45 min à température ambiante.
  7. Pendant l'incubation, préparez les diapositives diagnostiques en ajoutant 100 l de solution poly-L-lysine de 0,01 % à chaque puits. Incuber les toboggans pendant 30 min à température ambiante.
  8. Après 30 min, laver l'excès de poly-L-lysine avec de l'eau ultrapure et laisser sécher les lames à l'air. Les toboggans secs sont prêts à l'emploi.
  9. Laver les cellules deux fois avec 1 ml de tampon de lavage. Effectuer les lavages par centrifugation des cellules à 665 x g pendant 3 min. Retirez le supernatant et resuspendre les cellules dans Wash Buffer.
  10. Pelleter les cellules par centrifugation à 665 x g pendant 3 min. Retirez le supernatant. Resuspendre les cellules dans 1 ml de 1,2 M de sorbitol dans Wash Buffer.
  11. Pelleter les cellules par centrifugation à 665 x g pendant 3 min. Retirez le supernatant. Resuspendre la pastille dans 250 l de solution Lyticase fraîchement préparée pour digérer la paroi cellulaire. Incuber les cellules dans la solution Lyticase pendant 15 min à 30 oC en secouant.
  12. Après la digestion, laver les cellules 3x par centrifugation à 665 x g pendant 3 min et retirer le supernatant. Resuspendre les cellules dans 250 'L de 1,2 M sorbitol dans Wash Buffer.
    REMARQUE: Parce que les cellules sont fragiles après la digestion de la paroi cellulaire, les resuspendre très soigneusement pour ne pas endommager les cellules.
  13. Ajouter 20 l de cellules resuspensionà la poly-L-lysine enduite. Laissez-les attacher aux glissières pendant 30 min. Laver les cellules non adhérentes en lavant les puits 3x avec 50 ll de tampon de lavage.
  14. Perméabilisez la membrane cellulaire en lavant 3x avec 50 L de 1% Triton-X dans Wash Buffer.
    REMARQUE: À ce stade, les cellules sont prêtes pour le protocole d'évaluation de la ligature de proximité qui sera discuté à la section 4.

3. Préparation des cellules E. coli

  1. Préparer les matériaux suivants: PBS-T (140 mM NaCl, 2 mM KCl, 8 mM K2HPO4, 1,5 mM KH2PO4, 0,05% Tween-20), pH 7,4; solution lysozyme (2 mg/mL de lysozyme, 25 mM Tris-HCl pH 8,0, 50 mM de glucose, 10 mM EDTA); 0,0001% solution poly-L-Lysine; 99 % de méthanol glacé; 99% de méthanol à température ambiante; 99% d'acétone; diapositives diagnostiques de 10 puits; une chambre humide (préparée comme à l'étape 1.1.1); papier de soie; et des pots à tacher de diapositives Coplin.
  2. Cultivez une culture du jour au lendemain dans le milieu de Luria-Bertani (LB) à 30 oC en secouant.
  3. Diluer la culture stationnaire à un OD600 de 0,02 dans le milieu LB frais. Cultivez les cellules à 30 oC tout en secouant jusqu'à ce que l'OD600 atteigne 0,4 pour les cellules de phase de notation.
  4. Environ 15 minutes avant que les cellules n'atteignent un OD600 de 0,4, préparez des lames enduites de poly-L-lysine en ajoutant 100 l de 0,0001% de polylysine à chaque puits. Incuber les toboggans pendant 30 min à température ambiante.
  5. Après 30 min, laver l'excès de poly-L-lysine avec de l'eau ultrapure et laisser sécher les glissières à l'air. Les toboggans secs sont prêts à l'emploi.
  6. Lorsque les cellules atteignent un OD600 de 0,4, transférer 1 ml de la culture à un tube de microcentrifuge stérile et des cellules de granules à 2 650 x g pendant 2 min.
  7. Resuspendre les cellules dans 50 l de milieu LB.
  8. Fixer les cellules en ajoutant 1 ml de méthanol glacé à 99 %. Mélanger très doucement à la main. Incuber les cellules pendant 30 min à -20 oC.
  9. Après fixation, ajoutez 20 l de cellules aux lames enduites de polylysine. Laisser sécher les lames à l'air pendant 30 min.
  10. Ajouter 50 ll de solution de lysozyme fraîchement préparée à chaque puits pour digérer la paroi cellulaire. Incuber dans une chambre humide pendant 30 min à 25 oC.
  11. Retirer la solution de lysozyme des puits en ajoutant un papier de soie sur le bord du puits. Laver les toboggans 3x en 100 ml de PBS-T. Effectuer chaque lavage dans un pot de copeaux de coloration pendant 30 s, sans trembler.
  12. Retirez le tampon de lavage des diapositives en tapant sur les diapositives sur un papier de soie.
  13. Perméabilisez les membranes cellulaires en ajoutant 50 L de 99 % de méthanol à chaque puits. Incuber 1 min à température ambiante.
  14. Enlever le méthanol en plaçant un papier de soie sur le bord du puits.
  15. Ajouter 50 l'acétone à 99 % de chaque puits. Incuber 1 min.
  16. Enlever l'excès d'acétone en plaçant un papier de soie sur le bord du puits. Laisser sécher les glissières. À ce stade, les cellules sont prêtes pour le protocole d'évaluation de la ligature de proximité qui sera discuté à la section 4.

4. La proximité Ligation Assay

  1. Préparer les matériaux suivants : Blocking Buffer; Tampon de dilution d'anticorps ; Wash Buffer 'A' (10 mM Tris, 150 mM NaCl, 0,05% Tween-20) pH 7.4; Wash Buffer 'B' (200 mM Tris, 100 mM NaCl) pH 7.4; Anti-Rabbit Secondary Antibody PLUS; Anti-Mouse Secondary Antibody MINUS; 5x Tampon de ligation; ligase; 5x Tampon d'amplification (Orange :ex 554 nm ;em 576 nm); polymérase; eau ultrapure; et le support de montage contenant du DAPI.
    REMARQUE : Les réactifs de détection de l'APL sont également disponibles dans les variantes Green (ex 495 nm ;em 527 nm), Rouge (ex 594 nm;em 624 nm), FarRed (ex 644 nm ; 'em 669 nm) ou Brightfield (peroxidase de l'estréode (HRP) conjugués).
  2. Bloquez les cellules en ajoutant une goutte de tampon de blocage à chaque puits. Incuber pendant 30 min à 37 oC dans une chambre humide.
  3. Préparer des solutions d'anticorps en diluant les anticorps de stock dans Le tampon de dilution d'anticorps. Pour chaque puits, 40 l de solution d'anticorps sont nécessaires.
  4. Enlever le tampon de blocage en plaçant un papier de soie sur le bord du puits. Ajouter 40 l d'anticorps dilués dans le tampon de dilution d'anticorps à chaque puits. Incuber 60 min dans une chambre humide à 37 oC ou toute la nuit à 4 oC.
  5. Retirez la solution d'anticorps des puits en plaçant un papier de soie sur le bord du puits. Laver les toboggans 2x en 100 ml de tampon de lavage 'A' dans un pot à taches de diapositives Coplin pendant 5 min, sans trembler.
  6. Pendant les étapes de lavage, diluer 5x sondes d'anticorps secondaires, anti-lapin PLUS et anti-souris MINUS (la spécificité des espèces des sondes dépend des anticorps primaires utilisés), dans Antibody Dilution Buffer. Préparer 40 L de solution d'anticorps par puits.
  7. Ajouter 40 L de solution d'anticorps secondaire à chaque puits. Incuber pendant 60 min à 37 oC dans une chambre humide.
  8. Enlever la solution d'anticorps secondaire des puits en plaçant un papier de soie sur le bord du puits. Laver les toboggans 2x en 100 ml de tampon de lavage 'A' dans un pot à taches de diapositives Coplin pendant 5 min, sans trembler.
  9. Pendant les lavages, préparer 40 l de mélange de ligature par puits, en mélangeant 8 l l de tampon de ligation 5x, 31 l d'eau ultrapure et 1 l de ligase.
  10. Ajouter 40 ll de mélange de ligature à chaque puits. Incuber pendant 30 min à 37 oC dans une chambre humide.
  11. Retirer le mélange de ligation des puits en plaçant un papier de soie sur le bord du puits. Laver les toboggans 2x en 100 ml de tampon de lavage 'A' dans un pot à taches de diapositives Coplin pendant 2 min, sans trembler.
  12. Pendant les lavages, préparez 40 l l de mélange d'amplification par puits, en mélangeant 8 ll de solution d'amplification 5x, 31,5 l d'eau ultrapure et 0,5 l de polymérase.
    REMARQUE: L'amplification 5x contient des sondes fluorescentes. Protégez ce mélange de la lumière. Protégez également les glissières de la lumière pendant chacune des étapes suivantes. Si vous utilisez des bocaux translucides à glissière Coplin et des chambres humides, enveloppez-les dans du papier d'aluminium.
  13. Ajouter 40 ll de mélange d'amplification par puits. Incuber 100 min à 37 oC dans une chambre humide.
  14. Retirer le mélange d'amplification des puits. Laver les toboggans 2x en 100 ml de tampon de lavage 'B' dans un pot à taches de diapositives Coplin pendant 10 min sans trembler.
  15. Laver les toboggans dans 100 ml de Wash Buffer 'B' dilué 1:100 dans de l'eau ultrapure dans un pot à taches de diapositives Coplin pendant 30 s.
  16. Ajouter 20 L de DAPI contenant le milieu de montage par puits aux diapositives. Fermer les glissières avec un bordereau et sceller les glissières avec du vernis à ongles.
  17. En cas d'imagerie, incubez immédiatement le DAPI contenant le milieu de montage pendant 10 à 15 min, tout en se prémuniant de la lumière. Si ce n'est pas le cas, entreposez les glissières à -20 oC jusqu'à 1 semaine, à l'abri de la lumière.

5. Détection

  1. Utilisez la microscopie confocale pour acquérir des images des cellules HeLa, S. cerevisiae et E. coli avec des objectifs d'apochromat 20x/0,8 NA, 63x/1.4 NA et 100x/1.4 NA Plan Apochromat, respectivement. Excitez le DAPI taché d'ADN avec un laser à diodes pulsées de 405 nm. Pour le signal PLA (pour cette étude) exciter avec un laser à l'état solide 561 nm.

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Representative Results

Nos études in vitro précédentes utilisant des protéines purifiées ont révélé qu'un sous-ensemble de PDJ de classe A et Declasse B de l'homme forment des complexes jDP transitoires de classe mixte pour cibler efficacement un large éventail de protéines agrégées et peut-être faciliter l'assemblage de Hsp70-basés protéines désagrége7. Nous avons employé PLA pour déterminer si les complexes de PDJ de classe mixte (A-B) se produisent dans les cellules cancéreuses cervicales humaines (HeLa). Les PDJ humains DNAJA2 (classe A) et DNAJB1 (classe B) ont été ciblés par des anticorps primaires très spécifiques et des sondes secondaires de l'ALP (figure2A-C). L'apparition de punctae fluorescent rouge a indiqué la présence de complexes mixtes DNAJA2 et DNAJB1 dans les cellules HeLa (Figure 2C) confirmant nos résultats biochimiques antérieurs7. Chaque ponctum représente un événement individuel d'interaction de protéine dans le cytosol/noyau de cellules de HeLa.

Résultats biochimiques antérieurs obtenus à partir du transfert d'énergie de résonance (FRET), qui détecte les interactions protéiques comme une lecture de la quantité d'énergie transférée d'un fluorophore de donneur excité attaché à une protéine à un fluorophore accepteur approprié attaché à la deuxième protéine, a indiqué que des complexes semblables declasse mixte pourraient également se produire entre les PDJ de levure, in vitro 8. Confirmant nos résultats biochimiques, nous avons observé la formation de complexes de classe mixte entre Ydj1 (classe A) et Sis1 (classe B) dans les cellules unicellulaires eucaryotes S. cerevisiae (levure de boulanger) avec PLA (Figure 2F). Dans la levure, en raison de leur petite taille cellulaire et de la coalescence de ponctuas multiples, les points fluorescents individuels générés par l'APL pourraient souvent être moins reconnaissables. Une diminution considérable de la formation de ponctuas fluorescents a été observée après ko ou knockdown des JDP d'interaction dans les cellules humaines et de levure8, qui démontre la grande spécificité de PLA en capturant ces complexes de co-chaperone dans différents types de cellules. Contrairement à leurs homologues eucaryotes, les PDJ procaryotiques (E. coli) n'avaient pas la capacité de former des complexes de PDJ de classe mixte et de coopérer fonctionnellement pour stimuler la désagrégation des protéines, in vitro8. En accord avec l'analyse biochimique, nous n'avons pas observé de formation complexe de PDJ de classe mixte entre dnaJ-YFP bactérien (classe A) et CbpA-mCherry (classe B), les seuls PJD de E. coli (figure2I). Cependant, notre configuration PLA a été en mesure de capturer d'autres assemblages de chaperons impliquant les deux JDP. Par exemple, nous avons détecté des complexes de chaperons entre dnaJ-YFP et DnaK (bactérien Hsp70) (figure2L) et CbpA-mCherry et DnaK8 (données non présentées). Ces deux complexes bactériens de chaperon sont largement caractérisés in vitro et in vivo8,11,12 confirmant ainsi nos résultats de PLA. Ensemble, ces observations démontrent la capacité de pLA à capturer solidement les machines à chaperon formées de façon transitoire dans les cellules eucaryotes et procaryotes unicellulaires/multicellulaires. Les contrôles techniques dépourvus d'anticorps primaires contre l'un des JDP/chaperons en interaction, mais contenant à la fois les sondes secondaires PLA dérivées de souris et de lapins, ont montré peu ou pas de signal de fluorescence de fond (Figure2A,B,D,E,G,H, J,K) indiquant un manque d'amplification faussement positive de signal dans notre configuration expérimentale.

Figure 1
Figure 1 : Représentation schématique des étapes chronologiques de l'Analyse de la Ligation de proximité. (1) Complexe entre la protéine A et la protéine B. (2) Liaison des anticorps primaires (1 o) (vert et brun clair) aux protéines A et B. Les deux anticorps primaires doivent être élevés chez différentes espèces hôtes (p. ex. souris, lapin ou chèvre). (3) Les anticorps primaires sont reconnus par des anticorps secondaires spécifiques à l'espèce (2 degrés) covalentement attachés avec des étiquettes d'oligo d'ADN (sondes d'ALP). (4) Lorsque les protéines A et B sont en complexe, les sondes pLA liées sont à proximité pour faciliter l'hybridation des oligos de l'ADN avec des brins d'ADN connecteur, ce qui entraîne la formation d'une molécule circulaire d'ADN. Par la suite, une ligase d'ADN facilite l'assemblage des brins d'ADN ensemble en catalysant la formation d'un lien phosphodiester. (5) Initiation de l'amplification du cercle roulant (RCA) de la molécule circulaire d'ADN par une polymérase bactérienne d'ADN à 37 oC. La réaction de RCA est amorcée par l'une des étiquettes d'oligo d'ADN conjuguées par anticorps. (6) Génération d'une molécule d'ADN concatemeric à brin unique attachée à l'un des anticorps secondaires. (7) Hybridation des sondes d'oligonucléotide complémentaires fluorescentes à une séquence répétitive unique dans la molécule d'ADN concatemeric. Après l'étape d'hybridation, la molécule d'ADN concatemeric pourrait être visualisée comme un point fluorescent lumineux à l'emplacement du complexe de protéine visé dans les cellules fixes. Le bas indique les types de cellules procaryotes et eucaryotes dans lesquels la technique d'APL est applicable. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2. Assemblages moléculaires de chaperon capturés par PLA dans les cellules procaryotes et eucaryotes. (A-C) Détection des complexes mixtes de PDJ formés entre DNAJA2 (classe A) et DNAJB1 (classe B) dans la lignée humaine de cellules cancéreuses cervicales HeLa. PLA effectué avec (A) anticorps anti-DNAJA2 seul (contrôle technique négatif); (B) anticorps anti-DNAJB1 seul (contrôle technique négatif); (C) anti-DNAJB1 et anti-DNAJA2 anticorps ensemble. L'apparition de plusieurs points fluorescents dans le panneau C (signal positif) indique la présence de complexes protéiques formés entre DNAJA2 et DNAJB1. Chaque point fluorescent rouge/ponctum représente une seule interaction. Noyeu (ADN) taché de DAPI (cyan). (D-F) Détection de complexes DeP d'une classe mixte formés entre Ydj1 (classe A) et Sis1 (classe B) dans les cellules De S. cerevisiae. (D) PLA effectué avec l'anticorps anti-Ydj1 seul (contrôle technique négatif); (E) PLA effectué avec l'anticorps anti-Sis1 seul (contrôle technique négatif); (F) PLA a exécuté avec des anticorps anti-Ydj1 et anti-Sis1 ensemble. Le signal fluorescent positif indique la présence de complexes Ydj1 et Sis1 dans s. cerevisiae. Noyeude de levure tachée de DAPI (cyan). (G-L) Détection des complexes de chaperons formés entre hsp70 procaryotique (DnaK) et JDPs (DnaJ et CbpA) dans les cellules d'E. coli. En raison de l'absence d'anticorps primaires spécifiques contre les PDJ procaryotes, les E. coli DnaJ (classe A) et CbpA (classe B) ont été étiquetés avec YFP et mCherry, respectivement. (G, J) PLA effectué avec anti-YFP seul (contrôle technique négatif); (H) PLA effectué avec anti-mCherry seul (contrôle technique négatif). (I) PLA effectué avec anti-YFP et anti-mCherry anticorps. L'absence de formation de points fluorescents n'indique aucune formation complexe entre DnaJ et CbpA. (K) PLA effectué avec l'anticorps anti-DnaK seul (contrôle technique négatif). (L) PLA effectué avec des anticorps anti-YFP et anti-DnaK ensemble. Le signal fluorescent positif indique une formation complexe entre DnaK et DnaJ. Adn bactérien taché de DAPI (cyan). En plus de contenir un seul anticorps primaire, tous les contrôles techniques négatifs ont été effectués en présence des sondes secondaires respectives de l'APL. Barres d'échelle de 10 m.

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Discussion

Les approches basées sur la co-immunoprécipitation et la colocalisation ont été utilisées comme méthodes de longue date pour caractériser les assemblages de protéines. La détection de complexes de chaperonspécifiques spécifiques formés de façon transitoire est un défi majeur avec de telles méthodes conventionnelles, et par conséquent, les résultats précédents sont largement limités à des interprétations qualitatives. Les techniques de co-immunoprécipitation basées sur la lyse cellulaire nécessitent souvent des liaisons croisées pour stabiliser les interactions protéines-protéines. La lyse cellulaire augmente le risque de perturber les complexes de chaperons formés de façon transitoire, tandis que les liaisons croisées pourraient introduire des interactions non indigènes, en particulier en raison de la « collante » inhérente de la plupart des chaperons. Lors de l'analyse du système de chaperon Hsp70 à l'aide de la co-immunoprécipitation, les artefacts potentiels pourraient provenir (a) des niveaux d'expression élevés du chaperon et (b) des problèmes de solubilité se rapportant aux machineries de chaperon liés à la membrane ou à l'agrégat protéique. En outre, les techniques basées sur la co-immunoprécipitation ne fournissent aucune information sur la localisation cellulaire des assemblages de protéines capturés, ce qui pourrait être important pour délimiter les fonctions associées. Les inconvénients de l'utilisation des techniques de co-immunoprécipitation sont quelque peu réduits dans les approches basées sur la co-localisation qui préservent l'information de localisation des protéines. Cependant, la co-localisation de deux protéines ou plus pourrait indiquer une association directe protéine-protéine ou le partage des protéines dans le même microdomaine dans les cellules. Par conséquent, l'analyse de la colocalisation est, au mieux, spéculative dans la prévision des interactions protéiques et n'a aucune valeur de proximité. En raison de la détection en vrac et aveugle des protéines ciblées, la technique est très limitée dans l'étude des assemblages de protéines spécifiques dans les cellules. Ceci est particulièrement problématique lorsque les protéines ciblées pourraient, en parallèle, former un large éventail d'assemblages protéiques distincts comme dans le cas du système de chaperon Hsp70. Par rapport à ces méthodologies conventionnelles, PLA est une technique in situ plus raffinée développée pour détecter et quantifier vigoureusement les associations de protéines indigènes dans les cellules avec des informations de localisation des protéines préservées. Une interaction protéique est révélée par cet exemple basé sur la proximité (environ 10-30 nm) entre les protéines ciblées. L'APL est « incapable » de réduire l'étendue de la distance de proximité afin d'obtenir une lecture plus rigoureuse en diminuant la longueur des étiquettes d'oligonucléotide fixées aux sondes de l'APL et/ou (b) en conjuguant les étiquettes directement aux anticorps primaires. Il faut faire attention à l'interprétation d'un signal positif de l'APL. Idéalement, une interaction protéique devrait être confirmée avec deux méthodologies indépendantes ou plus. L'intensité du signal fluorescent dans l'APL n'est pas aussi déterministe liée à la taille des grappes de protéines ou à la distance de séparation entre les protéines en interaction que c'est le cas avec FRET. Cependant, PLA a un degré élevé de spécificité et de sensibilité, et pourrait même être utilisé pour analyser les protéines très faibles abondantes telles que les facteurs de croissance ou cytokines et leurs interactions dans les types de cellules rares ou des spécimens cliniques13.

Le chaperon Hsp70 s'associe à plusieurs co-chaperons (p. ex. JDP et NEF) au cours de sa durée de vie cellulaire14 pour conduire des fonctions biologiques distinctes. Le nombre de configurations probables de machines Hsp70-JDP-NEF et leur comportement dynamique dans les cellules ont largement entravé une compréhension détaillée des rôles spécifiques de ces machines à chaperon. Les outils biologiques qui permettent le traçage sélectif des assemblages Distincts de Hsp70 sont donc nécessaires pour disséquer le câblage global de ce réseau de chaperons dans les cellules. Les complexes de chaperons JDP-JDP et JDP-Hsp707 ont été effectivement capturés dans des cellules atteintes d'APL, ce qui indique que cette technique convient à l'étude des interactions moléculaires avec des constantes de dissociation élevée (p. ex., 3 M Kd ). Bien que, dans le travail actuel, l'essai est principalement utilisé comme un "oui" ou "non" indicateur binaire de type pour l'interaction chaperon, les utilisateurs peuvent utiliser cette technique pour obtenir des lectures semi-quantitatives du degré d'interaction en comptant numériquement la fluorescence intensités de signal15. Toutefois, en raison de l'amplification non linéaire du signal de l'APL, il faut faire preuve de prudence lorsqu'il s'agit d'interpréter les données de l'APL d'une manière quantitative16. Malgré les avantages susmentionnés, cette méthode a certaines limites. L'un des principaux inconvénients de l'APL est que l'analyse nécessite une fixation cellulaire limitant ainsi largement sa capacité à résoudre la dynamique temporelle de la complexité des protéines dans les cellules vivantes. En comparaison, in vivo FRET17 ou Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET)18 permet la surveillance d'interactions protéiques similaires d'une manière spatio-temporelle dans les cellules vivantes avec des valeurs de proximité relativement plus faibles (lt;10 nm). Contrairement à pLA, un signal FRET présente une corrélation linéaire stricte avec les niveaux d'expression des protéines16 faisant de FRET l'étalon-or dans l'analyse quantitative des interactions protéiques. Cependant, contrairement à la dépendance de FRET sur le facteur d'orientation énigmatique2, PLA n'est pas influencé par l'orientation des sondes PLA, ce qui augmente la probabilité de capturer un complexe protéique19. En termes de convivialité, FRET et BRET exigent une expertise unique, limitant ainsi généralement l'accessibilité de ces méthodologies à l'ensemble de la communauté de la recherche. De plus, ces deux techniques nécessitent une modification des protéines en interaction en attachant des étiquettes voilonnes de protéines luminescentes/fluorescentes qui pourraient potentiellement interférer avec la fonction protéique et la formation complexe.

Les étapes suivantes (1-4) exigent un examen attentif pour la mise en œuvre réussie de l'APL dans les cellules. (1) Sélection d'anticorps : Le kit PLA disponible dans le commerce est compatible avec les anticorps primaires élevés contre la souris, le lapin et la chèvre seulement. L'APL nécessite des anticorps primaires très spécifiques qui ne se lient pas aux cibles. En outre, il est important de sélectionner des anticorps primaires compatibles avec des applications telles que l'immunohistochimie (IHC), l'essai immunosorbent lié aux enzymes (ELISA) et/ou l'immunoprécipitation (IP) pour s'assurer que les anticorps pourraient reconnaître séquences d'acides aminés antigéniques exposées à la surface des protéines pliées. Avant d'utiliser, l'essai de tous les anticorps primaires pour leur spécificité est fortement recommandé. Ceci peut être effectué par l'analyse occidentale de tache des lysates entiers de cellule. Dans les cas où les protéines ciblées ont des homologs avec de petites variations de taille et de similitude de séquence (par exemple, les paralogs Hsp70 et JDP), la spécificité des anticorps pourrait être testée avec des approches de knockdown/knockout de gène ou en probant contre les paralogs purifiés d'homologs pour exclure toute reconnaissance croisée potentielle. Si les anticorps appropriés ne sont pas disponibles, les protéines ciblées pourraient être étiquetées avec des épitopes qui ont des anticorps de qualité acceptable (Figure 2F). (2) Fixation et perméabilisation des cellules : Un traitement de 4 % de paraformaldéhyde et de 0,1 à 0,5 % de Triton-X100 pourrait être utilisé pour fixer et perméabizer les cellules, respectivement. L'utilisation de 4% de paraformaldéhyde est un meilleur traitement pour la préservation des interactions protéines-protéines et l'ultrastructure cellulaire par rapport aux conditions fixatives employant 99% de méthanol20,21,22. Fixation des cellules avec 99% de méthanol, cependant, donne moins de coloration de fond cytoplasmique, et est peut-être plus approprié pour des cas spécifiques tels que la détection des assemblages de protéines associées au cytosquelette21,22. La perméabilisation efficace de la membrane de plasma aussi bien que des membranes d'organelle pour augmenter l'accessibilité d'anticorps pourrait être réalisée avec le surfactant non ionique Triton-X100. Triton-X100 peut, cependant, enlever non spécifiquement les protéines de la membrane plasmatique23,24. Par conséquent, pour l'analyse des assemblages de protéines associés aux membranes cellulaires, des détergents alternatifs tels que la saponine ou la numérisation qui cible les stérols pour perméabilize des membranes pourraient être appliqués21,22,25. (3) Perturbation de la paroi cellulaire : Avant la perméabilisation de la membrane, une étape supplémentaire impliquant des enzymes lytiques spécifiques est nécessaire pour augmenter la pénétrabilité des anticorps dans les types cellulaires avec des parois cellulaires (p. ex. champignons, cellules végétales et bactériennes). Par exemple, nous avons utilisé le lyticase, qui dégrade le glucane pour perturber la paroi cellulaire deS. cerevisiae26. De même, leE. colila paroi cellulaire a été perturbée à l'aide du lysozyme, une enzyme qui cible les peptidoglycariens27,28. La composition de la paroi cellulaire et la sensibilité enzymatique lytique varient selon les conditions de croissance26et la confluence culturelle29,30. Par conséquent, la concentration des enzymes lytiques et les temps de digestion peuvent varier et des soins doivent être pris pour prévenir la sur- ou la sous-digestion des cellules. Après la digestion de la paroi cellulaire, les cellules sont relativement fragiles et nécessitent des agents d'encombrement tels que le sorbitol pour qu'elles restent intactes pendant les étapes de lavage. (4) Amplification de l'ADN : La ligature de l'ADN et les étapes de réaction PCR du cercle roulant sont sensibles aux fluctuations de température et d'humidité. Afin d'assurer une amplification et une reproductibilité robustes de l'analyse, ces réactions doivent être effectuées à 37 oC dans une chambre d'humidité. Il est important de noter que les cellules proccesséd devraient être empêchées de sécher tout en effectuant l'analyse pour éviter tout événement non spécifique de liaison d'anticorps et d'amplification d'ADN qui pourrait mener à une augmentation du signal de fond.

Tout bien considéré, la mise en œuvre de cet analyse ne nécessite pas une expertise unique et une instrumentation sophistiquée. La surveillance réussie des complexes de chaperon de JDP-JDP et de JDP-Hsp70 illustre l'application potentielle de cette technique pour tracer les assemblages transitoirement formés de protéine dans tous les types de cellules. Notre mise en œuvre de la technique dans la levure et les bactéries augmente considérablement l'applicabilité de l'APL pour étudier divers processus biologiques négociés par des assemblages distincts de protéines dans un large éventail d'organismes. De plus, nos travaux mettent l'accent sur l'ALP comme un nouvel outil prometteur d'interaction protéique pour étudier les changements évolutifs se produisant au niveau moléculaire entre les espèces8.

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Disclosures

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Acknowledgments

NBN est soutenu par une subvention spéciale de recrutement de la Faculté de médecine de l'Université Monash, les sciences infirmières et de la santé, avec un financement du gouvernement de l'État de Victoria et du gouvernement australien. Nous remercions Bernd Bukau (ZMBH, Heidelberg University, Allemagne) et Harm H. Kampinga (Department of Biomedical Sciences of Cells and Systems, University of Groningen, Pays-Bas) pour leur soutien et leur partage inestimables de réactifs, Holger Lorenz (ZMBH) Imaging Facility, Heidelberg University, Allemagne) pour son soutien à la microscopie confocale et au traitement d'images, et Claire Hirst (ARMI, Monash University, Australie) pour la lecture critique du manuscrit.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
37% Formaldehyde Merck 103999
Acetone Sigma-Aldrich 32201
anti-DNAJA2 antibody Abcam ab157216
anti-DNAJB1 Antibody Enzo Life Sciences ADI-SPA-450
anti-DnaK antibody In house
anti-mCherry antibody Abcam ab125096
anti-Sis1 Antibody Cosmo Bio Corp COP-080051
anti-Ydj1 antibody StressMarq Biosciences  SMC-150,
anti-YFP antibody In house
Coplin slide-staining jar Sigma-Aldrich S5516
Diagnostic slides Marienfeld 1216530
DMEM Thermo-Fischer 31966021
DuoLink In Situ Detection Reagents Orange Sigma-Aldrich DUO92007
DuoLink In Situ Mounting Medium + DAPI Sigma-Aldrich DUO82040
DuoLink In Situ PLA Probe Anti-Mouse MINUS Sigma-Aldrich DUO92004
DuoLink In Situ PLA Probe Anti-Rabbit PLUS Sigma-Aldrich DUO92002
DuoLink In Situ Wash Buffers, Fluorescence Sigma-Aldrich DUO82049
Fetal Calf Serum Thermo-Fischer 10082147
Lysozyme Sigma-Aldrich 62971
Methanol Sigma-Aldrich 32213
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148
Penicillin/Streptomycin Thermo-Fischer 15070063
Poly-L-Lysine Sigma-Aldrich P47-07
Sorbitol Sigma-Aldrich S7547
Triton-X100 Merck 108643
Trypsin Thermo-Fischer 25300096
Tween-20 Sigma-Aldrich P1379
Zymolase 100T / / Lyticase United States Biological Z1004

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References

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Ce mois-ci à JoVE Numéro 151 Proximity Ligation Assay Chaperone J-domain protein Hsp70 human bacteria yeast E. coli S. cerevisiae protein interaction proteostasis
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Alberts, N., Mathangasinghe, Y., Nillegoda, N. B. In Situ Monitoring of Transiently Formed Molecular Chaperone Assemblies in Bacteria, Yeast, and Human Cells. J. Vis. Exp. (151), e60172, doi:10.3791/60172 (2019).

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