Summary
Cognate J-domain 蛋白质与 Hsp70 伴护器合作，协助处理从蛋白质折叠到降解的各种生物过程。在这里，我们描述了一个原位接近结扎测定，它允许监测这些瞬时形成的伴菌机在细菌，酵母和人类细胞。
Abstract
J-domain蛋白（JdPs）是真核细胞中最大、最多样化的共体细胞家族。最近的发现表明，JDP家族的特定成员可以在真核生物中形成瞬态异质复合物，以微调70 kDa热休克蛋白（Hsp70）基于配体蛋白的基质选择。JDP复合物针对急性/慢性应激诱导的聚合蛋白，并可能通过在蛋白质聚合体表面招募多个Hsp70s来帮助组装分离的气体。这些物理相互作用的JdPs形成的蛋白质质量控制（PQC）网络在体内基本上没有特征。在这里，我们描述了一种基于显微镜的原位蛋白相互作用测定，名为接近结扎测定（PLA），它能够在真核细胞的不同细胞隔间中强有力地捕获这些瞬时形成的伴结复合物。我们的工作将PLA的用法从人类细胞扩展到酵母（糖母细胞）和细菌（大肠杆菌），从而成为监测两者中瞬态形成的蛋白质组体的动力学的重要工具。原核细胞和真核细胞。
Introduction
由于我们对细胞相互作用的不完全了解，大量的基因组信息仍然无法解释。传统的蛋白质-蛋白质相互作用检测方法，如蛋白质共免疫沉淀与/没有化学交联和蛋白质共定位，虽然广泛使用，造成一系列缺点。一些主要缺点包括相互作用的量化不佳，以及可能引入非本机绑定事件。相比之下，新兴的基于接近的技术为捕获细胞中的蛋白质相互作用提供了另一种强有力的方法。接近结扎测定（PLA）1，现在作为专有试剂盒提供，利用抗体根据相互作用亚单位的接近度专门靶向蛋白质复合物。
PLA是由在靶向蛋白复合物表面形成一个脚手架，由具有小DNA标记（PLA探针）的初级和二级抗体组成（图1，步骤1-3）。接下来，由DNA标记的接近性决定，一个圆形DNA分子通过与连接器寡核苷酸杂交产生（图1，步骤4）。圆形DNA的形成通过DNA结扎步骤完成。新形成的圆形DNA片作为后续滚环扩增（RCA）型聚合酶链反应（PCR）的模板，由其中一个结合的寡核苷酸标记。这通过抗体支架产生单链连体DNA分子附着在蛋白质复合物上（图1，步骤6）。串联DNA分子是使用荧光标记的寡核苷酸进行可视化的，这种核苷酸杂交到分散在扩增DNA上的多个独特序列（图1，步骤7）2。生成的PLA信号，显示为荧光点（图1，步骤7），对应于细胞中靶向蛋白质复合物的位置。因此，该测定可以检测高空间精度的蛋白质复合物。该技术并不仅限于捕获蛋白质相互作用，但也可用于检测高灵敏度1，2的蛋白质上的单个分子或蛋白质修饰。
Hsp70 通过参与一系列内务管理和与压力相关的功能，形成了一个高度通用的护套系统，对于维持细胞蛋白平衡至关重要。Hsp70伴郎系统的家政活动包括脱新蛋白折叠、细胞膜中蛋白质易位、蛋白质复合物的组装和拆解、蛋白质活性的调节以及连接不同的蛋白质折叠/质量控制机器3.同样的伴松系统还重新折叠错折叠/展开的蛋白质，防止蛋白质聚集，促进蛋白质分解，并与细胞蛋白酶合作，降解最终错折叠/损坏的蛋白质，以促进细胞修复后蛋白毒性应力4，5。为了实现这种功能多样性，Hsp70 伴侣依赖于 JDP 家族的合作伙伴和核苷酸交换因子 （NEF），这些因子可微调 Hsp70 的基于 ATP 的基板结合和释放3的依合体控制， 6.此外，JDP共同护带器在选择这种多功能护带系统的基板方面发挥着至关重要的作用。这个家族的成员根据他们与原型JDP（大肠杆菌DnaJ）的结构同源性，被细分为三类（A、B和C）。 A 类 JKP 包含一个 N 端 J 域，该域与 Hsp70、甘氨酸-苯丙氨酸富集区、由锌手指状区域 （ZFLR） 和两个 β管域组成的基板结合区域以及一个 C-终端二分化域。具有 N 端 J 域和甘氨酸-苯丙氨酸富区但缺少 ZFLR 的 JSP 属于 B 类。通常，这两个类的成员都参与伴校函数。属于C类的会员，其中只包含共享J域4的JdP，招募Hsp70执行各种非伴奏功能。Hsp70 系统作为可互换基板识别"适配器"的重要作用体现在在进化过程中家庭成员的扩展。例如，人类有超过42个不同的JDP成员4。这些JJD功能作为单体，同构体和/或同质/异质寡聚物4，5。最近，通过A类之间的瞬态复杂形成进行功能合作（例如，H.智人DNAJA2;S. cerevisae Ydj1） 和 B 类（例如，H.智人DNAJB1;据报道，S.cerevisiae Sis1）真核JGP促进在体外7、8对非晶蛋白聚集物的有效识别。这些混合类JDP复合物大概在聚合蛋白的表面组装，以促进Hsp70-和Hsp70_Hsp100基蛋白的分解7，8，9，10.支持这些在真核细胞中暂时形成的混合类JDP复合物存在的关键证据被PLA8提供。
PLA越来越多地用于评估元动物的蛋白质相互作用，主要是哺乳动物细胞。在这里，我们报告这项技术的成功扩展，以监测真核和原核单细胞生物中暂时形成的伴生复合物，如萌芽酵母S.cerevisae和大肠杆菌。重要的是，这种扩展凸显了PLA在检测和分析感染人类和动物细胞的微生物方面的潜在用途。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. 赫拉细胞制备
- 准备以下材料： PBS （137 mM NaCl， 2.7 mM KCl， 10 mM Na2HPO4， 1.8 mM KH2PO4），pH 7.4;DMEM，辅以 10% FCS 和 1% 笔链;4%甲醛在PBS中;0.5% Triton-X100 在 PBS 中;TBS-T （150 mM NaCl， 20 mM Tris， 0.05% 补间）， pH 7.4;0.0001% 无菌多L-莱辛溶液;10 well 诊断幻灯片;潮湿的室内;纸巾;和科普林滑动染色罐。
注：为确保最佳的固定效率，在每次实验前应新鲜制备甲醛溶液。 - 用湿纸巾覆盖封闭盒子的底部，准备一个潮湿的房间。在开始实验前，将潮湿室置于37°C，以确保室温度在37°C，同时孵育酶反应。
- 在T25烧瓶中的培养HeLa细胞，在5mL的DMEM（高葡萄糖，谷氨酸和丙酸钠补充）补充10%FCS和1%笔链，在37°CCO2培养箱中含有5%CO2。使用0.05%胰蛋白酶-EDTA分离粘附细胞。将新鲜的DMEM添加到分离的细胞后，使用细胞计数室对细胞计数，并在潮湿腔室内的诊断幻灯片上生长。
- 在无菌细胞培养罩中通过紫外线照射对诊断幻灯片进行消毒 30 分钟。
- 在实验所需的每口井中加入100 μL无菌过滤0.0001%多L-莱辛。孵育30分钟，用50μL超纯水清洗每口井3次，洗去多余的多L-莱辛。
- 胰腺化 HeLa 细胞，并在每个井中添加大约 15，000 个细胞。如有必要，将细胞稀释至每口至少30-50μL的DMEM。
- 在37°C 5%CO2培养箱内湿腔内生长细胞约24小时。在开始使用PLA之前，细胞应60%~80%的汇合。
注：过高的汇合降低试剂的吸收，降低在协议结束时获得的信号。 - 将纸巾放在井边，取出介质。用 50 μL 的 PBS 清洗水井 3 倍。
注：当液体被猛烈添加时，细胞会脱落。在添加新液体之前，不让油井完全干燥，并将新液体轻轻添加到井边，可以预防这种情况。 - 将PBS中50μL新鲜制备的4%甲醛加入每个井，修复细胞。在室温下孵育10分钟。
- 在 PBS 中清洗幻灯片 3 倍。在含有 100 mL PBS 的科普林滑动染色罐中进行处理。每次洗涤时，在室温下孵育5分钟，不摇晃。
- 在 PBS 中将 100 mL 的 0.5% Triton-X100 中的滑片浸入科普林滑动染色罐中，从而渗透细胞膜。在室温下孵育10分钟，不摇晃。
- 在 TBS-T 中清洗幻灯片 3 倍。在含有 100 mL TBS-T 的科普林滑动染色罐中进行处理。每次洗涤时，在室温下孵育5分钟，不摇晃。
- 上次清洗后，用纸巾去除多余的缓冲液。此时，细胞已准备好进行接近结扎测定协议，该协议将在第 4 节中讨论。
2. S. 塞雷维西亚细胞制剂
- 准备以下材料：100 mM KPO4，pH 6.5，称为洗涤缓冲液;37%甲醛;4%甲醛在100mM KPO4，pH 6.5;1.2 M 山梨醇在100 mM KPO4，pH 6.5;利蒂箱溶液（500μg/mL溶性，20mMβ-甲壳醇，100 mM KPO4，pH 6.5）;0.0001% 多L-莱辛溶液;1% Triton-X100 在 100 mM KPO4， pH 6.5;10 well 诊断幻灯片;潮湿室（如步骤1.2中准备）;纸巾;和科普林滑动染色罐。
注：为确保最佳的固定效率，在每次实验前应新鲜制备甲醛溶液。 - 在30°C下在30°C下生长在非选择性酵母提取物、肽和Dextrose（YPD）培养基中一夜培养。
注：根据实验要求，S.cerevisae细胞可以在合成完整（SC）培养基或选择性合成最小（SM）培养基中生长。 - 在 20 mL 介质中将固定培养物稀释至 0.1 的 OD600。在30°C下生长细胞，同时摇动，直到OD600达到0.5。
- 将 20 mL 培养层转移到 50 mL 离心管中。在665 x g下离心将细胞细胞离心3分钟，取出上清液。在5 mL的新鲜培养基中重新悬浮细胞。
- 通过在培养物中加入550μL 37%甲醛来修复细胞。在室温下孵育15分钟。
- 在665 x g下离心将细胞细胞离心3分钟，取出上清液。将颗粒重新悬浮在1 mL中，在洗涤缓冲液中注入新鲜制备的4%的甲醛。在室温下孵育45分钟。
- 在孵育过程中，通过在每口井中加入100μL 0.01%的聚L-流并表示溶液来制备诊断幻灯片。在室温下孵育幻灯片30分钟。
- 30分钟后，用超纯水洗去多余的多聚L-流水，让滑道空气干燥。干滑道可供使用。
- 用1 mL的洗涤缓冲液洗涤细胞两次。通过665 x g的细胞离心进行洗涤3分钟。去除上清液，在洗涤缓冲液中重新悬浮细胞。
- 在665 x g下离心将细胞细胞离心3分钟，取出上清液。在洗涤缓冲液中重新悬浮在1mL的1.2M山梨醇中。
- 在665 x g下离心将细胞细胞离心3分钟，取出上清液。将颗粒重新悬浮在250 μL新鲜制备的Lyticase溶液中，以消化细胞壁。在30°C下在Lyticase溶液中孵育细胞15分钟，同时摇动。
- 消化后，在665 x g下将细胞离心3倍，3分钟，并去除上清液。在洗涤缓冲液中重新悬浮在250μL的1.2M山梨醇中。
注：由于细胞壁消化后易碎，因此请非常仔细地重新悬浮细胞，不要损伤细胞。 - 将20 μL的再悬浮细胞添加到聚-L-赖因涂层幻灯片中。允许它们附着在幻灯片上30分钟，用50μL的洗涤缓冲液清洗水井3倍，洗去非粘附细胞。
- 在洗涤缓冲液中用50μL的1%Triton-X洗涤3x，渗透细胞膜。
注：此时，细胞已准备好进行接近结扎测定协议，将在第 4 节中讨论。
3.大肠杆菌细胞制剂
- 准备以下材料： PBS-T （140 mM NaCl， 2 mM KCl， 8 mM K2HPO4， 1.5 mM KH2PO4， 0.05% 补间-20）， pH 7.4;液化酶溶液（2毫克/mL液化酶，25 mM Tris-HCl pH8.0，50 mM葡萄糖，10 mM EDTA）;0.0001% 多L-莱辛溶液;99%冷甲醇;99%室温甲醇;99%丙酮;10 well 诊断幻灯片;潮湿室（如步骤1.1.1）中准备）;纸巾;和科普林滑动染色罐。
- 在 Luria-Bertani （LB） 培养30°C的培养基中生长一夜文化，同时摇动。
- 在新鲜的 LB 介质中，将固定培养物稀释到 0.02 的 OD600。在30°C下生长细胞，同时摇动，直到OD600达到0.4对数相细胞。
- 在细胞达到 OD600的 0.4 之前大约 15 分钟，通过在每口井中添加 100 μL 0.0001% 聚L-流并表示来制备聚L-流膜滑片。在室温下孵育幻灯片30分钟。
- 30分钟后用超纯水洗去多余的多聚L-流水，让滑流空气干燥。干滑道可供使用。
- 当细胞达到OD600 0.4时，将培养的1 mL转移到无菌微离心管和颗粒细胞，在2，650 x g下2分钟。
- 在 50 μL 的 LB 培养基中重新悬浮细胞。
- 加入1 mL的冰冷99%甲醇，修复细胞。用手非常轻柔地混合。在-20°C下孵育细胞30分钟。
- 固定后，将20 μL的细胞添加到聚-L-流膜涂层幻灯片中。让滑轨风干30分钟。
- 在每个孔中加入50μL新鲜制备的液干溶液，以消化细胞壁。在25°C下在潮湿室中孵育30分钟。
- 在井边添加纸巾，从井中取出液化溶液。在 100 mL 的 PBS-T 中清洗幻灯片 3 倍。在科普林滑动染色罐中进行每次洗涤 30 s，无需晃动。
- 通过点击纸巾上的幻灯片，从幻灯片中取出洗涤缓冲液。
- 通过在每个孔中加入50μL的99%甲醇来渗透细胞膜。在室温下孵育1分钟。
- 将纸巾放在井边，取出甲醇。
- 在每个井中加入 50 μL 的 99% 丙酮。孵育1分钟。
- 将纸巾放在井边，去除多余的丙酮。让幻灯片风干。此时，细胞已准备好进行接近结扎测定协议，将在第 4 节中讨论。
4. 邻近结扎测定
- 准备以下材料：阻塞缓冲液;抗体稀释缓冲液;洗涤缓冲液"A" = （10 mM Tris， 150 mM NaCl， 0.05% 补间-20） pH 7.4;清洗缓冲液"B"= （200 mM Tris， 100 mM NaCl） pH 7.4;抗兔子二级抗体加;抗小鼠二次抗体减度;5x 结扎缓冲液;利加塞;5x 放大缓冲液（橙色：=前554 nm;μem 576 nm）;聚合酶;超纯水;和包含 DAPI 的安装介质。
注： PLA 检测试剂也可用于变型绿色 （+ex 495 nm; +em 527 nm）， 红色 （+ex 594 nm; +em 624 nm）， FarRed （+ex 644 nm; +em 669 nm） 或光明场 （马萝卜过氧化物酶 （HRP） 共偶）。 - 通过向每个井添加一滴阻塞缓冲区来阻止单元格。在潮湿的室内37°C下孵育30分钟。
- 通过稀释抗体稀释缓冲液中的库存抗体制备抗体溶液。对于每口井需要40μL的抗体溶液。
- 将纸巾放在井边，去除阻塞缓冲液。在每个井中加入40μL的抗体稀释剂。在37°C的潮湿腔室中孵育60分钟，或在4°C下孵育过夜。
- 在井边放置一张纸巾，从井中取出抗体溶液。在科普林滑动染色罐中将 2x 在 100 mL 的洗涤缓冲液"A"中清洗 2 倍，无需晃动。
- 在洗涤步骤中，稀释5倍二级抗体探针，抗兔子PLUS和抗小鼠减号（探针的物种特异性取决于所使用的主要抗体），在抗体稀释缓冲液中。每口井制备40μL的抗体溶液。
- 在每个井中加入40μL的二级抗体溶液。在潮湿的室内37°C下孵育60分钟。
- 在井边放置一张纸巾，从井中取出二级抗体溶液。在科普林滑动染色罐中将 2x 在 100 mL 的洗涤缓冲液"A"中清洗 2 倍，无需晃动。
- 在注射过程中，通过混合8μL的5x结扎缓冲液、31μL的超纯水和1μL的利扎酶，每口井制备40μL的结扎混合物。
- 在每个井中加入40μL的结扎混合物。在潮湿的室内37°C下孵育30分钟。
- 将纸巾放在井边，从井中取出结扎混合物。在科普林滑动染色罐中将 2x 在 100 mL 的洗涤缓冲液"A"中清洗 2 分钟，无需晃动。
- 在浇解过程中，通过混合8μL的5倍扩增溶液、31.5μL的超纯水和0.5μL的聚合酶，每口井制备40μL的扩增混合物。
注：5倍放大包含荧光探针。保护这种混合物免受光线照射。此外，在以下步骤中保护幻灯片免受光线照射。如果使用半透明的科普林滑动染色罐和潮湿的腔室，将它们包裹在铝箔中。 - 每口井加入40μL的扩增混合物。在潮湿的室内37°C下孵育100分钟。
- 从井中取出扩增混合物。在科普林滑动染色罐中清洗 2x 在 100 mL 中的洗涤缓冲液"B"，无需晃动 10 分钟。
- 在 100 mL 的洗涤缓冲液"B"中将 1：100 稀释在科普林滑动染色罐中的超纯水中，30 s。
- 在幻灯片中添加 20 μL 的 DAPI，每口井包含安装介质。用盖玻片合上幻灯片，用指甲油密封滑轨。
- 如果成像，立即孵育含有安装介质 10-15 分钟的 DAPI，同时防止光线照射。如果没有，将幻灯片存放在 -20°C 长达 1 周，防止光线照射。
5. 检测
- 使用共聚焦显微镜获取HeLa、S.cerevisae和大肠杆菌细胞的图像，分别具有20x/0.8 NA、63x/1.4 NA和100x/1.4 NA计划异色物物。 使用 405 nm 脉冲二极管激光器激发 DNA 染色 DAPI。对于 PLA 信号（本研究）激发 561 nm 固态激光。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
我们以前使用纯化蛋白质的体外研究表明，人类A类和B类JDPs的子集形成瞬态混合类JDP复合物，以有效地靶向广泛的聚合蛋白，并可能促进基于Hsp70的组装蛋白质异化7。我们利用PLA来确定混血类（A+B）JDP复合物是否发生在人类宫颈癌细胞（HeLa）中。人类JDPsDNAJA2（A类）和DNAJB1（B类）被以高度特异性原抗体和二级PLA探针（图2A-C）为目标。红色荧光素的出现表明在HeLa细胞中存在混合类DNAJA2和DNAJB1复合物（图2C），证实了我们以前的生化发现7。每个双子细胞代表HeLa细胞细胞胶/核中的单个蛋白质相互作用事件。
先前从Fürster共振能量转移（FRET）获得的生化结果，它检测蛋白质相互作用作为从附着在一种蛋白质的兴奋供体荧光荧光到合适的受体荧光荧光的量的读出附于第二种蛋白质上，表明类似的混合类复合物也可能发生在酵母JdPs之间，体外8。确认我们的生化发现，我们观察到Ydj1（A类）和Sis1（B类）在单细胞真核酸S.cerevisae（贝克酵母）细胞与PLA（图2F）之间的混合类复合物的形成。在酵母中，由于其细胞大小小和多点光大的凝聚，PLA产生的单个荧光点通常难以区分。在人类和酵母细胞8中敲除或击倒相互作用的JDPs后，荧光双体形成显著减少，这表明PLA在捕获这些共体复合物时具有很高的特异性。单元格类型。与真核对口相反，原核素（大肠杆菌）JDPs缺乏形成混合类JDP复合物的能力，并且在功能上合作促进蛋白质分解，体外8。与生化分析一致，我们没有观察到细菌DnaJ-YFP（A类）和CbpA-mCherry（B类）之间的混合类JDP复合形成，这是大肠杆菌中唯一的JDPs（图2I）。然而，我们的 PLA 设置能够捕获涉及两个 JdP 的其他陪同组件。例如，我们检测到DnaJ-YFP和DnaK（细菌Hsp70）和CbpA-mCherry和DnaK8（未显示的数据）之间的伴郎复合物。 这两种细菌伴生复合物在体外和体内具有广泛的特征，8、11、12因此证实了我们的PLA结果。这些观察结果共同证明了解放军在单细胞/多细胞真核细胞和原核细胞中强健地捕获瞬态形成伴生机的能力。技术控制缺乏对一个相互作用的JDPs/Chaperones的初级抗体，但同时包含小鼠和兔子衍生的二级PLA探针，显示很少或根本没有背景荧光信号（图2A，B，D，E，G，H，J，K表示在我们的实验设置中缺乏误报信号放大。
图 1：邻近连结测定的按时间顺序排列的图形表示。（1） 蛋白质 A 和蛋白质 B 之间的复杂性 （2） 原发性 （1°） 抗体（绿色和浅棕色）与蛋白质 A 和 B 结合。两种主要抗体必须在不同的宿主物种（如小鼠、兔子或山羊）中引起。（3） 初级抗体通过物种特异性二级（2°）抗体与DNA寡核糖核酸标记（PLA探针）共价附着。（4） 当蛋白质A和B处于复杂时，结合的PLA探针非常接近，便于DNA寡聚物与连接器DNA链杂交，从而产生圆形DNA分子的形成。随后，DNA连带通过催化磷脂键的形成，促进DNA链的联接。（5） 在37°C时通过细菌DNA聚合酶启动循环DNA分子的滚环扩增（RCA）。（6） 生成附着在一个次级抗体上的单链串联DNA分子。（7） 荧光标记互补寡核苷酸探针杂交到串联DNA分子中独特的重复序列。杂交步骤后，串联DNA分子可以可视化为固定细胞中靶向蛋白复合物位置的亮荧光点。底部表示 PLA 技术适用的原核细胞和真核细胞类型。请点击此处查看此图的较大版本。
图 2.解放军在原核细胞和真核细胞中捕获的分子伴菜组件。（A-C） 检测人类宫颈癌细胞系HeLa中DNAJA2（A类）和DNAJB1（B类）之间形成的混合类JDP复合物。PLA单独使用（A） 抗DNAJA2抗体（阴性技术控制）;（B） 仅抗DNAJB1抗体（阴性技术控制）;（C） 抗DNAJB1和抗DNAJA2抗体结合在一起.面板C（正信号）中出现多个荧光点，表明DNAJA2和DNAJB1之间形成的蛋白质复合物的存在。每个红色荧光点/点表示单个相互作用。核 （DNA） 与 DAPI （青色） 染色。（D-F）检测在S.cerevisae细胞中的Ydj1（A类）和Sis1（B类）之间形成的混合类JDP复合物。（D） PLA 单独使用抗 Ydj1 抗体（阴性技术控制）;（E） PLA 单独使用抗Sis1抗体（阴性技术控制）;（F） PLA 与抗Ydj1和反Sis1抗体一起进行。正荧光信号表示Ydj1和Sis1复合物在S.cerevisae中的存在。酵母核沾染了DAPI（青色）。（G-L）检测大肠杆菌细胞中原核Hsp70（DnaK）和JDPs（DnaJ和CbpA）之间形成的伴松复合物。由于缺乏针对原核JdPs的特异性原抗体，大肠杆菌DnaJ（A类）和CbpA（B类）分别被标记为YFP和mCherry。 （G， J）PLA单独使用反YFP（负技术控制）;（H） PLA 单独使用反 mCherry（负技术控制） 进行。（I） PLA 使用抗YFP和抗mCherry抗体进行。缺乏荧光点的形成表明DnaJ和CbpA之间没有复杂的形成。（K） PLA 单独使用抗DnaK抗体（阴性技术控制）。（L） PLA 与抗YFP和反DnaK抗体一起进行。正荧光信号表示DnaK和DnaJ之间的复杂形成。细菌DNA染色DAPI（青色）。除了包含单个原抗体外，所有阴性技术控制均在相应的二级PLA探针存在的情况下进行。刻度条 = 10 μm。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
基于共免疫沉淀和共同定位的方法一直被用作描述蛋白质组装的长期方法。检测瞬时形成的特定伴郎复合物是这种传统方法的一大挑战，因此，以前的发现主要限于定性解释。基于细胞莱沙的共免疫沉淀技术通常需要交联以稳定蛋白质-蛋白质的相互作用。细胞莱沙会增加破坏瞬时形成的伴生复合物的风险，而交联可能引入非原生相互作用，特别是由大多数伴生者固有的"粘性"驱动。当使用共免疫沉淀分析Hsp70伴郎系统时，潜在的伪影可能来自（a）伴菜的高表达水平和（b）与膜或蛋白质聚合结合的伴郎机有关的溶解度问题。此外，基于共免疫沉淀的技术没有提供关于捕获的蛋白质组件的细胞定位的信息，这对界定相关功能可能很重要。在基于共同本地化的方法来保存蛋白质本地化信息时，使用共免疫沉淀技术的缺点有所减少。然而，两个或两个以上蛋白质的共同定位可能表明蛋白质直接关联或蛋白质分裂到细胞中的同一微域。因此，共同定位分析充其量是预测蛋白质相互作用的推测性，并且缺乏任何接近价值。由于对靶蛋白的批量和滥检，该技术在研究细胞中的特定蛋白质组成方面非常有限。当靶向蛋白可以同时形成广泛的不同蛋白质组成时，这个问题就特别成问题，就像Hsp70伴郎系统一样。与这些常规方法相比，PLA 是一种更精细的原位技术，用于通过保留的蛋白质定位信息强力检测和量化细胞中的原生蛋白关联。此测定基于靶向蛋白质之间的接近度（约 10-30 nm）揭示了蛋白质相互作用。PLA 是"可调整的"，因为通过 （a） 减少连接到 PLA 探测器的寡核苷酸标记的长度和/或 （b） 将标记直接与初级抗体结合，可以减小接近距离的范围，以获得更严格的读出。在解释积极的 PLA 信号时，应小心谨慎。理想情况下，蛋白质相互作用应该用两种或两种以上独立的方法加以确认。PLA 中的荧光信号强度与相互作用的蛋白质之间的蛋白质簇大小或分离距离没有确定性的关系，如 FRET 的情况。然而，PLA具有很高的特异性和敏感性，甚至可用于分析生长因子或细胞因子等极低丰富的蛋白质及其在稀有细胞类型或临床标本中的相互作用。
Hsp70 伴侣在其细胞寿命14期间与多个共同伴侣（例如 JdPs 和 NEF）合作，以驱动不同的生物功能。可能的 Hsp70-JDP-NEF 机器配置的数量及其在单元中的动态行为在很大程度上阻碍了对这些陪同机特定角色的详细理解。因此，需要生物工具来对不同的Hsp70组件进行选择性追踪，以解剖细胞中这种伴生网络的整体布线。瞬时形成的JDP-JDP和JDP-Hsp70伴生复合物7在具有PLA的细胞中被有效捕获，表明该技术适用于研究具有高解结常数的分子相互作用（例如，>3 μM Kd).虽然，在目前的工作中，测定主要用作"是"或"否"类型的二进制指标，用于伴郎交互，但用户可以利用这种技术通过数字计数荧光来获得交互程度的半定量读出信号强度15。然而，由于解放军信号的非线性放大，在定量解读解放军数据时应小心谨慎。尽管具有上述优点，但这种方法还是有一定的局限性。PLA 的主要缺点是，测定需要细胞固定，从而在很大程度上限制了其解决活细胞中蛋白质复合时间动力学的能力。相比之下，体内FRET17或生物发光共振能量转移（BRET）18允许监测类似蛋白质相互作用在接近值相对较小的活细胞（<10 nm）中。与 PLA 相比，FRET 信号与蛋白质表达水平16具有严格的线性相关性，使 FRET 成为蛋白质相互作用定量分析的黄金标准。然而，与FRET对神秘方向因子[2'的依赖不同，PLA不受解放军探测器方向的影响，这增加了捕获蛋白质复合物19的概率。在用户友好性方面，FRET 和 BRET 需要独特的专业知识，因此通常限制这些方法在更广泛的研究界中的可及性。此外，这两种技术都需要通过附加可能干扰蛋白质功能和复杂形成的大量发光/荧光蛋白标记来修饰相互作用的蛋白质。
以下步骤（1-4）需要仔细考虑，以便在单元中成功实施 PLA。（1） 抗体选择：市售的PLA试剂盒仅与针对小鼠、兔子和山羊的主要抗体兼容。PLA 需要高度特异性的初级抗体，这些抗体不会与目标结合。此外，选择与免疫组织化学 （IHC）、酶相关免疫吸附测定 （ELISA） 和/或免疫沉淀 （IP） 等应用兼容的主要抗体非常重要，以确保抗体能够识别暴露在折叠蛋白表面的抗原氨基酸序列。在使用之前，强烈建议测试所有初级抗体的特异性。这可以通过整个细胞乳液的西斑分析来执行。如果靶向蛋白具有大小和序列相似性的微小变化（例如，Hsp70 和 JDP 参数），则抗体的特异性可以通过基因敲除/敲入方法或针对纯化进行探测来测试同源，以排除任何潜在的交叉识别。如果没有合适的抗体，靶向蛋白可以标记具有可接受质量的抗体的表位（图 2F).（2）细胞的固定和渗透：分别用于治疗4%的甲醛和0.1-0.5%的Triton-X100，用于修复和渗透细胞。使用4%的甲醛是保存蛋白质-蛋白质相互作用和细胞超结构的更好治疗，而使用99%甲醇的固定条件20,21,22.使用 99% 甲醇固定细胞，但是，产生较少的细胞质背景染色，也许更适合于特定情况，如检测细胞骨架相关的蛋白质组件21,22.非离子表面活性剂Triton-X100可有效渗透血浆膜和细胞膜，提高抗体可访问性。然而，Triton-X100 可以非特有去除血浆膜中的蛋白质23,24.因此，为了分析与细胞膜相关的蛋白质组件，可以应用替代洗涤剂，如皂苷或数字酮，用于渗透膜的固醇21,22,25.（3） 细胞壁的破裂：在膜渗透之前，需要再采取一个步骤，使用特定的溶酶，以提高具有细胞壁（如真菌、植物和细菌细胞）的细胞类型中抗体的渗透性。例如，我们采用了溶质，它降解β-葡甘，以破坏细胞壁S. cerevisiae26.同样，E. coli细胞壁被破坏使用酶酶，一种酶，针对肽类酶27,28.细胞壁组成和裂解酶敏感性随生长条件的不同而变化26和文化融合29,30.因此，溶酶的浓度和消化时间可能有所不同，必须注意防止细胞消化过度或不足。细胞壁消化后，细胞相对脆弱，需要挤占物质，如山梨醇，使其在洗涤过程中保持完好无损。（4）DNA扩增：DNA结扎和滚动圈PCR反应步骤对温度和湿度波动敏感。为了确保可靠的DNA扩增和检测的可重复性，这些反应需要在37°C的湿度室中进行。重要的是，在进行检测时，应防止被执行细胞干燥，以避免任何可能导致背景信号增加的非特异性抗体结合和DNA扩增事件。
综上所述，实施此检测不需要独特的专业知识和精密的仪器。JDP-JDP和JDP-Hsp70伴郎复合物的成功监测表明，该技术有可能应用于追踪所有细胞类型中瞬态形成的蛋白质组。我们在酵母和细菌中实施该技术，大大提高了 PLA 在研究各种生物体中由不同蛋白质组件介导的各种生物过程的适用性。此外，我们的工作强调PLA是一种有前途的新型蛋白质相互作用工具，用于研究物种8在分子水平上发生的进化变化。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
NBN由莫纳什大学医学护理与健康科学学院提供特别招聘补助金，维多利亚州政府和澳大利亚政府提供资金。我们感谢伯恩德·布考（德国海德堡大学ZMBH）和哈姆·坎金加（荷兰格罗宁根大学细胞与系统生物医学科学系）对试剂霍尔格·洛伦茨（ZMBH）的宝贵支持和共享德国海德堡大学成像设施，支持共聚焦显微镜和图像处理，克莱尔·赫斯特（澳大利亚莫纳什大学ARMI）对手稿进行批判性阅读。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 37% Formaldehyde | Merck | 103999 | |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 32201 | |
| anti-DNAJA2 antibody | Abcam | ab157216 | |
| anti-DNAJB1 Antibody | Enzo Life Sciences | ADI-SPA-450 | |
| anti-DnaK antibody | In house | ||
| anti-mCherry antibody | Abcam | ab125096 | |
| anti-Sis1 Antibody | Cosmo Bio Corp | COP-080051 | |
| anti-Ydj1 antibody | StressMarq Biosciences | SMC-150, | |
| anti-YFP antibody | In house | ||
| Coplin slide-staining jar | Sigma-Aldrich | S5516 | |
| Diagnostic slides | Marienfeld | 1216530 | |
| DMEM | Thermo-Fischer | 31966021 | |
| DuoLink In Situ Detection Reagents Orange | Sigma-Aldrich | DUO92007 | |
| DuoLink In Situ Mounting Medium + DAPI | Sigma-Aldrich | DUO82040 | |
| DuoLink In Situ PLA Probe Anti-Mouse MINUS | Sigma-Aldrich | DUO92004 | |
| DuoLink In Situ PLA Probe Anti-Rabbit PLUS | Sigma-Aldrich | DUO92002 | |
| DuoLink In Situ Wash Buffers, Fluorescence | Sigma-Aldrich | DUO82049 | |
| Fetal Calf Serum | Thermo-Fischer | 10082147 | |
| Lysozyme | Sigma-Aldrich | 62971 | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 32213 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo-Fischer | 15070063 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma-Aldrich | P47-07 | |
| Sorbitol | Sigma-Aldrich | S7547 | |
| Triton-X100 | Merck | 108643 | |
| Trypsin | Thermo-Fischer | 25300096 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Zymolase 100T / / Lyticase | United States Biological | Z1004 |
References
- Soderberg, O., et al. Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation. Nature Methods. 3 (12), 995-1000 (2006).
- Weibrecht, I., et al. Proximity ligation assays: a recent addition to the proteomics toolbox. Expert Review of Proteomics. 7 (3), 401-409 (2010).
- Mayer, M. P., Gierasch, L. M. Recent advances in the structural and mechanistic aspects of Hsp70 molecular chaperones. Journal of Biological Chemistry. 294 (6), 2085-2097 (2019).
- Kampinga, H. H., Craig, E. A. The HSP70 chaperone machinery: J proteins as drivers of functional specificity. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11 (8), 579-592 (2010).
- Nillegoda, N. B., Bukau, B. Metazoan Hsp70-based protein disaggregases: emergence and mechanisms. Frontiers in Molecular Biosciences. 2, (2015).
- Bracher, A., Verghese, J. The nucleotide exchange factors of Hsp70 molecular chaperones. Frontiers in Molecular Biosciences. 2, (2015).
- Nillegoda, N. B., et al. Crucial HSP70 co-chaperone complex unlocks metazoan protein disaggregation. Nature. 524 (7564), 247-251 (2015).
- Nillegoda, N. B., et al. Evolution of an intricate J-protein network driving protein disaggregation in eukaryotes. Elife. 6, (2017).
- Kirstein, J., et al. In vivo properties of the disaggregase function of J-proteins and Hsc70 in Caenorhabditis elegans stress and aging. Aging Cell. 16 (6), 1414-1424 (2017).
- Nillegoda, N. B., Wentink, A. S., Bukau, B.
- Chae, C., Sharma, S., Hoskins, J. R., Wickner, S. CbpA, a DnaJ homolog, is a DnaK co-chaperone, and its activity is modulated by CbpM. Journal of Biological Chemistry. 279 (32), 33147-33153 (2004).
- Kityk, R., Kopp, J., Mayer, M. P. Molecular Mechanism of J-domain-Triggered ATP Hydrolysis by Hsp70 Chaperones. Molecular Cell. 69 (2), 227-237 (2018).
- Söderberg, O., et al. Characterizing proteins and their interactions in cells and tissues using the in situ proximity ligation assay. Methods. 45 (3), 227-232 (2008).
- Benschop, J. J., et al. A consensus of core protein complex compositions for Saccharomyces cerevisiae. Molecular Cell. 38 (6), 916-928 (2010).
- Jung, J., et al. Quantifying RNA-protein interactions in situ using modified-MTRIPs and proximity ligation. Nucleic Acids Research. 41 (1), (2013).
- Mocanu, M. M., Váradi, T., Szöllosi, J., Nagy, P. Comparative analysis of fluorescence resonance energy transfer (FRET) and proximity ligation assay (PLA). Proteomics. 11 (10), 2063-2070 (2011).
- Sekar, R. B., Periasamy, A. Fluorescence resonance energy transfer (FRET) microscopy imaging of live cell protein localizations. Journal of Cell Biology. 160 (5), 629-633 (2003).
- Deriziotis, P., Graham, S. A., Estruch, S. B., Fisher, S. E. Investigating protein-protein interactions in live cells using bioluminescence resonance energy transfer. Journal of Visualized Experiments. 87, (2014).
- Nagy, P., Szöllosi, J. Proximity or no proximity: that is the question – but the answer is more complex. Cytometry. 75 (10), 813-815 (2009).
- Hoetelmans, R. W., et al. Effects of acetone, methanol, or paraformaldehyde on cellular structure, visualized by reflection contrast microscopy and transmission and scanning electron microscopy. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 9 (4), 346-351 (2001).
- Schnell, U., Dijk, F., Sjollema, K. A., Giepmans, B. N. Immunolabeling artifacts and the need for live-cell imaging. Nature Methods. 9 (2), 152-158 (2012).
- Stadler, C., Skogs, M., Brismar, H., Uhlen, M., Lundberg, E. A single fixation protocol for proteome-wide immunofluorescence localization studies. Journal of Proteomics. 73 (6), 1067-1078 (2010).
- Goldenthal, K. L., Hedman, K., Chen, J. W., August, J. T., Willingham, M. C. Postfixation detergent treatment for immunofluorescence suppresses localization of some integral membrane proteins. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 33 (8), 813-820 (1985).
- Schrader, M., Almeida, M., Grille, S. Postfixation detergent treatment liberates the membrane modelling protein Pex11beta from peroxisomal membranes. Histochemistry & Cell Biology. 138 (3), 541-547 (2012).
- Willingham, M. C., Yamada, S. S., Pastan, I. Ultrastructural antibody localization of alpha2-macroglobulin in membrane-limited vesicles in cultured cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 75 (9), 4359-4363 (1978).
- Aguilar-Uscanga, B., Francois, J. M. A study of the yeast cell wall composition and structure in response to growth conditions and mode of cultivation. Letters in Applied Microbiology. 37 (3), 268-274 (2003).
- Romaniuk, J. A., Cegelski, L. Bacterial cell wall composition and the influence of antibiotics by cell-wall and whole-cell NMR. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 370, 1679 (2015).
- Salazar, O., Asenjo, J. A.
- Cunningham, A. F., Spreadbury, C. L. Mycobacterial stationary phase induced by low oxygen tension: cell wall thickening and localization of the 16-kilodalton alpha-crystallin homolog. Journal of Bacteriology. 180 (4), 801-808 (1998).
- Werner-Washburne, M., Braun, E., Johnston, G. C., Singer, R. A. Stationary phase in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Microbiological Reviews. 57 (2), 383-401 (1993).
