Summary
Cognate J-도메인 단백질은 Hsp70 샤페론과 협력하여 단백질 폴딩에서 분해에 이르는 수많은 생물학적 과정을 지원합니다. 여기서, 우리는 세균, 효모 및 인간 세포에서 이러한 과도하게 형성된 샤페론 기계의 모니터링을 허용하는 내부 근접 결찰 분석에 대해 설명합니다.
Abstract
J 도메인 단백질 (JDPs)은 진핵 세포에서 가장 크고 가장 다양한 코 샤페론 패밀리를 형성합니다. 최근 연구 결과에 따르면 JDP 패밀리의 특정 구성원은 진핵생물에서 일시적인 이종 복합체를 형성하여 70kDa 열 충격 단백질(Hsp70) 샤페론 계 단백질 다이그레그가스에 대한 기질 선택을 미세 조정할 수 있음을 보여줍니다. JDP 복합체는 급성/만성 스트레스 유발 응집 단백질을 표적으로 하고 아마도 단백질 응집체의 표면에 다중 Hsp70s를 모집하여 분리증을 조립하는 것을 돕습니다. 이러한 물리적으로 상호 작용하는 JDP에 의해 형성된 단백질 품질 관리(PQC) 네트워크의 범위는 생체 내에서 크게 특성화되지 않은 채로 남아 있다. 여기서, 우리는 진핵 세포의 뚜렷한 세포 구획에서 이러한 과도하게 형성된 샤페론 복합체를 강력하게 포획할 수 있는 근접 결찰 분석법(PLA)이라는 이름의 현장 단백질 상호작용 분석법에 근거한 현미경 검사법을 기술한다. 우리의 일은 인간 세포에서 효모(Saccharomyces cerevisiae)와박테리아(대장균)로PLA의 고용을 확장하여 일시적으로 형성 된 단백질 어셈블리의 역학을 모니터링하는 중요한 도구가되었습니다. 시핵 세포와 진핵 세포.
Introduction
세포 상호 작용에 대한 우리의 불완전한 이해로 인해 광대한 양의 유전체 정보는 해석할 수 없습니다. 화학적 가교 및 단백질 공동 국소화가 없는 단백질 공동 면역 침전과 같은 기존의 단백질-단백질 상호 작용 검출 방법론은 널리 사용되지만 다양한 단점을 제기합니다. 주요 단점 중 일부는 상호 작용의 가난한 정량화 및 비 네이티브 바인딩 이벤트의 잠재적인 도입을 포함 합니다. 비교에서, 새로운 근접 기반 기술은 세포에서 단백질 상호 작용을 포착하기위한 대안과 강력한 접근 방식을 제공합니다. 근접 결찰 분석(PLA)1은 현재 독점 키트로 사용할 수 있으며, 상호 작용하는 하위 단위의 근접에 기초하여 단백질 복합체를 구체적으로 표적화하는 항체를 사용합니다.
PLA는 표적 단백질 복합체의 표면에 작은 DNA 태그(PLA 프로브)를 가진 1차 및 이차 항체로 구성된스캐폴드의 형성에 의해 개시된다(도 1, 단계 1-3). 다음으로, DNA 태그의 근접에 의해 결정되며, 원형 DNA 분자는 커넥터 올리고뉴클레오티드를 가진 혼성화를 통해 생성된다(도1,단계 4). 원형 DNA의 형성은 DNA 결찰 단계에 의해 완료된다. DNA의 새로 형성된 원형 조각은 공액된 올리고뉴클레오티드 태그 중 하나에 의해 프라이밍된 후속 압연 원형 증폭(RCA) 기반 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 위한 템플릿역할을 한다. 이는 항체 스캐폴드를 통해 단백질 복합체에 부착된 단일 가선 형DNA 분자를 생성한다(도 1, 단계 6). 결합성 DNA 분자는 증폭된 DNA에 걸쳐 흩어져 있는 다중 고유 서열로 혼성화하는 형광표지된올리고뉴클레오티드를 사용하여 가시화된다(도 1, 단계 7)2. 생성된 PLA 신호는 형광점(도 1,단계 7)으로 나타나며, 세포 내의 표적 단백질 복합체의 위치에 대응한다. 그 결과, 분석은 높은 공간 정확도로 단백질 복합체를 검출할 수 있었습니다. 이 기술은 단순히 단백질 상호 작용을 포착하는 것뿐만 아니라 고감도1,2를가진 단백질에 대한 단일 분자 또는 단백질 변형을 검출하는 데에도 사용될 수 있다.
Hsp70은 다양한 하우스키핑 및 스트레스 관련 기능에 참여하여 세포 단백질 항상성을 유지하는 데 근본적으로 중요한 매우 다재다능한 샤페론 시스템을 형성합니다. Hsp70 샤페론 시스템의 하우스키핑 활동은 드 노보 단백질 폴딩, 세포막에 걸친 단백질 전좌, 단백질 복합체의 조립 및 분해, 단백질 활성 조절 및 다양한 단백질 폴딩 연결/ 품질 관리 기계3. 동일한 샤페론 시스템은 또한 잘못 접히고/ 전개된 단백질을 다시 접고, 단백질 응집을 방지하고, 단백질 분해를 촉진하고, 세포 단백질을 분해하여 말기 잘못 접히지/손상된 단백질을 분해하여 세포 복구를 용이하게 합니다. proteotoxic 스트레스4,5. 이러한 기능적 다양성을 달성하기 위해 Hsp70 샤페론은 JDP 제품군과 뉴클레오티드 교환 인자(NEF)의 공동 샤페론과 협력하여 Hsp70의 ATP 의존적 알로스테릭 제어를 미세 조정하여 기질 결합 및 방출3, 6. 또한 JDP 코샤페론은 이 다재다능한 샤페론 시스템을 위한 기판을 선택하는 데 중요한 역할을 합니다. 이 가족의 구성원은 프로토 타입 JDP, 대장균 DnaJ에 자신의 구조적 상동성에 따라 세 가지 클래스 (A, B 및 C)로 세분화된다. 클래스 A JDPs는 Hsp70, 글리신 페닐알라닌 리치 영역, 아연 핑거상 영역(ZFLR) 및 2개의 β 배럴 도메인으로 구성된 기질 결합 영역및 C-말단 이화 도메인과 상호 작용하는 N-말단 J 도메인을 포함합니다. N 말단 J 도메인과 글리신 페닐알라닌 부유 한 영역을 가진 JDP, 하지만 ZFLR 부족, 클래스 B에 빠진다. 일반적으로 이 두 클래스의 구성원은 보호 기능에 관여합니다. J-도메인 4만 공유하는 JDP가 포함된 캐치올 클래스C에 속하는 회원은 Hsp70s를 모집하여 다양한 비보호자 기능을 수행합니다. Hsp70 시스템의 교환 가능한 기판 인식 "어댑터"로서 JDP의 중요한 역할은 진화 하는 동안 가족 구성원의 확장에 의해 반영 됩니다. 예를 들어, 인간은 42 개이상의 별개의 JDP 회원 4. 이러한 JDP는 단량체, 호모 및 / 또는 호모/ 헤테로 올리고머로 기능 4,5. 최근, 클래스 A 사이의 일시적인 복합형성을 통한 기능적 협력(예를 들어, H. Sapiens DNAJA2; S. 세레비시아Ydj1) 및 B급(예를 들어, 에이치사피엔스 DNAJB1; S. 세레비시아Sis1) 진핵 JDPs는 시험관 내 무정형 단백질 응집체의 효율적인인식을 촉진시키는 것으로 보고되었다 7,8. 이러한 혼합 클래스 JDP 복합체는 아마도 Hsp70- 및 Hsp70+Hsp100 기반 단백질 분해제 7,8,9의 형성을 용이하게 하기 위해 응집된 단백질의 표면에 조립됩니다. 10.진핵 세포에서 이러한 과도적으로 형성된 혼합형 JDP 복합체의 존재를 뒷받침하는중요한 증거는 PLA 8을 구비하였다.
PLA는 주로 포유류 세포에서 메타조아에서 단백질 상호 작용을 평가하기 위해 점점 더 많이 사용됩니다. 여기에서, 우리는 신진 효모 S. cerevisiae 및 박테리아 대장균과 같은 진핵과 원핵 세포 단세포 유기체에 있는 일시적으로 형성된 chaperone 복합체를 감시하기 위하여 이 기술의 성공적인 확장을 보고합니다. 중요한 것은, 이 확장은 인간과 동물 세포를 감염시키는 미생물을 검출하고 분석하기 위한 PLA의 잠재적인 사용을 강조합니다.
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Protocol
1. 헬라 세포 준비
- 다음 자료를 준비: PBS (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4,1.8 mM KH2PO4),pH 7.4; DMEM, 10% FCS와 1% 펜-스트렙으로 보충; PBS에서 4% 파라포름알데히드; PBS에서 0.5 % 트리톤 - X100; TBS-T (150 mM NaCl, 20 mM 트리스, 0.05% 트웬), pH 7.4; 0.0001 % 멸균 폴리 - L-리신 용액; 10 웰 진단 슬라이드; 습한 챔버; 티슈 페이퍼; 그리고 코플린 슬라이드 염색 항아리.
참고: 최적의 고정 효율을 보장하기 위해 파라포름알데히드 용액은 모든 실험 전에 신선하게 준비되어야 합니다. - 젖은 조직으로 닫힌 상자의 바닥을 덮어 습한 챔버를 준비하십시오. 실험을 시작하기 전에 습한 챔버를 37°C에 놓고, 효소 반응을 배양하면서 챔버 온도가 37°C에 있는지 확인합니다.
- T25 플라스크에서의 배양 헬라 세포는 5% CO2를 함유하는 37°C CO2 인큐베이터에서 10% FCS 및 1% 펜-스트렙으로 보충된 DMEM의5 mL(고당포도, 글루타메이트 및 나트륨 피루베이트 보충제)에서. 0.05% 트립신-EDTA를 사용하여 부착 세포를 해리. 해리 된 세포에 신선한 DMEM을 첨가 한 후 세포 계수 챔버를 사용하여 세포를 계산하고 습한 챔버 내부의 진단 슬라이드에서 성장하십시오.
- 멸균 세포 배양 후드에서 UV-조사에 의한 진단 슬라이드를 30분 동안 살균합니다.
- 실험에 필요한 각각의 웰에 0.0001% 폴리-L-리신을 여과된 멸균 100 μL을 첨가한다. 30 분 동안 배양. 50 μL 초순수로 각 우물을 3 x 세척하여 여분의 폴리 - L-리신을 씻어.
- HeLa 세포를 트립시니화하고 각 우물에 대략 15,000개의 세포를 추가합니다. 필요한 경우, 세포를 웰당 적어도 30-50 μL의 DMEM으로 희석한다.
- 약 24 시간 동안 37°C 5% CO2 인큐베이터 내에서 습한 챔버에서 세포를 성장시려면 PLA를 시작하기 전에 세포가 60%-80% 동률이어야 한다.
참고: 컨플루도가 너무 높면 시약의 흡수가 감소하여 프로토콜이 끝날 때 얻은 신호가 감소합니다. - 우물 가장자리에 티슈 페이퍼를 놓아 매체를 제거합니다. PBS 50 μL로 우물을 3배 씻으소서.
참고: 세포는 액체가 가혹하게 첨가될 때 분리될 수 있습니다. 이것은 새로운 액체를 추가하기 전에 우물을 완전히 건조시키지 않고 새로운 액체를 우물 가장자리에 부드럽게 첨가하여 방지 할 수 있습니다. - 각 우물에 PBS에 갓 제조된 4% 파라포름알데히드 50 μL을 첨가하여 세포를 고정시. 실온에서 10 분 동안 배양하십시오.
- PBS에서 슬라이드를 3x 세척합니다. PBS 100 mL를 포함하는 코플린 슬라이드 염색 용기에서 세서를 수행합니다. 각 세척시, 흔들림없이 실온에서 5 분 동안 배양하십시오.
- 코플린 슬라이드 염색 항아리에 PBS에서 0.5% 트리톤-X100의 100 mL로 슬라이드를 침수시킴으로써 세포막을 퍼메빌화한다. 흔들리지 않고 실온에서 10 분 동안 배양하십시오.
- TBS-T에서 슬라이드를 3배 씻으십시오. 100 mL의 TBS-T가 들어있는 코플린 슬라이드 염색 용기에서 세서를 수행합니다. 각 세척시, 흔들림없이 실온에서 5 분 동안 배양하십시오.
- 마지막 세척 후, 티슈 페이퍼로 여분의 완충제를 제거하십시오. 이 시점에서 세포는 섹션 4에서 논의될 근접 결찰 분석 프로토콜에 대해 준비됩니다.
2. S. 세레비시아 세포 준비
- 다음 물질을 준비한다: 100mM KPO 4, pH 6.5, 세척 완충제라고 한다; 37% 포름알데히드; 100 mM KPO4,pH 6.5에서 4 % 파라 포름 알데히드; 1.2 M 소르비톨 100mM KPO 4, pH 6.5; 리티케이스 용액(500 μg/mL 리티케이스, 20 mM β-메르카포에탄올,100 mM KPO 4, pH 6.5); 0.0001 % 폴리 - L-리신 용액; 1% 트리톤-X100 에서 100mM KPO 4, pH 6.5; 10 웰 진단 슬라이드; 습한 챔버 (단계 1.2에서와 같이 제조); 티슈 페이퍼; 그리고 코플린 슬라이드 염색 항아리.
참고: 최적의 고정 효율을 보장하기 위해 파라포름알데히드 용액은 모든 실험 전에 신선하게 준비되어야 합니다. - 비선택적 효모 추출물, 펩톤 및 덱스트로스(YPD) 배지에서 30°C에서 하룻밤 배양한 후 흔들어.
참고: 실험 요건에 따라 S. 세레비시아세포는 합성 완전(SC) 배지 또는 선택적 합성 최소체(SM) 배지에서 대신 재배될 수 있다. - 고정 배양을 20 mL 배지에서 0.1의 OD600으로 희석한다. OD 600이 0.5에 도달할 때까지 흔들면서 30°C에서 세포를 성장시다.
- 20 mL 배양을 50 mL 원심 분리튜브로 옮김을 옮김. 665 x g에서 원심분리하여 세포를 3 분 동안 펠렛. 신선한 배지의 5 mL에서 세포를 다시 일시 중단하십시오.
- 배양에 37% 포름알데히드의 550 μL을 첨가하여 세포를 고정시다. 실온에서 15분 동안 배양합니다.
- 665 x g에서 원심분리하여 세포를 3 분 동안 펠렛. 세척 버퍼에서 갓 제조 된 4 % 파라 포름 알데히드의 1 mL에 펠릿을 다시 일시 중단하십시오. 실온에서 45 분 동안 배양하십시오.
- 인큐베이션 동안, 각각의 웰에 0.01% 폴리-L-리신 용액의 100 μL을 첨가하여 진단 슬라이드를 준비한다. 실온에서 30 분 동안 슬라이드를 인큐베이션합니다.
- 30분 후, 여분의 폴리-L-리신을 초순수로 씻어내고 슬라이드를 공기 건조시키세요. 드라이 슬라이드를 사용할 준비가 되었습니다.
- 세척 버퍼 1 mL로 세포를 두 번 씻으하십시오. 665 x g에서 3 분 동안 세포의 원심 분리에 의해 세척을 수행합니다.
- 665 x g에서 원심분리하여 세포를 3 분 동안 펠렛. 세척 버퍼에서 1.2 M 소르비톨의 1 mL에서 세포를 다시 중단하십시오.
- 665 x g에서 원심분리하여 세포를 3 분 동안 펠렛. 세포벽을 소화하기 위해 갓 제조된 Lyticase 용액의 250 μL에서 펠릿을 다시 일시 중단합니다. 세포를 30°C에서 15분 동안 리티케이스 용액으로 배양하면서 흔들어.
- 소화 후, 세포를 665 x g에서 원심분리하여 3분 동안 3회 세척하고 상류제를 제거합니다. 세척 버퍼에서 1.2 M 소르비톨의 250 μL에서 세포를 다시 중단시다.
참고: 세포는 세포 벽 소화 후에 깨지기 쉽기 때문에 세포를 손상시키지 않도록 매우 신중하게 다시 일시 중단하십시오. - 폴리-L-리신 코팅 슬라이드에 20 μL의 재부유 세포를 추가합니다. 30 분 동안 슬라이드에 부착 할 수 있습니다. 세척 버퍼의 50 μL로 우물을 3 x 세척하여 비 부착 세포를 씻어 내십시오.
- 세척 버퍼에서 1% 트리톤-X의 50 μL로 3x세척하여 세포막을 투과시켜 세포막을 퍼메라빌화합니다.
참고: 이 시점에서 세포는 섹션 4에서 논의될 근접 결찰 분석 프로토콜에 대해 준비된다.
3. 대장균 세포 준비
- 다음 자료를 준비: PBS-T (140 mM NaCl, 2 mM KCl, 8 mM K2HPO4,1.5 mM KH2PO4,0.05% 트웬-20), pH 7.4; 리소자임 용액(2 mg/mL 리소자임, 25 mM Tris-HCl pH 8.0, 50 mM 포도당, 10 mM EDTA); 0.0001 % 폴리 - L-리신 용액; 99% 얼음-차가운 메탄올; 99% 실온 메탄올; 99% 아세톤; 10 웰 진단 슬라이드; 습한 챔버 (단계 1.1.1에서와 같이 제조); 티슈 페이퍼; 그리고 코플린 슬라이드 염색 항아리.
- 루리아-베르타니(LB) 배지에서 30°C에서 하룻밤 배양한 후 흔들어 서 재배한다.
- 고정 배양을 신선한 LB 배지에서 0.02의 OD600으로 희석한다. OD 600이 로그 상 세포에 대해 0.4에 도달할 때까지 흔들면서 30°C에서 세포를 성장시다.
- 세포가 0.4의 OD600에 도달하기 약 15 분 전에, 각각의 우물에 0.0001 % 폴리 L-리신의 100 μL을 추가하여 폴리 L-리신 코팅 슬라이드를 준비합니다. 실온에서 30 분 동안 슬라이드를 인큐베이션합니다.
- 30 분 후 여분의 폴리 -L-리신을 초순수로 씻어 내고 슬라이드를 공기 건조시키십시오. 드라이 슬라이드를 사용할 준비가 되었습니다.
- 세포가 0.4의 OD600에 도달하면, 배양된 1 mL을 멸균 미세원원지 튜브 및 펠릿 세포로 2,650 x g에서 2분 동안 전달한다.
- LB 배지의 50 μL에서 세포를 다시 중단시다.
- 얼음 차가운 99 % 메탄올 1 mL을 추가하여 세포를 수정하십시오. 손으로 매우 부드럽게 섞으세요. -20°C에서 30분 동안 세포를 배양한다.
- 고정 후 폴리-L-리신 코팅 슬라이드에 세포의 20 μL을 추가한다. 슬라이드를 30분 동안 공기 건조시키십시오.
- 세포벽을 소화하기 위해 각 우물에 갓 준비된 리소자임 용액 50 μL을 추가합니다. 25 °C에서 30 분 동안 습한 챔버에서 배양하십시오.
- 우물 가장자리에 티슈 페이퍼를 추가하여 웰에서 리소자임 용액을 제거합니다. PBS-T의 100 mL에서 3 배 슬라이드를 세척하십시오. 코플린 슬라이드 염색 용기에 각 세척을 수행 30 s, 흔들리지 않고.
- 티슈 페이퍼의 슬라이드를 눌러 슬라이드에서 세척 버퍼를 제거합니다.
- 각 우물에 99% 메탄올의 50 μL을 첨가하여 세포막을 투과화한다. 실온에서 1 분 동안 배양하십시오.
- 웰의 가장자리에 티슈 페이퍼를 배치하여 메탄올을 제거합니다.
- 각 우물에 99% 아세톤의 50 μL을 추가합니다. 1 분 동안 배양하십시오.
- 우물 가장자리에 티슈 페이퍼를 배치하여 여분의 아세톤을 제거합니다. 슬라이드를 공기 건조시키십시오. 이 시점에서 세포는 섹션 4에서 논의될 근접 결찰 분석 프로토콜에 대해 준비된다.
4. 근접 결찰 분석
- 다음 자료 준비: 버퍼 차단; 항체 희석 버퍼; 워시 버퍼 'A'– (10 mM 트리스, 150 mM NaCl, 0.05% 트웬-20) pH 7.4; 워시 버퍼 'B'– (200 mM 트리스, 100 mM NaCl) pH 7.4; 항-토끼 이차 항체 PLUS; 항 마우스 이차 항체 MINUS; 5x 결찰 버퍼; 리가제; 5x 증폭 버퍼 (주황색: λex 554 nm; λem 576 nm); 중합효소; 초순수; 및 DAPI를 포함하는 마운팅 매체.
참고: PLA 검출 시약은 또한 변형 녹색 (λex 495 nm; λem 527 nm), 적색 (λex 594 nm; λem 624 nm), FarRed (λex 644 nm; λem 669 nm) 또는 브라이트필드 (고추냉이 퍼옥시다제 (HRP) 컨쥬게이스)를 참조하십시오. - 각 웰에 차단 버퍼 를 추가하여 셀을 차단합니다. 습한 챔버에서 37 °C에서 30 분 동안 배양하십시오.
- 항체 희석 버퍼에서 재고 항체를 희석하여 항체 용액을 준비합니다. 각각의 웰에 대해 40 μL의 항체 용액이 요구된다.
- 웰 의 가장자리에 티슈 페이퍼를 배치하여 차단 버퍼를 제거합니다. 각 우물에 항체 희석 버퍼에 희석된 항체 40 μL을 첨가합니다. 37°C에서 습한 챔버에서 60분 동안 배양하거나 4°C에서 하룻밤 동안 배양한다.
- 우물 가장자리에 티슈 페이퍼를 배치하여 우물에서 항체 용액을 제거하십시오. 코플린 슬라이드 염색 용기에 100 mL의 워시 버퍼 'A'로 2x를 흔들어 주지 않고 5분 동안 세척합니다.
- 세척 단계 동안, 5x 이차 항체 프로브, 항 토끼 PLUS 및 항 마우스 MINUS (프로브의 종 특이성은 사용되는 1 차 항체에 따라 다름), 항체 희석 버퍼를 희석한다. 잘 당 항체 용액 40 μL을 준비합니다.
- 각 우물에 40 μL의 이차 항체 용액을 추가하십시오. 습한 챔버에서 37 °C에서 60 분 동안 배양하십시오.
- 우물 의 가장자리에 티슈 페이퍼를 배치하여 우물에서 이차 항체 용액을 제거하십시오. 코플린 슬라이드 염색 용기에 100 mL의 워시 버퍼 'A'로 2x를 흔들어 주지 않고 5분 동안 세척합니다.
- 세차하는 동안 잘 당 40 μL의 결찰 혼합물을 준비, 혼합하여 8 μL의 5x 결찰 버퍼, 31 초순수 및 1 μL의 리가아.
- 각 우물에 결찰 혼합물 40 μL을 추가합니다. 습한 챔버에서 37 °C에서 30 분 동안 배양하십시오.
- 우물 의 가장자리에 티슈 페이퍼를 배치하여 우물에서 결찰 혼합물을 제거합니다. 코플린 슬라이드 염색 용기에 100 mL의 워시 버퍼 'A'로 2x 를 흔들어 주지 않고 2분 동안 세척합니다.
- 세차하는 동안 5x 증폭 용액 8 μL, 31.5 μL의 초순수 및 0.5 μL의 폴리머라아아제를 혼합하여 웰당 40 μL의 증폭 혼합물을 준비한다.
참고: 5x 증폭에는 형광 프로브가 포함되어 있습니다. 빛으로부터 이 혼합물을 보호하십시오. 또한 다음 각 단계에서 는 미끄럼을 빛으로부터 보호합니다. 반투명 코플린 슬라이드 염색 항아리와 습한 챔버를 사용하는 경우, 알루미늄 호일에 싸서. - 잘 당 40 μL의 증폭 혼합물을 추가합니다. 습한 챔버에서 37 °C에서 100 분 동안 배양하십시오.
- 웰에서 증폭 혼합물을 제거합니다. 코플린 슬라이드 염색 용기에 100 mL의 워시 버퍼 'B'로 2x를 흔들지 않고 10분 동안 세척합니다.
- 100 mL의 워시 버퍼 'B'로 슬라이드를 30 초고음의 코플린 슬라이드 염색 용기에 초순수로 1:100 희석시.
- 슬라이드에 웰당 마운팅 매체가 포함된 DAPI 20 μL을 추가합니다. 커버 슬립으로 슬라이드를 닫고 매니큐어로 슬라이드를 밀봉하십시오.
- 이미징의 경우, 즉시 10-15분 동안 마운팅 매체를 함유하는 DAPI를 배양하고 빛으로부터 보호합니다. 그렇지 않은 경우, 빛으로부터 보호된 최대 1주일 동안 슬라이드를 -20°C에 보관하십시오.
5. 감지
- 공초점 현미경을 사용하여 20x/0.8 NA, 63x/1.4 NA 및 100x/1.4 NA Plan Apochromat 목표를 가진 HeLa, S. cerevisiae 및 대장균 세포의 이미지를 각각 획득합니다. 405 nm 펄스 다이오드 레이저로 DNA 염색 DAPI를 자극합니다. PLA 신호(본 연구의 경우)는 561 nm 솔리드 스테이트 레이저로 흥분한다.
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Representative Results
정제된 단백질을 이용한 당사의 이전 시험관 내 연구는 인간 클래스 A 및 클래스 B JDP의 하위 집합이 광범위한 응집된 단백질을 효율적으로 표적으로 하고 Hsp70 기반의 조립을 용이하게 하기 위해 일시적인 혼합 클래스 JDP 복합체를 형성한다는 것을 밝혀냈습니다. 단백질분리7. 우리는 혼성 클래스 (A +B) JDP 복합체가 인간 자궁 경부암 세포 (HeLa)에서 발생하는지 여부를 결정하기 위해 PLA를 사용했습니다. 인간 JDPs DNAJA2(클래스 A) 및 DNAJB1(클래스 B)은 고도로 특이적인1차 항체 및 이차 PLA 프로브(도 2A-C)로 표적화되었다. 적색 형광 천공의 출현은 헬라 세포에서 혼합 클래스 DNAJA2 및 DNAJB1 복합체의 존재를 나타내었으며(도2C)이전의 생화학적 발견을 확인하였습니다7. 각 펑크는 HeLa 세포 세포 종/핵에서 개별 적인 단백질 상호 작용 이벤트를 나타냅니다.
Förster 공명 에너지 전달 (FRET)에서 얻은 이전 생화학 적 결과, 이는 적합한 수용기 불소에 부착 된 흥분 된 공여자 불소에서 전송 된 에너지의 양을 판독으로 단백질 상호 작용을 감지 두 번째 단백질에 부착, 유사한 혼합 클래스 복합체는 또한 효모 JDPs 사이에 발생할 수 있음을 나타냈다, 시험관 내8. 우리의 생화학적 발견을 확인, 우리는 PLA (그림2F)와단세포 진핵생물 S. cerevisiae (베이커효모) 세포에서 Ydj1 (클래스 A)와 Sis1 (클래스 B) 사이의 혼합 클래스 복합체의 형성을 관찰했다. 효모에서는 작은 세포 크기와 다중 펑크의 유착으로 인해 PLA에 의해 생성 된 개별 형광 점이 종종 덜 구별 될 수 있습니다. 형광 성 펑크 형성의 상당한 감소는 인간과 효모 세포모두에서상호 작용하는 JDPs의 녹아웃 또는 녹다운 후 관찰되었다 8, 이는 다른에서 이러한 코 샤페론 복합체를 캡처에 PLA의 높은 특이성을 입증 셀 유형. 진핵성 대조군과 는 달리, 원핵생물(E.coli)JDPs는 혼합 클래스 JDP 복합체를 형성하고 기능적으로 단백질 분리를 촉진하기위해 협력할 수 있는 능력이 결여되어, 시험관내 8. 생화학적 분석과 일치하여, 우리는 대장균에서 유일한 JDP인 세균 DnaJ-YFP(클래스 A)와 CbpA-mCherry(클래스 B) 사이의 혼합 클래스 JDP 복합체 형성을 관찰하지 않았다(그림2I). 그러나 PLA 설정은 두 JDP와 관련된 다른 샤페론 어셈블리를 캡처할 수 있었습니다. 예를 들면, 우리는 DnaJ-YFP와 DnaK (세균성 Hsp70)(그림 2L)및 CbpA-mCherry 및 DnaK8 사이 chaperone 복합체를 검출했습니다 (데이터는 도시되지 않음). 이들 2개의 세균성 샤페론 복합체는 생체외 및생체내 8,11,12 를 광범위하게 특징으로 하여 우리의 PLA 결과를 확인한다. 함께, 이러한 관찰은 단세포/다세포 진핵 및 원핵세포에서 일시적으로 형성된 샤페론 기계를 강력하게 포획하는 PLA의 능력을 입증합니다. 상호 작용하는 JDPs/샤페론 중 하나에 대하여 1차 항체가 결여된 기술적 대조군, 마우스와 토끼 유래 이차 PLA 프로브를 모두 함유하고 있지만, 배경 형광 신호(도2A, D, D, E, G, H, J,K) 우리의 실험 설정에서 거짓 양성 신호 증폭의 부족을 나타내는.
그림 1: 근접 합리술 분석의 연대순 단계의 개략적 표현. (1) 단백질 A와 단백질 B. (2) 단백질 A와 B에 1°의 항체(녹색 및 연한 갈색)의 결합. 2개의 1 차적인 항체는 다른 호스트 종에서 제기되어야 합니다 (예를 들면 마우스, 토끼 또는 염소). (3) 1차 항체는 DNA 올리고 태그(PLA 프로브)와 공유하여 부착된 종별 이차(2°) 항체에 의해 인식된다. (4) 단백질 A와 B가 복잡할 때, 결합된 PLA 프로브는 DNA 올리고가 커넥터 DNA 가닥과 혼성화하는 것을 용이하게 하기 위해 근접하여 원형 DNA 분자의 형성을 초래한다. 그 후, DNA 리가제는 인산염 결합의 형성을 촉매함으로써 DNA 가닥의 결합을 촉진합니다. (5) 37° C. RCA 반응에서 세균 DNA 폴리머라제에 의한 원형 DNA 분자의 원형 원 증폭(RCA)의 개시는 항체 접합DNA 올리고 태그 중 하나에 의해 프라이밍된다. (6) 이차 항체 중 하나에 부착된 단일 가닥 연결 DNA 분자의 생성. (7) 결합성 DNA 분자에서 독특한 반복서열로 형광 표지된 상보적 올리고뉴클레오티드 프로브의 혼성화. 혼성화 단계 후, 연결 DNA 분자는 고정 된 세포에서 표적 단백질 복합체의 위치에서 밝은 형광 점으로 시각화 될 수 있었다. 바닥은 PLA 기술이 적용 가능한 진핵 세포 유형을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. 원핵 세포 및 진핵 세포에서 PLA에 의해 포착된 분자 샤페론 어셈블리. (A-C)인간 자궁경부암 세포주 헬라에서 DNAJA2(클래스 A)와 DNAJB1(클래스 B) 사이에 형성된 혼합클래스 JDP 복합체의 검출. PLA (A) 항-DNAJA2 항체 단독(음성 기술적 대조군)으로 수행되는 항DNAJA2 항체; (B) 항-DNAJB1 항체 단독(음성 기술적 통제); (C) 항-DNAJB1 및 항-DNAJA2 항체를 함께. 패널 C (양성 신호)에 있는 다중 형광 점의 외관은 DNAJA2와 DNAJB1 사이에서 형성된 단백질 복합체의 존재를 나타냅니다. 각 빨간색 형광 점/펑크는 단일 상호 작용을 나타냅니다. 핵 (DNA) DAPI (시안)로 염색. (D-F) S. 세레비시아 세포에서 Ydj1 (클래스 A) 및 Sis1 (클래스 B) 사이에 형성된 혼합 클래스 JDP 복합체의 검출. (D) ANTI-Ydj1 항체 단독으로 수행된 PLA(음성 기술적 제어); (E) ANTI-Sis1 항체 단독으로 수행된 PLA(음성 기술적 제어); (F) PLA는 항-Ydj1 및 항-Sis1 항체와 함께 수행하였다. 양성 형광 신호는 S. cerevisiae에있는 Ydj1 및 Sis1 복합체의 존재를 나타냅니다. DAPI (시안)로 염색 된 효모 핵. (G-L) 대장균 세포에서 원핵성 Hsp70 (DnaK) 및 JDPs (DnaJ 및 CbpA) 사이에 형성된 샤페론 복합체의 검출. 원핵생물 JDP에 대하여 특정 1 차 항체의 부족 때문에, 대장균 DnaJ (클래스 A) 및 CbpA (클래스 B)는 각각 YFP와 mCherry로 태그되었습니다. (G,J) ANTI-YFP 단독으로 수행 된 PLA (부정적인 기술적 제어); (H) PLA는 안티 mCherry 단독으로 수행 (네거티브 기술 제어). (I) 항-YFP 및 안티-mCherry 항체로 PLA를 수행하였다. 형광 점 형성의 부족은 DnaJ와 CbpA 사이 더 복잡한 대형을 표시하지 않습니다. (K) PLA는 항DnaK 항체 단독(음성 기술적 제어)으로 수행하였다. (L) PLA는 항-YFP 및 항-DnaK 항체를 함께 수행하였다. 양성 형광 신호는 DnaK와 DnaJ 사이의 복잡한 형성을 나타냅니다. DAPI (시안)로 염색 된 세균성 DNA. 단일 1차 항체를 함유하는 것 외에도, 모든 음성 기술적 대조는 각각의 이차 PLA 프로브의 존재 내에서 수행되었다. 배율 막대 = 10 μm.
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Discussion
공동 면역 침전 및 공동 국소화 기반 접근법은 단백질 조립을 특성화하는 오랜 방법으로 사용되어 왔다. 과도하게 형성된 특정 샤페론 복합체의 검출은 이러한 전통적인 방법의 주요 과제이며, 그 결과, 이전의 발견은 주로 질적 해석으로 제한된다. 세포 용해 기지를 둔 공동 면역 침전 기술은 수시로 단백질 단백질 상호 작용을 안정시키기 위하여 가교를 요구합니다. 세포 용해는 일시적으로 형성된 샤페론 복합체를 방해할 위험을 증가시키는 반면, 가교는 비네이티브 상호작용을 유발할 수 있으며, 특히 대부분의 샤페론의 고유 "끈적거림"에 의해 유발됩니다. 공동 면역 침전을 사용하여 Hsp70 샤페론 시스템을 분석할 때, 잠재적인 아티팩트는 (a) 샤페론의 높은 발현 수준 및 (b) 멤브레인 또는 단백질 골재 결합 샤페론 기계와 관련된 용해도 문제에서 발생할 수 있습니다. 게다가, 공동 면역 침전 기지를 둔 기술은 관련되는 기능을 delineating를 위해 중요할 수 있던 붙잡힌 단백질 어셈블리의 세포 국소화에 아무 정보도 제공하지 않습니다. 공동 면역 침전 기술을 사용하는 단점은 단백질 국소화 정보를 보존하는 공동 국소화 기반 접근법에서 다소 감소됩니다. 그러나, 2개 이상의 단백질의 공동 국소화는 세포에서 동일한 마이크로도메인으로 단백질의 직접적인 단백질 결합 또는 분할을 나타낼 수 있었다. 따라서, 공동 국소화 분석은, 기껏해야, 단백질 상호 작용을 예측하는 투기적이며 어떤 근접 값이 결여된다. 표적 단백질의 대량 및 무차별적인 검출 때문에, 기술은 세포에 있는 특정 단백질 집합을 공부에서 높게 제한됩니다. 이것은 표적으로 한 단백질 (들)이 Hsp70 샤페론 시스템의 경우와 같이, 병렬로, 명백한 단백질 어셈블리의 넓은 범위를 형성 할 수 있을 때 특히 문제가 됩니다. 이러한 종래의 방법론과 비교하여, PLA는 보존된 단백질 국소화 정보를 가진 세포에서 토착 단백질 연관성을 강력하게 검출하고 정량화하기 위해 개발된 현장 기술에서 보다 정제된 기술이다. 단백질 상호작용은 표적 단백질 사이의 근접(대략 10-30 nm)에 기초하여 이 분석에 의해 밝혀진다. PLA는 (a) PLA 프로브에 부착된 올리고뉴클레오티드 태그의 길이를 감소시키고/또는 (b) 태그를 1차 항체에 직접 컨쥬게이션함으로써 보다 엄격한 판독을 얻기 위해 근접 거리의 범위를 감소시킬 수 있다는 점에서 "튜닝"된다. 양수 PLA 신호를 해석할 때는 주의해야 합니다. 이상적으로, 단백질 상호 작용은 둘 이상의 독립적인 방법론으로 확인되어야 한다. PLA에서형광신호의 세기는 FRET의 경우와 같이 상호작용하는 단백질 들 사이의 단백질 클러스터 크기 또는 분리 거리와 결정적으로 관련이 없다. 그러나, PLA는 높은 특이성 및 민감도를 가지며, 심지어 희소한 세포 유형 또는 임상 시편에서 성장 인자 또는 사이토카인 및 이들의 상호작용과 같은 매우 낮은 풍부한 단백질을 분석하는데 사용될 수 있다13.
Hsp70 샤페론파트너는 세포 수명14년 동안 여러 코-샤페론(예: JDP 및 NEF)과 협력하여 뚜렷한 생물학적 기능을 구동합니다. 가능한 Hsp70-JDP-NEF 기계 구성의 깎아지른 듯한 수와 셀에서의 동적 동작은 이러한 샤페론 기계의 특정 역할에 대한 상세한 이해를 크게 방해했습니다. 따라서 고유한 Hsp70 어셈블리의 선택적 추적을 허용하는 생물학적 도구는 셀에서 이 샤페론 네트워크의 전체 배선을 해부하는 데 필요합니다. 일시적으로 형성된 JDP-JDP 및 JDP-Hsp70 샤페론 복합체7은 PLA를 가진 세포에서 효과적으로 포획되었으며, 이는 이 기술이 높은 해리상수와의 분자 상호작용을 연구하는 데 적합하다는 것을 나타냅니다(예를 들어, >3 μM Kd ). 하지만, 현재 의 작업에서, 분석은 주로 샤페론 상호 작용에 대한 "예"또는 "아니오"유형 바이너리 표시기로 사용된다, 사용자는 디지털 방식으로 상호 작용의 정도의 반 정량적 판독을 얻기 위해이 기술을 사용할 수 있습니다 신호 강도15. 그러나, PLA 신호의 비선형 증폭으로 인해, PLA 데이터를 정량적인 방식으로 해석할때주의를 기울여야 한다(16). 전술한 장점에도 불구하고 이 방법은 특정 제한사항이 있습니다. PLA의 주요 단점 중 하나는 분석이 세포 고정을 필요로하므로 살아있는 세포에서 단백질 안색의 시간적 역학을 해결하는 능력을 크게 제한한다는 것입니다. 이에 비해, 생체 내 FRET17 또는 생체 발광 공명 에너지 전달(BRET)18은 상대적으로 더 작은 근접 값을 가진 살아있는 세포에서 주공간적 방식으로 유사한 단백질 상호작용의 모니터링을 허용한다(<10 nm). PLA와 대조적으로, FRET 신호는 단백질 발현수준(16)과 엄격한 선형 상관관계를 나타내며, FRET는 단백질 상호작용의 정량적 분석에서 금본위제이다. 그러나, FRET의 수수께끼 배향 인자 θ2에 대한 의존과는 달리, PLA는 PLA 프로브의 배향에 의해 영향을 받지 않으며, 이는 단백질 복합체(19)를 포착할 확률을 증가시킨다. 사용자 친화성측면에서 FRET와 BRET는 고유한 전문 지식이 필요하므로 일반적으로 이러한 방법론의 접근성을 광범위한 연구 커뮤니티에 제한합니다. 추가, 이 기술의 둘 다 잠재적으로 단백질 기능 및 복잡한 대형을 방해할 수 있는 부피가 큰 발광/형광 단백질 꼬리표를 붙임으로써 상호 작용하는 단백질의 수정을 요구합니다.
다음 단계(1-4)는 세포에서 PLA의 성공적인 구현을 위해 신중하게 고려해야 합니다. (1) 항체 선택: 시판되는 PLA 키트는 마우스, 토끼 및 염소에 대해 제기 된 1 차 항체와 호환됩니다. PLA는 표적에 결합하지 않는 고도로 특이적인 1차 항체를 요구한다. 또한, 항체가 인식할 수 있는지 확인하기 위해 면역 조직화학(IHC), 효소 연계 면역흡착 분석(ELISA) 및/또는 면역 침전(IP)과 같은 응용 분야와 호환되는 1차 항체를 선택하는 것이 중요합니다. 접힌 단백질의 표면에 노출 된 항원 아미노산 서열. 사용하기 전에, 그들의 특이성을 위한 모든 1 차적인 항체의 시험은 높게 추천됩니다. 이것은 전체 세포 lysates의 서쪽 얼룩 분석을 통해 수행될 수 있습니다. 표적 단백질이 크기와 서열 유사성 (예를 들어, Hsp70 및 JDP paralogs)에 있는 작은 변이를 가진 상동체가 있는 경우에, 항체의 특이성은 유전자 녹다운/녹아웃 접근또는 정제에 대하여 조사하여 시험될 수 있었습니다 잠재적인 교차 인식을 배제할 수 있습니다. 적당한 항체를 유효하게 유효하지 않는 경우에, 표적으로 한 단백질은 허용 가능한 질의 항체가 있는 에피토프로 꼬리표질될 수 있었습니다 (그림 2F). (2) 세포의 고정 및 투과율 : 4 % 파라 포름 알데히드 및 0.1-0.5 % 트리톤 -X100의 치료는 각각 세포를 고정하고 투과시키는 데 사용될 수 있습니다. 4% 파라포름알데히드의 사용은 99% 메탄올을 사용하는 고정 조건에 비해 단백질-단백질 상호 작용 및 세포 초구조를 보존하기 위한 더 나은 치료법입니다.20,21,22. 그러나 세포를 99% 메탄올로 고정하면 세포질 배경 염색이 적고 세포골격 관련 단백질 어셈블리 검출과 같은 특정 경우에 더 적합합니다.21,22. 비이온 계면활성제 Triton-X100을 통해 항체 접근성을 높이기 위해 혈장 막뿐만 아니라 소기관 막의 효율적인 투과화가 이루어질 수 있습니다. 그러나 Triton-X100은 비특이적으로 혈장 막에서 단백질을 제거할 수 있습니다.23,24. 따라서 세포막과 관련된 단백질 어셈블리의 분석을 위해, 포막을 투과하기 위해 스테롤을 표적으로 하는 사포닌 또는 디지토닌과 같은 대체 세제를 적용할 수 있습니다.21,22,25. (3) 세포벽의 붕괴: 막 투과하기 전에, 세포벽 (예 : 곰팡이, 식물 및 세균 세포)을 가진 세포 유형에서 항체의 침투성을 높이기 위해 특정 용리효소를 포함하는 추가 단계가 필요합니다. 예를 들어, 우리는 β-글루칸을 저하시키는 리티케이스를 사용하여 세포벽을 파괴했습니다.S. cerevisiae26. 마찬가지로,E. coli세포벽은 펩티도글리칸을 표적으로 하는 효소인 리소자임(lysozyme)을 사용하여 중단되었습니다.27,28. 세포 벽 조성 및 lytic 효소 감도 다른 성장 조건에 따라 변화26및 문화 합류29,30. 따라서, 용해 효소의 농도 및 소화 시간은 다를 수 있으며 세포의 과잉 또는 소화 불량을 방지하기 위해 주의를 기울여야 합니다. 세포벽 소화 후, 세포는 상대적으로 깨지기 쉬우며 세척 단계 동안 그대로 유지되기 위해 소르비톨과 같은 밀집 제제가 필요합니다. (4) DNA 증폭: DNA 결찰 및 압연 원 PCR 반응 단계는 온도 및 습도 변동에 민감하다. 분석법의 견고한 DNA 증폭 및 재현성을 보장하기 위해, 이러한 반응은 습도 챔버에서 37°C에서 수행되어야 한다. 중요한 것은, 전단세포는 배경 신호의 증가로 이어질 수 있는 임의의 비특이적 항체 결합 및 DNA 증폭 사건을 피하기 위해 분석기를 수행하는 동안 건조되는 것을 방지해야 한다.
고려된 모든 것, 이 분석의 구현은 독특한 전문 지식과 정교한 계측을 필요로하지 않습니다. JDP-JDP 및 JDP-Hsp70 샤페론 복합체의 성공적인 모니터링은 모든 세포 유형에서 일시적으로 형성된 단백질 어셈블리를 추적하기 위해 이 기술의 잠재적적용을 보여줍니다. 효모와 박테리아에서 의 기술을 구현하면 광범위한 유기체에서 뚜렷한 단백질 어셈블리에 의해 매개되는 다양한 생물학적 공정을 연구하기 위한 PLA의 적용성을 크게 향상시킵니다. 또한, 우리의 연구는 종 8에 걸쳐 분자 수준에서 발생하는 진화적 변화를연구하는 유망한 새로운 단백질 상호 작용 도구로 PLA를 강조합니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
NBN은 빅토리아 주 정부와 호주 정부의 자금으로 모나시 대학 의학 간호 및 건강 과학 학부의 특별 모집 보조금에 의해 지원됩니다. 우리는 베른트 부카우 (ZMBH, 하이델베르크 대학, 독일) 및 Harm H. Kampinga (세포 및 시스템 학과, 그로닝겐 대학, 네덜란드) 시약의 귀중한 지원과 공유에 감사드립니다, 홀거 로렌츠 (ZMBH) 이미징 시설, 하이델베르크 대학, 독일) 공초점 현미경 및 이미지 처리와 그의 지원에 대한, 클레어 허스트 (ARMI, 모나시 대학, 호주) 원고의 비판적 독서.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 37% Formaldehyde | Merck | 103999 | |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 32201 | |
| anti-DNAJA2 antibody | Abcam | ab157216 | |
| anti-DNAJB1 Antibody | Enzo Life Sciences | ADI-SPA-450 | |
| anti-DnaK antibody | In house | ||
| anti-mCherry antibody | Abcam | ab125096 | |
| anti-Sis1 Antibody | Cosmo Bio Corp | COP-080051 | |
| anti-Ydj1 antibody | StressMarq Biosciences | SMC-150, | |
| anti-YFP antibody | In house | ||
| Coplin slide-staining jar | Sigma-Aldrich | S5516 | |
| Diagnostic slides | Marienfeld | 1216530 | |
| DMEM | Thermo-Fischer | 31966021 | |
| DuoLink In Situ Detection Reagents Orange | Sigma-Aldrich | DUO92007 | |
| DuoLink In Situ Mounting Medium + DAPI | Sigma-Aldrich | DUO82040 | |
| DuoLink In Situ PLA Probe Anti-Mouse MINUS | Sigma-Aldrich | DUO92004 | |
| DuoLink In Situ PLA Probe Anti-Rabbit PLUS | Sigma-Aldrich | DUO92002 | |
| DuoLink In Situ Wash Buffers, Fluorescence | Sigma-Aldrich | DUO82049 | |
| Fetal Calf Serum | Thermo-Fischer | 10082147 | |
| Lysozyme | Sigma-Aldrich | 62971 | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 32213 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo-Fischer | 15070063 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma-Aldrich | P47-07 | |
| Sorbitol | Sigma-Aldrich | S7547 | |
| Triton-X100 | Merck | 108643 | |
| Trypsin | Thermo-Fischer | 25300096 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Zymolase 100T / / Lyticase | United States Biological | Z1004 |
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