Summary
コグネートJドメインタンパク質はHsp70シャペロンと協力して、タンパク質の折りたたみから分解に至るまで、無数の生物学的プロセスを支援します。ここでは、細菌、酵母およびヒト細胞におけるこれらの一時的に形成されたシャペロン機械のモニタリングを可能にする、その場近近性ライゲーションアッセイについて説明する。
Abstract
Jドメインタンパク質(JGP)は、真核細胞において最大かつ最も多様なコシャペロンファミリーを形成します。最近の知見は、JDPファミリーの特定のメンバーが真核生物の一過性ヘテロ複合体を形成し、70 kDaヒートショックタンパク質(Hsp70)シャペロンベースのタンパク質分解物の基質選択を微調整できることを示している。JDP複合体は、急性/慢性ストレス誘発凝集タンパク質を標的とし、タンパク質凝集体の表面に複数のHsp70sをリクルートすることにより、逆凝縮物を組み立てるのに役立つ可能性があります。これらの物理的に相互作用するJDPによって形成されるタンパク質品質管理(PQC)ネットワークの程度は、生体内ではほとんど特徴付けられていないままである。ここでは、近接ライゲーションアッセイ(PLA)と名付けられたその中の顕微鏡ベースのタンパク質相互作用アッセイについて説明し、真核細胞の異なる細胞区画においてこれらの一時的に形成されたシャペロン錯体を強く捕捉することができる。我々の研究は、PLAの雇用をヒト細胞から酵母(サッカロマイセス・セレビシエ)および細菌(エシェリヒア・コリ)に拡大し、両方で一過性に形成されたタンパク質アセンブリのダイナミクスを監視する重要なツールを提供する。原核生物および真核細胞。
Introduction
膨大な量のゲノム情報は、細胞相互作用の我々の不完全な理解のために解釈できないままである。従来のタンパク質とタンパク質の相互作用検出方法は、化学的架橋およびタンパク質の共局在化を伴うタンパク質共免疫沈殿などの方法論であるが、広く使用されているが、様々な欠点を提起する。主な欠点のいくつかは、相互作用の定量化が不十分であり、非ネイティブ結合イベントの潜在的な導入が含まれます。これに対し、新しい近接ベースの技術は、細胞内のタンパク質相互作用を捕捉するための代替的かつ強力なアプローチを提供します。近接ライゲーションアッセイ(PLA)1は、現在独自のキットとして利用可能であり、相互作用するサブユニットの近接性に基づいてタンパク質複合体を特異的に標的とする抗体を採用している。
PLAは、標的タンパク質複合体の表面に小さなDNAタグ(PLAプローブ)を持つ一次および二次抗体からなる足場の形成によって開始される(図1、ステップ1-3)。次に、DNAタグの近接性によって決定され、コネクタオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションを介して円形DNA分子が生成される(図1、ステップ4)。円形DNAの形成は、DNAライゲーション工程によって完了する。新たに形成されたDNAの円形片は、共役オリゴヌクレオチドタグの1つによってプライミングされた後続の転がり円増幅(RCA)ベースのポリメラーゼ連鎖反応(PCR)のテンプレートとして機能する。これにより、抗体足場を介してタンパク質複合体に付着した一本鎖連結DNA分子が生成される(図1、ステップ6)。連結DNA分子は、増幅されたDNAに散在する複数のユニークな配列にハイブリダイズする蛍光標識オリゴヌクレオチドを用いて可視化される(図1、ステップ7)2)生成されたPLAシグナルは、蛍光ドット(図1、ステップ7)として現れ、細胞内の標的タンパク質複合体の位置に対応する。その結果、アッセイは高い空間精度でタンパク質複合体を検出することができました。この技術は、単にタンパク質相互作用を捕捉するだけではなく、高感度1、2のタンパク質上の単一分子またはタンパク質修飾を検出するためにも利用することができる。
Hsp70は、ハウスキーピングおよびストレス関連機能の配列に参加することにより、細胞タンパク質恒常性を維持するために根本的に重要な非常に汎用性の高いシャペロンシステムを形成する。Hsp70シャペロンシステムのハウスキーピング活動には、デノボタンパク質折りたたみ、細胞膜間のタンパク質転移、タンパク質複合体の組み立ておよび分解、タンパク質活性の調節および異なるタンパク質折りたたみ/リンクが含まれます。品質管理機械3.同じシャペロンシステムはまた、誤った折り畳み/展開されたタンパク質を折りたたみ、タンパク質凝集を防止し、タンパク質の分解を促進し、細胞プロテアーゼと協力して、末端に誤った折り畳み/損傷を受けたタンパク質を分解し、細胞修復を容易にします。プロテオトキシックストレス4,5.この機能的多様性を達成するために、Hsp70シャペロンは、Hsp70のATP依存性アロステリック制御を微調整するJDPファミリーとヌクレオチド交換因子(NEF)のパートナーシップコシャペロンに依存し、基質結合および放出3、 6.さらに、JDPコシャペロンは、この汎用性の高いシャペロンシステムの基板選定において重要な役割を果たします。このファミリーのメンバーは、プロトタイプJDP、大腸菌DnaJに対する構造相同性に基づいて3つのクラス(A、BおよびC)に細分化される。クラスA JGPは、Hsp70と相互作用するN末端Jドメイン、グリシンフェニルアラニン豊富な領域、亜鉛指様領域(ZFLR)と2つのβバレルドメインからなる基質結合領域、およびC末端二量化ドメインを含む。N末端Jドメインおよびグリシンフェニルアラニンが豊富な領域を有するJGPは、ZFLRを欠いているが、クラスBに分類される。一般に、これら 2 つのクラスのメンバは、チャペロン関数に関与しています。Jドメイン4のみを共有するJGPを含むキャッチオールクラスCに該当するメンバーは、Hsp70sを募集して様々な非チャペロン機能を実行します。Hsp70システムの交換可能な基板認識「アダプター」としてのJDPの重要な役割は、進化中の家族の拡大によって反映される。たとえば、人間には 42 を超える異なる JDP メンバー4があります。これらのJDFは、モノマー、ホモダイマーおよび/またはホモ/ヘテロオリゴマー4、5として機能します。近年、クラスA間の一過性複合体形成による機能的協力(例えば、H.サピエンスDNAJA2;S. セレビシエYdj1) とクラス B (例えば, H.サピエンスDNAJB1;S.セレビシエSis1)真核生物JDPは、インビトロ7,8における非晶質タンパク質凝集体の効率的な認識を促進することが報告された。これらの混合クラスJDP複合体は、おそらくHsp70-およびHsp70+Hsp100ベースのタンパク質分解ガス7、8、9の形成を容易にするために凝集タンパク質の表面に集合する10.真核細胞におけるこれらの一過性形成混合クラスJDP複合体の存在を支持する重要な証拠をPLA8で提供した。
PLAは、主に哺乳動物細胞におけるメタゾアにおけるタンパク質相互作用の評価にますます採用されています。ここでは、真核生物および原核生物単細胞生物(発芽酵母S.セレビシエおよび細菌大腸菌)において一過性に形成されたシャペロン複合体をモニタリングするこの技術の拡大に成功したと報告する。重要なことに、この拡張は、ヒトおよび動物細胞に感染する微生物を検出および分析する際のPLAの潜在的な使用を強調している。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. HeLa細胞製剤
- 次の材料を準備する: PBS (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4,1.8 mM KH2PO4),pH 7.4;DMEM, 10% FCS と 1% ペンストレップを補充;PBSで4%パラホルムアルデヒド;0.5% PBS でトリトン X100;TBS-T (150 mM NaCl, 20 mM トリス, 0.05% ツエン), pH 7.4;0.0001% 無菌ポリ-リジン溶液;10ウェル診断スライド。湿気の多い部屋;ティッシュペーパー;そしてコプリンのスライド染色の瓶。
注:最適な固定効率を確保するために、パラホルムアルデヒド溶液は、すべての実験の前に新鮮に準備する必要があります。 - 湿ったティッシュで閉じた箱の底を覆うことによって湿気の多い部屋を準備する。実験を開始する前に湿度の高いチャンバーを37°Cに置き、酵素反応をインキュベートしながらチャンバ温度が37°Cであることを確認します。
- T25フラスコにおける培養HeLa細胞は、DMEMの5mL(高グルコース、グルタミン酸ナトリウムおよびピルビン酸ナトリウム補充)で10%FCSおよび1%ペンストレップを補充し、5%CO2を含む37°C CO2インキュベーター中に含まれる。 0.05%トリプシン-EDTAを用いて付着細胞を解離する。解離した細胞に新鮮なDMEMを添加した後、細胞計数室を使用して細胞をカウントし、湿度の高いチャンバー内の診断スライド上で成長する。
- 無菌細胞培養フードにUV照射により診断スライドを30分間殺菌します。
- 実験に必要な各ウェルに100 μLの滅菌濾過0.0001%ポリL-リジンを加えます。30分間インキュベートし、50 μLの超純水で各ウェル3倍を洗浄することにより、余分なポリL-リジンを洗い流します。
- HeLa細胞をトリプシン化し、各ウェルに約15,000個の細胞を追加します。必要に応じて、ウェル当たりのDMEMの少なくとも30〜50 μLに細胞を希釈する。
- 約24時間の37°C5%CO2インキュベーター内の湿気のあるチャンバー内で細胞を成長させる細胞は、PLAを開始する前に60%〜80%のコンフルエントでなければなりません。
注:合流率が高すぎると試薬の吸収が減少し、プロトコルの終わりに得られた信号が減少します。 - ウェルの端にティッシュペーパーを置いて培地を取り除きます。PBSの50 μLでウェルを3倍洗います。
注:細胞は、液体が過酷に添加されると、切り離さの対象となります。これは、新しい液体を追加する前に井戸を完全に乾燥させないようにし、井戸の端に穏やかに新しい液体を追加することによって防ぐことができます。 - PBSに50μLの新たに調製した4%パラホルムアルデヒドを各ウェルに加えて細胞を固定します。室温で10分間インキュベートします。
- PBSでスライドを3倍洗います。100mLのPBSを含むコプリンスライド染色瓶で洗い流す。洗浄ごとに、揺れることなく室温で5分間インキュベートします。
- コプリンスライド染色瓶にPBSで0.5%トリトン-X100の100 mLのスライドを浸すことによって細胞膜を透過化する。揺れることなく室温で10分間インキュベートします。
- TBS-Tでスライドを3倍洗います。TBS-Tの100mLを含むコプリンスライド染色瓶で洗い流す。洗浄ごとに、揺れることなく室温で5分間インキュベートします。
- 最後の洗浄後、ティッシュペーパーで余分なバッファーを取り除きます。この時点で、細胞はセクション4で議論される近接性ライゲーションアッセイプロトコルの準備ができています。
2. S. セレビシエ細胞製剤
- 次の材料を準備する: 100mM KPO 4, pH 6.5, ウォッシュバッファーと呼ばれる;37% ホルムアルデヒド;4% 100 mM KPO4でパラホルムアルデヒド, pH 6.5;1.2 Mソルビトール 100 mMKPO 4, pH 6.5;リチケース溶液(500 μg/mLリチケース、20 mM β-メルカプトエタノール、100 mMKPO 4、pH 6.5);0.0001% ポリ-リジン溶液;1% 100 mM KPO4でトリトン X100, pH 6.5;10ウェル診断スライド。湿気の多い部屋(ステップ1.2のように調製);ティッシュペーパー;そしてコプリンのスライド染色の瓶。
注:最適な固定効率を確保するために、パラホルムアルデヒド溶液は、すべての実験の前に新鮮に準備する必要があります。 - 振りながら30°Cで非選択的酵母エキス、ペプトンおよびデキストロース(YPD)培地で一晩培養を成長させる。
注:実験要件に応じてS.セレビシエ細胞は、代わりに合成コンプリート(SC)培地または選択的合成最小(SM)培地で増殖させることができる。 - 静止培養を20mL培地で0.1のOD600に希釈する。OD 600が0.5に達するまで振りながら30°Cで細胞を成長させる。
- 20 mL 培養を 50 mL 遠心分離管に移します。665 x gで3分間遠心分離によって細胞をペレットし、上清を取り除く。新鮮な培地の5 mLで細胞を再中断する。
- 培養に37%ホルムアルデヒドの550 μLを添加して細胞を固定します。室温で15分間インキュベートします。
- 665 x gで3分間遠心分離によって細胞をペレットし、上清を取り除く。ウォッシュバッファーで作成した4%パラホルムアルデヒドの1mLでペレットを再中断します。室温で45分間インキュベートします。
- インキュベーション中に、各ウェルに0.01%ポリL-リジン溶液の100 μLを加えて診断スライドを調製します。室温で30分間スライドをインキュベートします。
- 30分後、余分なポリL-リジンを超純水で洗い流し、スライドの空気を乾燥させます。乾燥したスライドは使用の準備ができている。
- 洗浄バッファーの1 mLで細胞を2回洗浄します。665 x gで3分間の細胞の遠心分離による洗浄を行い、上清を取り出し、ウォッシュバッファー内の細胞を再中断します。
- 665 x gで3分間遠心分離によって細胞をペレットし、上清を取り除く。洗浄バッファー内の1.2 Mソルビトールの1mLで細胞を再中断します。
- 665 x gで3分間遠心分離によって細胞をペレットし、上清を取り除く。細胞壁を消化するために、新たに調製されたLyticase溶液の250 μLでペレットを再中断します。揺れながら30°Cで15分間Lyticase溶液中の細胞をインキュベートする。
- 消化後、665 x gで遠心分離で細胞を3倍に洗浄し、上清を除去する。洗浄バッファー内の1.2 Mソルビトールの250 μLで細胞を再中断します。
注:細胞は細胞壁の消化後に壊れやすいので、細胞を損傷しないように非常に慎重に再中断します。 - ポリLリジンコーティングされたスライドに再懸濁細胞の20 μLを追加します。50 μLの洗浄バッファーでウェルを3倍に洗い流し、非付着細胞を30分間スライドに取り付けます。
- 洗浄バッファーで1%トリトン-Xの50 μLで3倍を洗浄することにより、細胞膜を透過化します。
注:この時点で、細胞はセクション4で議論される近接ライゲーションアッセイプロトコルの準備ができている。
3.大腸菌細胞製剤
- 次の材料を準備する: PBS-T (140 mM NaCl, 2 mM KCl, 8 mM K2HPO4,1.5 mM KH2PO4,0.05% Tween-20), pH 7.4;リソザイム溶液 (2 mg/mL リソザイム, 25 mM トリス-HCl pH 8.0, 50 mM ブドウ糖, 10 mM EDTA);0.0001% ポリ-リジン溶液;99% 氷冷メタノール;99% 室温メタノール;99% アセトン;10ウェル診断スライド。湿気の多い部屋(ステップ1.1.1のように調製);ティッシュペーパー;そしてコプリンのスライド染色の瓶。
- 揺れながら30°Cでルリア・ベルタニ(LB)培地で一晩培養する。
- 静止培養を新鮮なLB培地で0.02のOD600に希釈する。OD 600が対数相細胞の0.4に達するまで振りながら30°Cで細胞を成長させる。
- 細胞が0.4のOD600に達する約15分前に、各ウェルに0.0001%ポリL-リジンの100 μLを加えてポリL-リジンコーティングスライドを調製する。室温で30分間スライドをインキュベートします。
- 30分後、超純水で余分なポリL-リジンを洗い流し、空気を乾燥させます。乾燥したスライドは使用の準備ができている。
- 細胞が0.4のOD600に達すると、2分間2,650 x gで無菌マイクロ遠心管およびペレット細胞に培養の1 mLを移移す。
- LB培地の50μLで細胞を再中断する。
- 氷冷99%メタノールの1 mLを加えて細胞を固定します。手で非常に穏やかに混ぜます。-20°Cで30分間細胞をインキュベートする。
- 固定後、ポリL-リジンコーティングスライドに20 μLの細胞を追加します。スライドの空気を30分間乾燥させます。
- 作りたてのリソザイム溶液を50μLのリソザイム溶液を各ウェルに加え、細胞壁を消化します。湿度の高いチャンバーで25°Cで30分間インキュベートします。
- ウェルの端にティッシュペーパーを追加して、ウェルからリザイム溶液を取り除きます。PBS-Tの100 mLでスライド3xを洗浄します。コプリンのスライド染色瓶で30sの各洗浄を行い、揺れることなく行います。
- ティッシュペーパーのスライドをタップして、スライドから洗浄バッファを取り外します。
- 各ウェルに99%メタノールの50 μLを添加して細胞膜を透過化する。室温で1分間インキュベートします。
- ウェルの端にティッシュペーパーを置くことによってメタノールを取り除きます。
- 各ウェルに99%のアセトンの50 μLを追加します。1分間インキュベートします。
- ウェルの端にティッシュペーパーを置くことによって余分なアセトンを取り除きます。スライドを空気乾燥させます。この時点で、細胞はセクション4で議論される近接ライゲーションアッセイプロトコルの準備ができている。
4. 近接リゲーションアッセイ
- 次の資料を準備する: バッファをブロックします。抗体希釈バッファー;ウォッシュバッファー 'A' – (10 mM トリス, 150 mM NaCl, 0.05% Tween-20) pH 7.4;ウォッシュバッファ 'B' – (200 mMトリス, 100 mM NaCl) pH 7.4;抗ウサギ二次抗体プラス;抗マウス二次抗体 MINUS;5xライゲーションバッファ;リゲス;5x増幅バッファー(オレンジ: λex 554 nm; λem 576 nm);ポリメラーゼ;超純水;DAPIを含む取り付け媒体。
注:PLA検出試薬は、変種グリーン(λex 495 nm;λem 527 nm)、レッド(λex 594 nm;λem 624 nm)、ファルレッド(λex 644 nm;λem 669 nm)またはブライトフィールド(ホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP))でも利用可能です。共役)。 - 各ウェルにブロックバッファのドロップを追加してセルをブロックします。湿気の多い部屋で37°Cで30分間インキュベートします。
- 抗体希釈バッファー内のストック抗体を希釈することにより抗体溶液を調作する。各ウェルに対して40μLの抗体溶液が必要である。
- ウェルの端にティッシュペーパーを置くことによってブロッキングバッファを削除します。抗体希釈バッファーで希釈した抗体の40μLを各ウェルに添加する。湿度の高いチャンバーで60分間インキュベートし、37°Cまたは4°Cで一晩インキュベートします。
- ウェルの端にティッシュペーパーを置くことによって、ウェルから抗体溶液を取り除きます。コプリンスライド染色瓶の洗浄バッファー'A'の100 mLで2xを5分間、揺れることなく洗います。
- 洗浄工程中、希釈5x二次抗体プローブ、抗ウサギPLUS&抗マウスMINUS(プローブの種特異性は使用される一次抗体に依存する)、抗体希釈バッファー内。ウェル当たり40μLの抗体溶液を調剤する。
- 各ウェルに40μLの二次抗体溶液を添加する。湿気の多い部屋で37°Cで60分間インキュベートします。
- ウェルの端にティッシュペーパーを置くことによって、ウェルから二次抗体溶液を取り除きます。コプリンスライド染色瓶の洗浄バッファー'A'の100 mLで2xを5分間、揺れることなく洗います。
- 洗い流しの間に、ウェル当たり40μLのライゲーション混合物を調作し、5xライゲーションバッファーの8μL、31μLの超純水および1μLのリガーゼを混合する。
- 各ウェルに40μLのライゲーション混合物を加えます。湿気の多い部屋で37°Cで30分間インキュベートします。
- ウェルの端にティッシュペーパーを置くことによって、井戸からライゲーション混合物を除去します。コプリンスライド染色瓶の洗浄バッファー'A'の100 mLで2xを揺らさずに2分間洗浄します。
- 洗い流しの間に、ウェル当たり40μLの増幅混合物を調作し、5倍増幅溶液の8μL、31.5μLの超純水、および0.5μLのポリメラーゼを混合する。
注:5x増幅には蛍光プローブが含まれています。この混合物を光から保護します。また、次の各手順でスライドをライトから保護します。半透明のコプリンスライド染色瓶と湿度の高いチャンバーを使用する場合は、アルミ箔でそれらを包みます。 - ウェルあたり40μLの増幅混合物を加えます。湿度の高い部屋で37°Cで100分間インキュベートします。
- ウェルから増幅混合物を除去します。コプリンスライド染色瓶の洗浄バッファー'B'の100 mLで2xを揺らさずに10分間洗浄します。
- 洗浄バッファー'B'の100 mLでスライドを洗浄し、30sのコプリンスライド染色瓶で超純水で1:100を希釈します。
- 井戸あたりの取り付け媒体を含むDAPIの20 μLをスライドに追加します。カバースリップでスライドを閉じ、マニキュアでスライドをシールします。
- イメージングの場合は、光から保護しながら、10~15分間、取り付け媒体を含むDAPIを直ちにインキュベートする。そうでない場合は、光から保護された最大1週間-20°Cでスライドを保管してください。
5. 検出
- 共焦点顕微鏡検査を使用して、20x/0.8 NA、63x/1.4 NA、100x/1.4 NAプランアポクロマットの目標を持つHeLa、S.セレビシエおよび大腸菌細胞の画像を取得します。405 nmパルスダイオードレーザーでDNA染色DAPIを励起します。PLA信号(この研究用)の場合は、561nmの固体レーザーで励起します。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
精製タンパク質を用いたインビトロ研究では、ヒトクラスAとクラスB JDPのサブセットが一時的な混合クラスJDP複合体を形成し、広範囲の凝集タンパク質を効率的に標的化し、Hsp70ベースの組み立てを容易にすることを明らかにした。タンパク質の分解性7.PLAを用いて、ヒト子宮頸癌細胞(HeLa)に混合クラス(A+B)JDP複合体が生じるかどうかを判定した。ヒトJGP DNAJA2(クラスA)およびDNAJB1(クラスB)を、高特異的一次抗体および二次PLAプローブで標的とした(図2A-C)。赤色蛍光穿刺の出現は、HeLa細胞における混合クラスDNAJA2およびDNAJB1複合体の存在を示した(図2C)。.各穿クトは、HeLa細胞サイトゾル/核における個々のタンパク質相互作用イベントを表す。
フェルスター共鳴エネルギー伝達(FRET)から得られた以前の生化学的結果は、1つのタンパク質に付着した励起ドナー蛍光素から適切なアクセプター蛍光素に移されたエネルギー量の読み出しとしてタンパク質相互作用を検出する。第2のタンパク質に付着し、同様の混合クラス複合体が酵母JDP間でも起こり得ることを示した、インビトロ8で。生化学的所見を確認し、PLA(図2F)を用いた単細胞高体外公体S.セレビシエ(ベーカー酵母)細胞におけるYdj1(クラスA)とSis1(クラスB)の混合クラス複合体の形成を観察した。酵母では、その小さな細胞サイズと複数のパンタの合体のために、PLAによって生成される個々の蛍光ドットは、多くの場合、区別がつきにくい可能性があります。ヒトおよび酵母細胞8の相互作用JDPのノックアウトまたはノックダウン後に蛍光穿刺形成のかなりの減少が観察された8は、これらのコシャペロン複合体を異なる方法で捕捉する際のPLAの高い特異性を示すセルの種類。真核生物とは対照的に、原核生物(大腸菌)JDPは混合クラスのJDP複合体を形成し、機能的にタンパク質分解を高めるために協力する能力を欠いていた、インビトロ8で。生化学的分析に合意し、細菌DnaJ-YFP(クラスA)とCbpA-mCherry(クラスB)との混合クラスJDP複合体形成は観察されなかった(図2I)。しかし、PLAのセットアップでは、2つのJDPを含む他のシャペロンアセンブリをキャプチャすることができました。例えば、DnaJ-YFPとDnaK(細菌Hsp70)とCbpA-mCherryとDnaK8(データは示さない)の間にシャペロン錯素を検出しました。これら2つの細菌シャペロン複合体は、インビトロおよびインビボ8、11、12の両方を広範囲に特徴付け、このように我々のPLA結果を確認する。これらの観察は、PLAが単細胞/多細胞真核細胞および原核細胞において一過性に形成されたシャペロン機械を強く捕捉する能力を実証する。相互作用するJDP/シャペロンの1つに対する一次抗体を欠いている技術制御は、マウスとウサギ由来の二次PLAプローブの両方を含むが、バックグラウンド蛍光シグナルをほとんどまたは全く示さなかった(図2A,B,D,E,G,H,J,K)は、我々の実験セットアップにおける偽陽性信号増幅の欠如を示す。
図1:近接性ライゲーションアッセイの時系列ステップの概略図。(1)タンパク質Aとタンパク質Bとの複合体(2)一次(1°)抗体の結合(緑色および薄褐色)をタンパク質AおよびBに結合する。2つの一次抗体は、異なる宿主種(例えばマウス、ウサギまたはヤギ)で飼育されなければならない。(3)一次抗体は、DNAオリゴタグ(PLAプローブ)と共有結合した種特異的二次(2°)抗体によって認識される。(4)タンパク質AとBが複合体内にある場合、結合したPLAプローブは、DNAオリゴがコネクタDNA鎖とハイブリダイズするのを容易にするために近接しており、円形DNA分子の形成をもたらす。続いて、DNAリガーゼは、ホスホジエステル結合の形成を触媒することによってDNA鎖の結合を促進する。(5)37°CのRCA反応における細菌DNAポリメラーゼによる円形DNA分子の転がり円増幅(RCA)の開始は、抗体共役DNAオリゴタグの1つによってプライミングされる。(6)二次抗体の1つに付着した一本鎖連結DNA分子の生成。(7)連結DNA分子における独特の反復配列に対する蛍光標識相補オリゴヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーション。ハイブリダイゼーション工程の後、連結DNA分子は、固定細胞における標的タンパク質複合体の位置における明るい蛍光ドットとして可視化することができる。底部は、PLA技術が適用可能な原核生物および真核細胞型を示す。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 2.原核細胞および真核細胞においてPLAによって捕捉された分子シャペロンアセンブリ。(A-C)ヒト子宮頸癌細胞株HeLaにおけるDNAJA2(クラスA)とDNAJB1(クラスB)との間に形成された混合クラスJDP複合体の検出。PLAは(A)抗DNAJA2抗体単独で行った(負の技術的制御);。(B) 抗DNAJB1抗体単独(陰性技術制御);(C) 抗DNAJB1と抗DNAJA2抗体を併備。パネルCにおける複数の蛍光ドット(陽性シグナル)の出現は、DNAJA2とDNAJB1の間に形成されたタンパク質複合体の存在を示す。各赤色蛍光ドット/パンクは、単一の相互作用を表します。核(DNA)をDAPI(シアン)で染色した。(D-F)S.セレビシエ細胞におけるYdj1(クラスA)とSis1(クラスB)の間に形成された混合クラスJDP複合体の検出。(D) PLAは抗Ydj1抗体単独で行った(負の技術的制御);。(E) PLAは抗Sis1抗体単独で行った(負の技術的制御);。(F) PLAは、抗Ydj1抗体と抗Sis1抗体を併用して行った。正の蛍光シグナルは、S.セレビシエにおけるYdj1およびSis1複合体の存在を示す。酵母核をDAPI(シアン)で染色した。(G-L)大腸菌細胞における原核生物Hsp70(DnaK)とJGP(DnaJおよびCbpA)の間に形成されたシャペロン錯体の検出。原核生物JDPに対する特異的な一次抗体の欠如のために、大腸菌DnaJ(クラスA)およびCbpA(クラスB)はそれぞれYFPおよびmCherryでタグ付けされた。(G, J)PLAは、抗YFP単独で行われました(否定的な技術的制御);。(H)PLAは、アンチmCherry単独で行う(負の技術的制御)。(I) PLAは抗YFPおよび抗mCherry抗体で行った。蛍光ドット形成の欠如は、DnaJとCbpAの間の複雑な形成を示さない。(K)PLAは、抗DnaK抗体単独で行う(負の技術的制御)。(L) PLAは、抗YFPおよび抗DnaK抗体を一緒に行った。正の蛍光シグナルは、DnaKとDnaJの間の複雑な形成を示す。DAPI(シアン)で染色された細菌DNA。単一の一次抗体を含有することに加えて、すべての負の技術的制御は、それぞれの二次PLAプローブの存在下で行われた。スケールバー = 10 μm。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
共免疫沈殿および共局在化ベースのアプローチは、タンパク質集合を特徴付ける長年の方法として使用されてきた。一過性に形成された特定のシャペロン錯体の検出は、このような従来の方法では大きな課題であり、その結果、以前の所見は主に定性的解釈に限定される。細胞リシスベースの共免疫沈殿技術は、多くの場合、タンパク質とタンパク質の相互作用を安定させるために架橋を必要とします。細胞リシスは、一過性に形成されたシャペロン複合体を破壊するリスクを増加させる一方、架橋は、特にほとんどのシャペロンの固有の「粘着性」によって駆動される非ネイティブ相互作用を導入する可能性がある。共免疫沈殿を用いてHsp70シャペロン系を解析する場合、潜在的なアーティファクトは(a)シャペロンの高い発現レベルおよび(b)膜またはタンパク質凝集結合シャペロン機械に関する溶解性の問題から生じる可能性がある。また、共免疫沈殿ベースの技術は、捕捉されたタンパク質アセンブリの細胞局在化に関する情報を提供しない。共免疫沈殿技術を使用する欠点は、タンパク質の局在性情報を保存する共局在ベースのアプローチでは幾分減少します。しかし、2つ以上のタンパク質の共局在は、細胞内の同じマイクロドメインへのタンパク質の直接的なタンパク質結合または分割のいずれかを示す可能性があります。したがって、共局所解析は、せいぜい、タンパク質相互作用を予測する上で投機的であり、近接値を欠いている。標的タンパク質のバルクおよび無差別検出により、細胞内の特定のタンパク質アセンブリを研究する際にこの技術は非常に限られています。これは、標的タンパク質がHsp70シャペロン系の場合と同様に、広範囲の異なるタンパク質アセンブリを並行して形成する可能性がある場合に特に問題となる。これらの従来の方法論と比較して、PLAは保存されたタンパク質局在情報を持つ細胞における天然タンパク質の関連を強く検出し、定量するために開発されたその中で、より洗練された技術である。標的タンパク質間の近接性(約10〜30nm)に基づくこのアッセイによってタンパク質相互作用が明らかにされる。PLAは、近接距離の範囲を小さくして、(a)PLAプローブに付着したオリゴヌクレオチドタグの長さを減少させること、および/または(b)一次抗体に直接タグを結合させることにより、より厳格な読み出しを得ることができるということに関して「調整可能」である。正のPLA信号を解釈する際には注意が必要です。理想的には、タンパク質相互作用は、2つ以上の独立した方法論で確認されるべきである。PLAにおける蛍光シグナルの強度は、FRETの場合と同様に、相互作用するタンパク質間のタンパク質クラスターサイズまたは分離距離に決定的に関連していない。しかしながら、PLAは高い特異性および感受性を有し、成長因子またはサイトカインなどの非常に低い豊富なタンパク質および希少細胞型または臨床標本における相互作用を分析するためにも用いることができる13。
Hsp70シャペロンは、細胞寿命14の間に複数のコシャペロン(例えば、JGPおよびNEF)と提携し、異なる生物学的機能を駆動する。可能性のある Hsp70-JDP-NEF マシン構成の膨大な数と細胞内での動的な動作は、これらのシャペロンマシンの特定の役割の詳細な理解を大きく妨げている。したがって、異なるHsp70アセンブリの選択的なトレースを可能にする生物学的ツールは、細胞内のこのシャペロンネットワークの全体的な配線を解剖するために必要とされる。一過性に形成されたJDP-JDPおよびJDP-Hsp70シャペロン複合体7はPLAを有する細胞で効果的に捕捉され、この技術は高い解離定数を有する分子相互作用の研究に適していることを示した(例えば、>3 μM Kd)).現在の研究では、アッセイは主にシャペロン相互作用のための「はい」または「いいえ」タイプのバイナリ指標として使用されますが、ユーザーは、蛍光をデジタル的にカウントすることにより、相互作用の程度の半定量的読み出しを得るためにこの技術を使用することができます。信号強度15.しかしながら、PLA信号の非線形増幅のために、PLAデータを定量的な方法で解釈する際には注意が必要である16.前述の利点にもかかわらず、この方法には一定の制限があります。PLAの主な欠点の1つは、アッセイが細胞固定を必要とするため、生細胞におけるタンパク質錯体化の時間的ダイナミクスを解決する能力を大きく制限することである。これに対し、生体内FRET17または生物発光共鳴エネルギー伝達(BRET)18では、比較的小さな近接値(<10 nm)を有する生細胞における時空間時間的な方法で類似のタンパク質相互作用をモニタリングすることを可能にする。PLAとは対照的に、FRETシグナルはタンパク質発現レベル16と厳密な線形相関を示し、タンパク質相互作用の定量分析においてFRETをゴールドスタンダードとしています。しかし、FRETが謎の配向因子κ2に依存するのとは異なり、PLAはPLAプローブの向きの影響を受け、タンパク質複合体19を捕捉する確率を高める。使いやすさの点では、FRETとBRETは独自の専門知識を必要とするため、一般的にこれらの方法論の広範な研究コミュニティへのアクセシビリティを制限します。さらに、これらの技術の両方は、タンパク質機能および複雑な形成を妨げる可能性のあるかさばる発光/蛍光タンパク質タグを付加することにより、相互作用タンパク質の修飾を必要とする。
次の手順 (1-4) では、セルに PLA を正常に実装するために慎重に検討する必要があります。(1)抗体選択:市販のPLAキットは、マウス、ウサギ、ヤギのみに対して飼育された一次抗体と互換性があります。PLAは、オフターゲットに結合しない非常に特異的な一次抗体を必要とします。さらに、免疫組織化学(IHC)、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)、および/または免疫沈殿(IP)などのアプリケーションと互換性のある一次抗体を選択して、抗体が認識できることを確認することが重要です。折り畳まれたタンパク質の表面に露出した抗原アミノ酸配列。使用前に、その特異性に対するすべての一次抗体の試験を強くお勧めします。これは、全細胞リサテスのウェスタンブロット分析を介して行うことができる。標的タンパク質のサイズと配列の類似性が小さいホモログ(例えば、Hsp70およびJDPパラログ)を持つ場合、抗体の特異性は遺伝子ノックダウン/ノックアウトアプローチで、または精製に対してプローブすることによってテストすることができる。潜在的なクロス認識を除外するホモログ。適切な抗体が利用できない場合、標的タンパク質は、許容可能な品質の抗体を有するエピトープでタグ付けされる可能性があります(図 2F).(2)細胞の固定化と透過性:4%パラホルムアルデヒドと0.1-0.5%トリトン-X100の治療を用いて、細胞の固定化と透過化を行うことができる。4%パラホルムアルデヒドの使用は、99%メタノールを使用する固定条件と比較してタンパク質-タンパク質相互作用および細胞超構造を維持するためのより良い治療法である20,21,22.しかし、99%のメタノールで細胞を固定すると、細胞質の背景染色が少なく、細胞骨格関連タンパク質アセンブリの検出などの特定の症例に適している可能性があります。21,22.抗体のアクセシビリティを高める血漿膜とオルガネラ膜の両方の効率的な透過化は、非イオン界面活性剤Triton-X100で達成することができる。トリトンX100は、しかし、非特異的に血漿膜からタンパク質を除去することができます23,24.したがって、細胞膜に関連するタンパク質アセンブリの解析のために、セトールを標的とするサポニンやデジポニンなどの代替洗剤を適用して膜を透過化する可能性がある。21,22,25.(3)細胞壁の破壊:膜透過化の前に、細胞壁(例えば真菌、植物および細菌細胞)を有する細胞タイプの抗体の浸透性を高めるために、特定の溶解酵素を含む追加のステップが必要である。例えば、我々は、細胞壁を破壊するためにβ-グルカンを分解するリチケースを採用しました。S. cerevisiae26.同様に、E. coli細胞壁は、ペプチドキスキャンを標的とする酵素であるリザイムを使用して破壊された27,28.細胞壁組成および溶解酵素感受性は、異なる成長条件によって異なる26と文化の合流29,30.したがって、溶解酵素の濃度と消化時間は変化する可能性があり、細胞の過剰または過消化を防ぐために注意が必要です。細胞壁消化後、細胞は比較的壊れやすく、洗浄工程中にソルビトールなどの混雑剤がそのまま残る必要があります。(4)DNA増幅:DNAライゲーションと転がり円PCR反応ステップは、温度と湿度の変動に敏感である。アッセイの堅牢なDNA増幅と再現性を確保するために、これらの反応は湿度室内で37°Cで行われる必要があります。重要なことは、プロクセーションされた細胞は、バックグラウンドシグナルの増加につながる可能性のある非特異的抗体結合およびDNA増幅イベントを避けるためにアッセイを行っている間に乾燥するのを防ぐべきである。
考慮されるすべてのものは、このアッセイの実装は、ユニークな専門知識と洗練されたインストルメンテーションを必要としません。JDP-JDPおよびJDP-Hsp70シャペロン複合体のモニタリングが成功した場合、この技術が全ての細胞型で一時的に形成されたタンパク質アセンブリをトレースする可能性を示しています。酵母および細菌における技術の実装は、広範囲の生物における異なるタンパク質アセンブリによって媒介される様々な生物学的プロセスを研究するためのPLAの適用性を著しく増加させる。さらに、我々の研究は、種8全体で分子レベルで起こる進化的変化を研究するための有望な新しいタンパク質相互作用ツールとしてPLAを強調している。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者は何も開示していない。
Acknowledgments
NBNは、ビクトリア州政府とオーストラリア政府からの資金援助を受けて、モナッシュ大学医学部の特別募集助成金によって支援されています。ベルント・ブカウ(ZMBH、ハイデルベルク大学、ドイツ)とハーム・H・カンピングガ(オランダ・フローニンゲン大学生物医学科)の貴重な支援と試薬の共有に感謝します。イメージング施設、ハイデルベルク大学、ドイツ)は、共焦点顕微鏡と画像処理をサポートし、原稿の批判的な読み取りのためのクレア・ハースト(ARMI、モナッシュ大学、オーストラリア)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 37% Formaldehyde | Merck | 103999 | |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 32201 | |
| anti-DNAJA2 antibody | Abcam | ab157216 | |
| anti-DNAJB1 Antibody | Enzo Life Sciences | ADI-SPA-450 | |
| anti-DnaK antibody | In house | ||
| anti-mCherry antibody | Abcam | ab125096 | |
| anti-Sis1 Antibody | Cosmo Bio Corp | COP-080051 | |
| anti-Ydj1 antibody | StressMarq Biosciences | SMC-150, | |
| anti-YFP antibody | In house | ||
| Coplin slide-staining jar | Sigma-Aldrich | S5516 | |
| Diagnostic slides | Marienfeld | 1216530 | |
| DMEM | Thermo-Fischer | 31966021 | |
| DuoLink In Situ Detection Reagents Orange | Sigma-Aldrich | DUO92007 | |
| DuoLink In Situ Mounting Medium + DAPI | Sigma-Aldrich | DUO82040 | |
| DuoLink In Situ PLA Probe Anti-Mouse MINUS | Sigma-Aldrich | DUO92004 | |
| DuoLink In Situ PLA Probe Anti-Rabbit PLUS | Sigma-Aldrich | DUO92002 | |
| DuoLink In Situ Wash Buffers, Fluorescence | Sigma-Aldrich | DUO82049 | |
| Fetal Calf Serum | Thermo-Fischer | 10082147 | |
| Lysozyme | Sigma-Aldrich | 62971 | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 32213 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo-Fischer | 15070063 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma-Aldrich | P47-07 | |
| Sorbitol | Sigma-Aldrich | S7547 | |
| Triton-X100 | Merck | 108643 | |
| Trypsin | Thermo-Fischer | 25300096 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Zymolase 100T / / Lyticase | United States Biological | Z1004 |
References
- Soderberg, O., et al. Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation. Nature Methods. 3 (12), 995-1000 (2006).
- Weibrecht, I., et al. Proximity ligation assays: a recent addition to the proteomics toolbox. Expert Review of Proteomics. 7 (3), 401-409 (2010).
- Mayer, M. P., Gierasch, L. M. Recent advances in the structural and mechanistic aspects of Hsp70 molecular chaperones. Journal of Biological Chemistry. 294 (6), 2085-2097 (2019).
- Kampinga, H. H., Craig, E. A. The HSP70 chaperone machinery: J proteins as drivers of functional specificity. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11 (8), 579-592 (2010).
- Nillegoda, N. B., Bukau, B. Metazoan Hsp70-based protein disaggregases: emergence and mechanisms. Frontiers in Molecular Biosciences. 2, (2015).
- Bracher, A., Verghese, J. The nucleotide exchange factors of Hsp70 molecular chaperones. Frontiers in Molecular Biosciences. 2, (2015).
- Nillegoda, N. B., et al. Crucial HSP70 co-chaperone complex unlocks metazoan protein disaggregation. Nature. 524 (7564), 247-251 (2015).
- Nillegoda, N. B., et al. Evolution of an intricate J-protein network driving protein disaggregation in eukaryotes. Elife. 6, (2017).
- Kirstein, J., et al. In vivo properties of the disaggregase function of J-proteins and Hsc70 in Caenorhabditis elegans stress and aging. Aging Cell. 16 (6), 1414-1424 (2017).
- Nillegoda, N. B., Wentink, A. S., Bukau, B. Protein Disaggregation in multicellular organisms. Trends in Biochemical Sciences. 43 (4), 285-300 (2018).
- Chae, C., Sharma, S., Hoskins, J. R., Wickner, S. CbpA, a DnaJ homolog, is a DnaK co-chaperone, and its activity is modulated by CbpM. Journal of Biological Chemistry. 279 (32), 33147-33153 (2004).
- Kityk, R., Kopp, J., Mayer, M. P. Molecular Mechanism of J-domain-Triggered ATP Hydrolysis by Hsp70 Chaperones. Molecular Cell. 69 (2), 227-237 (2018).
- Söderberg, O., et al. Characterizing proteins and their interactions in cells and tissues using the in situ proximity ligation assay. Methods. 45 (3), 227-232 (2008).
- Benschop, J. J., et al. A consensus of core protein complex compositions for Saccharomyces cerevisiae. Molecular Cell. 38 (6), 916-928 (2010).
- Jung, J., et al. Quantifying RNA-protein interactions in situ using modified-MTRIPs and proximity ligation. Nucleic Acids Research. 41 (1), (2013).
- Mocanu, M. M., Váradi, T., Szöllosi, J., Nagy, P. Comparative analysis of fluorescence resonance energy transfer (FRET) and proximity ligation assay (PLA). Proteomics. 11 (10), 2063-2070 (2011).
- Sekar, R. B., Periasamy, A. Fluorescence resonance energy transfer (FRET) microscopy imaging of live cell protein localizations. Journal of Cell Biology. 160 (5), 629-633 (2003).
- Deriziotis, P., Graham, S. A., Estruch, S. B., Fisher, S. E. Investigating protein-protein interactions in live cells using bioluminescence resonance energy transfer. Journal of Visualized Experiments. 87, (2014).
- Nagy, P., Szöllosi, J. Proximity or no proximity: that is the question – but the answer is more complex. Cytometry. 75 (10), 813-815 (2009).
- Hoetelmans, R. W., et al. Effects of acetone, methanol, or paraformaldehyde on cellular structure, visualized by reflection contrast microscopy and transmission and scanning electron microscopy. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 9 (4), 346-351 (2001).
- Schnell, U., Dijk, F., Sjollema, K. A., Giepmans, B. N. Immunolabeling artifacts and the need for live-cell imaging. Nature Methods. 9 (2), 152-158 (2012).
- Stadler, C., Skogs, M., Brismar, H., Uhlen, M., Lundberg, E. A single fixation protocol for proteome-wide immunofluorescence localization studies. Journal of Proteomics. 73 (6), 1067-1078 (2010).
- Goldenthal, K. L., Hedman, K., Chen, J. W., August, J. T., Willingham, M. C. Postfixation detergent treatment for immunofluorescence suppresses localization of some integral membrane proteins. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 33 (8), 813-820 (1985).
- Schrader, M., Almeida, M., Grille, S. Postfixation detergent treatment liberates the membrane modelling protein Pex11beta from peroxisomal membranes. Histochemistry & Cell Biology. 138 (3), 541-547 (2012).
- Willingham, M. C., Yamada, S. S., Pastan, I. Ultrastructural antibody localization of alpha2-macroglobulin in membrane-limited vesicles in cultured cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 75 (9), 4359-4363 (1978).
- Aguilar-Uscanga, B., Francois, J. M. A study of the yeast cell wall composition and structure in response to growth conditions and mode of cultivation. Letters in Applied Microbiology. 37 (3), 268-274 (2003).
- Romaniuk, J. A., Cegelski, L. Bacterial cell wall composition and the influence of antibiotics by cell-wall and whole-cell NMR. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 370, 1679 (2015).
- Salazar, O., Asenjo, J. A. Enzymatic lysis of microbial cells. Biotechnology Letters. 29 (7), 985-994 (2007).
- Cunningham, A. F., Spreadbury, C. L. Mycobacterial stationary phase induced by low oxygen tension: cell wall thickening and localization of the 16-kilodalton alpha-crystallin homolog. Journal of Bacteriology. 180 (4), 801-808 (1998).
- Werner-Washburne, M., Braun, E., Johnston, G. C., Singer, R. A. Stationary phase in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Microbiological Reviews. 57 (2), 383-401 (1993).
