Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

توليد التدرجات المخدرات غير متجانسة عبر السكان السرطان على مسرّع تطور Microfluidic للمراقبة في الوقت الحقيقي

Published: September 19, 2019 doi: 10.3791/60185
Automatic Translation
1, 2, 1, 2, 1, 1
1Princeton University, 2Johns Hopkins Medical Institute

Summary

نقدم نموذج السرطان على رقاقة microfluidic، تكنولوجيا "مسرّع التطور"، والتي توفر منصة يمكن التحكم فيها للدراسات الكمية في الوقت الحقيقي على المدى الطويل لديناميات السرطان ضمن ظروف بيئية محددة جيدا في الخلية الواحدة مستوي. ومن المتوقع أن تعمل هذه التكنولوجيا كنموذج في المختبر للبحوث الأساسية أو تطوير الأدوية قبل السريرية.

Abstract

لا تزال ثقافة الخلايا التقليدية النموذج ما قبل السريري الأكثر استخداما، على الرغم من قدرتها المحدودة ثبت للتنبؤ بالنتائج السريرية في السرطان. وقد اقترحت نماذج سرطان ميكروفلويديك على رقاقة لسد الفجوة بين الثقافات التقليدية المفرطة في الأبعاد التقليدية ونماذج الحيوانات أكثر تعقيدا، والتي لديها قدرة محدودة على تحقيق نتائج كمية موثوقة وقابلة للاستنساخ. هنا، نقدم نموذج سرطان ميكروفلويديك على رقاقة التي تستنسخ المكونات الرئيسية للبيئة الدقيقة الورم معقدة بطريقة شاملة، ولكن بسيطة بما فيه الكفاية لتوفير أوصاف كمية قوية لديناميات السرطان. هذا النموذج microfluidic السرطان على رقاقة، "مسرع التطور"، ينهار مجموعة كبيرة من الخلايا السرطانية في مجموعة مترابطة من البيئات الدقيقة الورم في حين توليد المناظر الطبيعية الإجهاد العلاج الكيميائي غير متجانسة. ويمكن رصد تطور السرطان ودينامياته التطورية استجابة لتدرج المخدرات لأسابيع في الوقت الحقيقي، ويمكن إجراء العديد من التجارب النهائية المكملة للصور الفاصلة زمنيا التي التقطت خلال التجارب.

Introduction

وقد أصبح من المسلم به على نحو متزايد أن السرطان نظام إيكولوجي معقد لا يعتمد فقط على استمرار خلل تنظيم مجموعات الخلايا المتحولة، بل أيضا على التفاعلات الحيوية بين الخلايا السرطانية والبيئة الصغرى المضيفة. وبهذا المعنى، يتطور السرطان على مشهد متكيف يتجلى في مجموعة من العوامل، بما في ذلك البيئة الدقيقة للورم غير المتجانس والتقاطع مع مجموعة متنوعة من الخلايا المضيفة، وكلها تساهم في ضغوط انتقائية لمزيد من الجينات أو التغيرات الجينيّة1،2،3. في سياق الأورام الصلبة، والتوزيع غير المتكافئ للعلاج الكيميائي وغيرها من التدرجات الموارد يساهم في عدم تجانسها الجزيئي، ويمكن أن تلعب دورا في تطوير مقاومة المخدرات، وزيادة تكوين الأوعية الدموية إلى ورم معين التجمعات السكانية الفرعية، وحتى الانبثاث4،5،6. التقليدية في المختبر 2D دراسات زراعة الخلايا، في حين تمتلك واسعة النطاق، والقدرة التجريبية مريحة، ويوفر متوسط الميدان، موحدة، وظروف ثابتة، وغالبا ما تفتقر إلى الرقابة البيئية المكانية والزمنية الدقيقة اللازمة حقا محاكاة في ديناميات الورم في الجسم الحي. وبالتالي، هناك حاجة إلى نماذج أكثر تمثيلا من الجسم الحي من أجل إعادة إنتاج البيئة الدقيقة الورم قبل النماذج الحيوانية في خط أنابيب تطوير المخدرات من أجل التنبؤ بشكل أفضل من تطور السرطان، فضلا عن الاستجابات للأدوية ضمن الإجهاد الديناميكي المناظر الطبيعيه. وقد تم اقتراح Microfluidics لسد الفجوة بين دراسات زراعة الخلايا 2D وأكثر تعقيدا في الدراسات الحيوانية الحية التي قد لا تكون قادرة على دعم الدراسات الكمية التي يمكن السيطرة عليها7،8،9.

يجب أن يمتلك النظام المثالي في المختبر لتوصيف ديناميات الخلايا السرطانية القدرة على توليد بيئة دقيقة غير متجانسة لمحاكاة الاستجابات الخلوية التكيفية التي قد تحدث في الورم، وكذلك السماح بمراقبة هذه الديناميات في دقة خلية واحدة. في هذه المقالة، ونحن نصف منصة ثقافة الخلية microfluidic، جهاز يستند إلى PDMS يسمى "مسرع التطور" (EA)، الذي يسمح للدراسات الموازية في المختبر من ديناميات الخلايا السرطانية في القرار الخلوي مع الحصول على البيانات في الوقت الحقيقي على مدى على مدى أسابيع، مع الحفاظ على التدرجات من الإجهاد في جميع أنحاء المشهد الثقافي. ويستند تصميم هذه المنصة على عملنا السابق، الذي يمكن تسريع الديناميات التطورية للكائنات الحية في ميتاالسكان10،11. وعلى وجه التحديد، في مجموعة من المجموعات السكانية المنفصلة مكانيا التي تتفاعل على مستوى ما، عندما تتعرض لمشهد إجهاد غير متجانس، يمكن للأنواع الأكثر ملاءمة أن تهيمن على السكان المحليين بشكل أسرع مقارنة بسكان موحدين. ثم تهاجر الأنواع المفيدة إلى الموائل الصغرى المجاورة بحثاً عن الموارد والفضاء، وتهيمن في نهاية المطاف على جميع السكان. كما هو مبين في الشكل 1،يتكون نمط رقاقة EA microfluidic من (1) زوج من القنوات السربنتين التي توفر تداول وسائل الإعلام الجديدة وبناء ظروف حدود ثابتة لنشر المواد الكيميائية، و '2' منطقة زراعة الخلايا سداسية الذي يتكون من 109 غرف سداسية مترابطة و 24 غرف نصف سداسية في المركز، تشبه بنية قرص العسل. الرقاقة هي 100 ميكرومتر في العمق. ترتبط القنوات الإعلامية ومنطقة زراعة الخلايا بالشقوق الصغيرة (حوالي 15 ميكرومتر)، والتي تمنع التدفق المباشر لوسائل الإعلام وما ينتج عنذلك من إجهاد القص عبر منطقة زراعة الخلايا، ومع ذلك لا تزال تسمح للمواد الكيميائية بالانتشار من خلال الشقوق الصغيرة وتبادل المواد الغذائية، النفايات الأيضية، الخ. ويبين الشكل 1باءتوليد التدرجات الكيميائية، حيث تحتوي إحدى القنوات الإعلامية على 0.1 مليون متر من الفلورسين بينما تكون القناة الأخرى خالية من الفلورسين. يتم زراعة الخلايا على غشاء نفاذية الغاز، مغلفة من قبل الهياكل الدقيقة من خلال الضغط الخلفي الإيجابي على الغشاء ضد رقاقة. يتم توضيح مكونات حامل الجهاز في الشكل 2،ويتم توضيح الإعداد التجريبي في الشكل 3،حيث يتم الحفاظ على الثقافة على المجهر المقلوب عند 37 درجة مئوية، مع الرطوبة النسبية فوق 85٪، ومكيفة تحت تكوين غاز نورموكسيا.

يوفر هذا النظام مراقبة تفصيلية للتفاعلات الخلوية المترجمة عبر قنوات برايتفيلد والفلورسنت ويسمح باختبارات المصب التي تم حلها مكانياً مثل الفلورة المناعية أو البقعة الغربية أو قياس الطيف الكتلي. لقد أثبتنا سابقا كدليل على المبدأ من هذا النموذج سرطان microfluidic على رقاقة على الثقافة المشتركة على المدى الطويل من الظهارية وmesenchymal PC3 خلايا سرطان البروستاتا12، فضلا عن ظهور المخدرات المقاومة للعملاق متعدد البلويد الخلايا السرطانية باستخدام خط الخلية PC3 الظهارية13. في حين أننا نقدم تطبيق هذه المنصة لفهم ديناميات spatiotime من PC3 الظهارية وخلايا سرطان البروستاتا mesenchymal تحت تدرج الإجهاد من docetaxel، يمكن تطبيق نظام microfluidic بسهولة على أي مزيج من خطوط الخلايا والموارد (أي المخدرات والمغذيات والأكسجين) التدرجات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. تصنيع جهاز ميكروفلويديك

  1. توليد نمط microfluidic المطلوب باستخدام برنامج تصميم تخطيط (انظر المواد التكميلية).
  2. تلفيق قناع الصور. انظر جدول المواد للحصول على مزيد من التفاصيل.
    1. باستخدام كاتب الليزر، وكتابة نمط على لوحة الزجاج الصودا الجير المغلفة مع 100 نانومتر من Cr و 500 نانومتر من مقاومة الضوء AZ1518.
    2. تطوير مقاومة الضوء مع المطور AZ300MIF لمدة 60 s.
    3. حفر بعيدا الكروم دون حماية من مقاومة للضوء باستخدام Cr-7 الكروم Etchant.
    4. خلع قبالة مقاومة للضوء المتبقية باستخدام متجرد مقاومة للضوء في 70 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة.
  3. نمط مقاومة للضوء. انظر جدول المواد للحصول على مزيد من التفاصيل.
    1. تدور معطف HMDS على رقاقة السيليكون في 4000 دورة في الدقيقة لمدة 40 ق.
    2. تدور معطف مقاومة للضوء AZ4330 على رقاقة السيليكون في 4000 دورة في الدقيقة لمدة 40 ق.
    3. خبز لينة رقاقة السيليكون في 95 درجة مئوية لمدة 60 ق.
    4. الاستفادة من المحاذاة قناع لفضح الأشعة فوق البنفسجية إلى رقاقة السيليكون.
    5. تطوير مقاومة الضوء مع المطور AZ300MIF لمدة 4 دقائق.
  4. أداء DRIE النقش. انظر جدول المواد للحصول على مزيد من التفاصيل.
    1. الجافة حفر رقاقة منقوشة مع مقاومة للضوء باستخدام السيليكون العميق رد الفعل أيون النقش (DRIE) نظام لعمق 100 درجة مئوية.
    2. خلع قبالة مقاومة للضوء مع الأسيتون والبلازما حفر مع البلازما الخ.
  5. أكسدة رقاقة وsilanization. انظر جدول المواد للحصول على مزيد من التفاصيل.
    1. إجراء الأكسدة الحرارية على رقاقة السيليكون محفورة في فرن في 1100 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
    2. انتظر رقاقة السيليكون لتبرد، ثم ضع الرقاقة في المجفف مع بضع قطرات من ثلاثي كلورو-1H،1H، 2H-perfluorooctyl-silane (PFOTS) ممزق في حاوية صغيرة بالقرب من رقاقة.
    3. ضخ ضغط المجفف إلى 0.5 أجهزة الصراف الآلي في درجة حرارة الغرفة لمدة 60 دقيقة. يجب أن يصبح قالب رقاقة السيليكون كارهة للماء بعد silanization السليم، والتي يمكن اختبارها عن طريق إضافة عدة قطرات من الماء على رقاقة.
  6. الطباعة الحجرية الناعمة. انظر جدول المواد للحصول على مزيد من التفاصيل.
    1. مزيج ما قبل البوليمر وعبر linker (من مجموعة بوليميثيل سيلوكسان (PDMS) في نسبة 10:1 حسب الوزن.
    2. صب PDMS مختلطة لخلق فيلم 10 ملم في الارتفاع على قالب رقاقة السيليكون silanized.
    3. Degas الناتجة PDMS-السيليكون رقاقة النظام في المجفف لمدة 30 دقيقة إلى 1 ساعة.
    4. احتضان رقاقة PDMS السيليكون في حاضنة 70 درجة مئوية بين عشية وضحاها لعلاج PDMS.
    5. مرة واحدة يتم الشفاء من PDMS، قشر فيلم PDMS قبالة رقاقة السيليكون بعناية.
    6. باستخدام إبر خزعة، لكمة من خلال الثقوب في منافذ مدخل على أساس موقع النمط على PDMS واستخدام لكمة دائرية لقطع رقائق 27 ملم في القطر.
  7. ربط طبقة PDMS.
    1. علاج الحرارة اثنين من أكوام من اسطوانات PDMS 27 ملم (دون النقش)، والتي سوف تصبح طبقة الخزان وطبقة السد من الجهاز.
    2. قطع اثنين من الدوائر 7 ملم حول مداخل على طبقة الخزان، واستخدام إبرة خزعة لكمة من خلال الثقوب في منافذ مدخل على طبقة السد.
    3. السندات ثلاثة أكوام من PDMS (مكدس منقوشة، طبقة الخزان، طبقة السد) مع العلاج البلازما الأكسجين.
    4. مع إبرة خزعة، لكمة من خلال الثقوب في منافذ والميناء المركزي للجهاز.

2. إعداد وسائل الإعلام وخط الخلية

  1. إعداد وسائل الإعلام لزراعة خطوط الخلايا PC3، بما في ذلك PC3-EMT وPC3-EPI: مزيج RPMI 1640 المتوسطة مع 10٪ مصل البقر الجنيني (FBS) و 1X مضاد للمضادات الحيوية المضادة للنمو. إنشاء خطوط الخلايا كما هو موضحمسبقًا 14.
    ملاحظة: يتم الحفاظ على خطوط الخلايا PC3 في وسائل الإعلام المذكورة أعلاه في حاضنات رطبة في 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2. انقسام الخلايا والثقافة الفرعية كل 3 أيام، قبل أن تصل إلى 100٪ من الملاءمة.
  2. خطوط الخلايا عبر fect مع علامات الفلورسنت السيتوبلازمية المسمى لتحسين التصور، كما هو موضح سابقا12، مثل أن PC3-EMT يعبر عن GFP السيتوبلازمية وPC3-EPI يعبر عن mCherry السيتوبلازمية. لاحظ أن التكنولوجيا متوافقة أيضًا مع أي خلايا ذات علامة فلورية بالإضافة إلى تصوير الحقل الساطع للخلايا غير المسماة.

3. الإعداد التجريبي

  1. تصنيع حامل لوحة معدنية
    1. اصنع حامل لوحة يكفي لعقد أطباق ثقافية متزامنة قابلة للنفاذ بالغاز للتجارب الموازية عن طريق الآلات أو الطباعة ثلاثية الأبعاد. ملف CAD 3D ("لوحة 3-جيدا. FCStd") يمكن العثور على GitHub كمرجع (https://github.com/kechihl/3-well-plate).
    2. فك مكونات حامل(الشكل 2)مع مفك البراغي. تطهير المكونات عن طريق التعرض للأشعة فوق البنفسجية لمدة ساعة واحدة على الأقل وترك هافي بيئة معقمة.
      ملاحظة: تم تصميم حامل لتوفير ظروف كبيرة للتوازن الحراري وتركيبات الغاز المثالي، مع مداخل قناة الغاز التي تسمح لتدفق الهواء. ويمكن الاطلاع على مزيد من التفاصيل في عملنا السابق12.
    3. إعداد ما يصل إلى ثلاثة أطباق ثقافة الغاز نفاذية، والتي غشاء ثقافة الخلية مرنة نسبيا.
  2. خلية خط البذر
    1. قبل 24 ساعة من بدء التجربة، قم بحصاد خلايا PC3-EPI وPC3-EMT عن طريق التجريب لمدة 5 دقائق.
    2. عد الخلايا من كل PC3-EPI وPC3-EMT باستخدام مقياس الهيموزيتومتر وعزل ما مجموعه 2.5 × 104 من كل نوع الخلية لكل طبق ثقافة الغاز نفاذية.
    3. خلط وإعادة تعليق نوعين من الخلايا في 2 مل من وسائل الإعلام الثقافة والبذور الخلايا في كل من طبق الثقافة الغاز نفاذية.
    4. ترك حامل لوحة كاملة في الحاضنة بين عشية وضحاها للخلايا لإرفاق.
    5. تطهير أجهزة PDMS عن طريق التعرض للأشعة فوق البنفسجية لمدة ساعة واحدة على الأقل وترك في بيئة معقمة.
  3. إنشاء وحدة التحكم الحراري ونظام إمدادات الغاز
    1. كما هو مبين في الشكل 3،إنشاء نظام إمدادات الغاز الذي يتكون من كل منثاني أكسيد الكربون وO2 وحدات التحكم، ومضخة الغاز، وغرفة خلط الغاز، ومرطب أو فقاعة، وثلاث مجموعات منفصلة من صمامات الغاز ومقاييس الضغط. ويمكن الاطلاع على مزيد من التفاصيل في عملنا السابق12.
    2. إعداد وحدات التحكم CO2 و O2 بحيث تقوم بتعديل معدل خلط الغاز من خزانات CO2 و N2 ومصدر O2. وبدلاً من ذلك، فإن أي نظام لتوريد الغاز يوفر الغاز في ظل حالة نورموكسيا سيعمل.
    3. تأكد من أن الغاز الذي يتم دمجه في غرفة الخلط وترطيبه بواسطة فقاعة بحيث يتم زيادة الرطوبة النسبية تصل إلى 85٪ (كما تقرأ من جهاز مراقبة الرطوبة النسبية) وأن الغاز يؤدي إلى ثلاثة صمامات الغاز المستقلة مع مقاييس الضغط من أجل مراقبة ومراقبة معدل تدفق الغاز في حامل لوحة.
    4. ضع حامل اللوحة بالكامل في وحدة التحكم الحراري في الحضانة على خشبة المسرح مع وحدات فرعية منفصلة للتدفئة للغطاء واللوحة السفلية، مع تعيين جميع الوحدات عند درجة حرارة 37 درجة مئوية. انظر جدول المواد للحصول على مزيد من التفاصيل.
  4. تركيب جهاز ميكروفلويديك. انظر جدول المواد للحصول على مزيد من التفاصيل.
    1. تحديد أن المكونات التفصيلية لحامل لوحة 3-جيدا هي في النظام، كما هو الحال في الشكل 2. كل من الآبار الثلاثة متطابقة ومستقلة، مع زوج من قنوات الغاز لكل بئر. كل بئر تمتلك حامل طبق ثقافة نفاذية الغاز، حامل رقاقة PDMS، حامل نافذة زجاجية، وزوج من النوافذ الزجاجية 35 ملم. ويمكن تجميع هذه المكونات باستخدام مسامير تركيبها.
      ملاحظة: تضمن النوافذ الزجاجية وجود مساحة معزولة حراريًا بين غشاء الثقافة القابل ة للنفاذ بالغاز والبئر بحيث لا يحدث تكثيف للمياه بسبب الاختلافات في درجة الحرارة في الواجهة. لاحظ أن الآبار الثلاثة مستقلة، ويمكن إجراء 3 تجارب بشكل منفصل.
    2. ما قبل الحارة وسط الثقافة في 37 درجة مئوية وdegas في غرفة فراغ لمدة 20 دقيقة.
    3. علاج رقائق PDMS باستخدام نظام البلازما الأكسجين لمدة 30 ثانية من أجل الحفاظ على hydrophilicity.
    4. إعداد نظام الحقنة. تحميل اثنين من المحاقن ببطء مع وسائل الإعلام النمو وغيرها من المحاقن مع كاشف المطلوب من الاهتمام (وسائل الإعلام، وسائل الإعلام مع المخدرات، وما إلى ذلك). قم بتوصيل كل حقنة فردية بأنابيب مقاس 50 سم (0.020 بوصة × 0.060 بوصة OD) بواسطة إبرة صرف 23 G في دبوس واحد من الفولاذ المجوف. إدراج دبوس الصلب جوفاء في الطرف الآخر من الأنابيب.
    5. رئيس الأنابيب وإدراج دبوس الصلب في كل رقاقة PDMS من خلال طبقة السد. املأ طبقة الخزان وأبلى نمط طبقة نمط PDMS بالوسائط. تعمل طبقة الخزان كفخ فقاعة على رقاقة لمنع فقاعات الهواء من الدخول في نمط microfluidic.
    6. تحميل حقنة 1 مل مع وسائل الإعلام الثقافة. قم بتوصيل الحقنة بأنابيب مقاس 5 سم (0.020 بوصة × 0.060 بوصة OD) بواسطة إبرة صرف 23 G في دبوس واحد من الصلب المجوف. إدراج دبوس الصلب جوفاء في الطرف الآخر من الأنابيب ورئيس الأنابيب.
    7. إدراج دبوس الصلب جوفاء في ثقب مركز من رقاقة، حيث يمكن استخراج وسائل الإعلام المفرطة من رقاقة في وقت لاحق خلال عملية ختم رقاقة.
    8. كما يتطلب كل جهاز PDMS أربع محاقن 10 مل محملة على مضخة حقنة، تحميل اثنين من المحاقن 10 مل لكل رقاقة في سطح السفينة إلى الأمام. ضع المحاقن الأخرى في سطح السفينة سحب من نظام الحقنة.
    9. وضع رقاقة مباشرة على رأس الأغشية ثقافة الغاز نفاذية (مع الخلايا انضمت بالفعل إلى الأغشية). من أجل تجنب ربط الفقاعات الدقيقة في نمط microfluidic، الاستغناء عن 1 مل من وسائل الإعلام prewarmed وdegassed في طبق ثقافة الغاز 35 ملم نفاذية قبل التجمع، ومن ثم تأكد من أن رقاقة تقترب من السطح السائل مع زاوية الميل 15 درجة.
    10. قم بلصق طبق الثقافة القابل للنفاذ بالغاز والبئر في حامل طبق الثقافة القابل للنفاذ بالغاز لكل شريحة، مع دفع حامل رقاقة PDMS جهاز PDMS لأسفل.
    11. الشريط ورقة من السدادة على رأس جهاز PDMS والمشبك مع حامل رقاقة PDMS من أجل منع رقاقة من التجفيف.
    12. تعيين معدل تدفق الوسائط حول الصفيف ليكون 20 درجة مئوية/ ساعة.
    13. تعيين لوحة كاملة في حاضنة على خشبة المسرح على مرحلة آلية من المجهر المقلوب. ربط نظام إمدادات الغاز إلى قنوات الغاز والضغط على غشاء الثقافة نفاذية الغاز ضد رقاقة PDMS المثبتة لضمان ختم الجهاز. الحفاظ على ضغط المقياس عند 0.2 رطل لكل بوصة مربعة (1.4 × 104 باسكال).
    14. استخراج ببطء وسائل الإعلام المفرطة في رقاقة باستخدام حقنة 1 مل من ثقب المركز. مراقبة رقاقة تحت المجهر أثناء استخراج وسائل الإعلام ومن ثم التوقف عن استخراج عندما يتم ختم رقاقة. يجب أن يكون ختم رقاقة واضحة لأن جزءا من الخلايا سوف تسحق من قبل الهياكل الصغيرة.
    15. قم بتوصيل وحدة استشعار درجة الحرارة في الحاضنة على خشبة المسرح بلوحة 3 آبار ومجموعة إلى 37 درجة مئوية.

4. خلية واحدة التصوير الفاصل الزمني

  1. إعداد برنامج التصوير باستخدام المجهر المقلوب للحصول على صورة الفاصل الزمني. لاحظ أن المجهر الفلورسنت المقلوب مع مرحلة x-y الآلية بالكامل، مقبض التركيز، مصراع، ومكعبات فلتر مطلوب لتجربة EA.
  2. تكوين البرامج للحصول على الصور عبر قناتين في التكبير 10X لكل رقاقة مع التلقائي صورة خياطة بعد جولة واحدة من التركيز التلقائي. كن على علم بأن أنظمة التصحيح التلقائي مثل Perfect Focus لا تضمن جودة صورة مرضية. من المستحسن أكثر لتوليد سطح تركيز مخصص للحصول على صورة على المدى الطويل على أساس التركيز التلقائي أو التركيز اليدوي عبر الشريحة.
  3. التقاط الصور كل ساعة وترك التجربة تعمل على مقياس الوقت من الأسابيع. مراقبة جودة الصورة على أساس يومي وتحديث سطح التركيز إذا لزم الأمر.
  4. إعداد رقاقة PDMS والغاز نفاذية طبق الثقافة لتحليل المناعية اللاحقة، كما هو موضح سابقا13.

5 - معالجة الصور وتحليلها

  1. التجهيز بعد التجريبية
    1. تحويل الصور إلى تنسيق TIFF لمعالجة الصور والقياسات باستخدام فيجي /ImageJ.
    2. ضغط ملفات TIFF لتسهيل المزيد من معالجة الصور.
  2. فيجي/تحليل ImageJ
    1. لتحديد الخلايا، قم بإجراء الطرح في الخلفية وتحليل الجسيمات لتحديد البقع الساطعة الفلورية للكشف عن موقع الخلية والفرز التلقائي للخلايا.
    2. الاستفادة من الإضافات (تتبع دليل، Chemotaxis، أداة الهجرة، Trackmate) لتحليل حركية الخلية والهجرة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

التحقق من نمو الخلايا الأمثل على رقاقة
يتمثل أحد الأهداف الرئيسية لمنصة التجربة في إعادة إنتاج المكونات والتفاعلات الرئيسية في بيئة جزئية معقدة للورم بطريقة شاملة، ولكنها بسيطة بما يكفي لتوفير بيانات كمية وموثوقة ويمكن استنساخها. ولا يمكن تحقيق هذا الهدف إلا إذا كانت لدينا السيطرة الكاملة على العوامل البيئية الفيزيائية والكيميائية الحيوية. يجب علينا إما استبعاد العوامل غير المرغوب فيها أو إيجاد طريقة لدمج العوامل التي لا يمكن السيطرة عليها في النموذج الكمي لتفسير السلوكيات السكانية بشكل صحيح.

الاختبار الأول هو ضمان نمو الخلايا الأمثل على الجهاز. يجب أن يكون معدل انتشار الخلايا على الجهاز متطابقًا أو مشابهًا لخصائص النمو الخاصة بها في ثقافة الخلايا التقليدية. كدليل على المبدأ، تم زراعة خلايا خلية سرطان البروستاتا البشرية PC3 في رقاقة PDMS دون وجود الإجهاد الخارجي. كانت هذه الخلايا تحمل علامة الفلورسنت في السيتوبلازم حتى نتمكن من مراقبة وتحديد كمية سكان الخلايا باستخدام الفحص المجهري الفلورسنت المقلوب. تم قياس التقاء الخلايا، الذي يعرف بأنه المنطقة التي تغطيها الخلايا، في كل موئل صغير في أطر زمنية مختلفة نظرال عتبة كثافة مختارة على الصور الفلورية باستخدام فيجي15. يتم رسم منحنيات نمو الخلايا في كل موقف تم اختياره في الشكل 4. وتنتشر المواقف المختارة في جميع أنحاء رقاقة، من المنطقة بالقرب من قمة تدفق وسائل الإعلام إلى قمة قريبة من وسائل الإعلام.

منحنيات النمو في الشكل 4باء متوائمة بشكل جيد، مما يشير إلى تطابق ملف انتشار الخلايا كدالة للموقف عبر الشريحة. ويكشف المنحدر الأولي للمنحنيات عن معدل الانتشار. الوقت مضاعفة للخلايا في الجهاز حوالي 24 ساعة كما هو مبين في الشكل 4B من الوقت 0 إلى 24 ساعة، وهو نفس الوقت مضاعفة في cultureware التقليدية13. لذلك، نخلص إلى أنه بدون وجود مصدر خارجي للإجهاد، يتم توزيع العوامل الفيزيائية والكيميائية الحيوية بشكل موحد، مما يؤدي إلى نمو الخلايا المتجانسة والأمثل من الوقت 50 إلى 100 ساعة.

ونظرنا كذلك في القدرة على تحديد ديناميات الخلايا كميا بين التجمعات السكانية الفرعية في بيئة صغيرة. تم زراعة خطوط الخلايا PC3-EPI التي تعبر عن GFP والخطوط الخلوية PC3-EPI التي تعبر عن الكرز في EA كما هو موضح في الشكل 5. ويقاس التقاء الخلايا، الذي يعرف بأنه النسبة المئوية للمساحة التي تغطيها الخلايا، على أنه مؤشر على حجم السكان. بدءا من 40٪ التقاء، نمت الثقافة المشتركة بشكل كامل في غضون 3 أيام. ومن المثير للاهتمام، ونحن قد نلاحظ تطور كل النمط الظاهري في البيئة الدقيقة. وفي حين أن منحنى النمو المتمثل في التقاء إجمالي هو في شكل نموذج للنمو اللوجستي، فإن عدد سكان PC3-EMT استمر في التوسع وتم قمع PC3-EPI في المرحلة الزمابية.

مظاهرة من خلية موتى عمليّة تكلّم في ال [سكل س] مختلطة
حركية الخلية هو سلوك الفينوتيبيك المهم. يمكن أن يوفر توزيع الحركة للسكان معلومات حول التفاعل المادي للخلايا، والخصائص الميكانيكية للبيئة الدقيقة المحلية، ويمكن تحليلها في بعض الأحيان كمؤشر على التباين الجيني للخلايا. وبالنظر إلى أن لدينا منصة ثقافة الخلية المحسنة يسمح التصوير المستمر تقريبا، وميزة وجود دقة زمنية غرامة يزيد من إمكانات تتبع خلية واحدة في السكان غير متجانسة.

نحن نستخدم البرنامج المساعد TrackMate16 في فيجي (http://fiji.sc) مع ماكرو مخصص لتنفيذ وأتمتة عملية التتبع. TrackMate يسمح للمستخدم لتنفيذ وتخصيص خوارزمية تتبع باستخدام لغة البرمجة النصية من محرر البرنامج النصي فيجي. وتنقسم عملية التتبع في سلسلة من الخطوات: عمليات التجزئة والتصفية وربط الجسيمات.

كما هو مبين في الشكل 6ب، قمنا بإجراء "دراسة التئام الجروح" كدليل لدراسة الهجرة الجماعية للخلايا والتفاعل مع الخلايا. تم زرع خلايا PC3-EPI وPC3-EMT بكثافة في وسط الجهاز وسمح لها بالهجرة بحرية نحو المنطقة الفارغة. يتم رسم الرسم البياني تطبيع من سرعة كلا النمطين الظاهري في الشكل 6C. كانت سرعة PC3-EMT أعلى بكثير من PC3-EPI بعامل 1.8x، وهو ما يتفق مع حقيقة أن النمط الظاهري mesenchymal بمثابة عنصر من التئام الجروح الجلدية مع قدرة استثنائية على الهجرة بدلا من مقارنة مع مقارنة النمط الظاهري الظهاري الثابت.

وعلاوة على ذلك، من أجل مراقبة تطور حركية الخلايا في بيئة خالية من الإجهاد، قمنا بزراعة مشتركة طويلة الأجل لـ PC3-EPI وPC3-EMT مع كثافة البذر الأولية الموحدة وتتبعنا توزيع سرعة الخلية التي تختلف مع مرور الوقت. كما هو مبين في الشكل 7A، B، بعد 6 أيام من الثقافة، كما وصلت الخلايا التقاء أعلى، وتوزيع سرعة الخلية لكلا الأنماط الظاهرية انحنى نحو ذيول اليسار.

قد نقارن نسبة عدد PC3-EPI إلى PC3-EMT في كل فاصل زمني للفئة. كما هو مبين في الشكل 7C، بغض النظر عن أيام الثقافة أو كثافة الخلايا ، سيطر PC3-EMT على المنطقة عالية السرعة في حين احتلت PC3-EPI منطقة السرعة المنخفضة. وعلى الرغم من أن السرعة الإجمالية انخفضت بشكل كبير بالنسبة لكل من النمطين الظاهريين، فقد ظلت PC3-EMT مُرتذة وتأثرت أقل بازدحام البيئة الصغرى كما هو مبين في الشكل 7دال. انخفض متوسط سرعة PC3-EPI حوالي 40٪ في حين أن من PC3-EMT انخفض فقط 14٪.

هناك العديد من العوامل التي يمكن أن تؤثر على توزيع سرعة الخلية ومتوسط السرعة، مثل ازدحام السكان. تتبع الخلايا المستمرة ورصد جميع السكان الفرعيين أمر ضروري لفهم تطور السلوك phenotypic. على سبيل المثال، إذا كنا نود أن نحدد مقدار الوضع المتوسط للسكان الفرعيين غير المسمى، سيكون من الأكثر إفادة الحصول ليس فقط على توزيع الكمية المادية (مثل السرعة) من السكان الفرعيين المهتمين كدالة الوقت، ولكن أيضا أن من كل ما تبقى من السكان الفرعيين التعايش من الخلايا.

Figure 1
الشكل 1: رقاقة EA التي تعمل بمضخة الحقنة. (أ)يحتوي الجهاز microfluidic على مداخلتين متوسطتين منفصلتين، ومنفذين، ومنفذ مركزي واحد لبذر الخلايا أو استخراج المتوسطة المفرطة. لاحظ أنه بين مداخل المتوسطة صفائف زراعة الخلايا، زوج من القنوات السربنتين التي تسمح للوسط بالتوفيق مع الغلاف الجوي الذي يمر تحت الغشاء القابل للنفاذ ية الغاز. (ب)توليد التدرج. ضخ المحاقن المتوسطة مع ~ 0.1 mM من الفلورسين وليس الفلورسين على التوالي في رقاقة من خلال 2 مداخل المتوسطة على اليمين، المستخرجة من رقاقة في 2 منافذ متوسطة على اليسار. ويتناسب تركيز الفلورسين مع شدة إشارة الفلورة، ويُوصف بالقرب من المداخل/المنافذ المتوسطة (أ) وبالقرب من المركز ب. الشكل المستنسخ ة بإذن من Lin et al. 201712. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: مكونات لوحة عينة 3 جيدا حسب الطلب. (أ)الجسم الرئيسي من 3 لوحة جيدا؛ (ب)زوج من قنوات الغاز التي تسمح بضخ الغلاف الجوي المكيف وتنفيسه من خلال الحاجز عند مدخل قنوات الغاز؛ (ج)حلقة O مصممة لختم المسافة بين لوحة البئر وطبق الثقافة الغاز نفاذية؛ (د)طبق الثقافة الغاز نفاذية قطرها 35 ملم؛ (هـ)حامل الطبق؛ (و)جهاز PDMS؛ (ز)أصحاب رقاقة PDMS؛ (ح)طبقة مزدوجة 35 مم النوافذ الزجاجية المصممة للحفاظ على العزلالحراري ومنع تكثيف المياه؛ (ط)حامل النافذة الزجاجية؛ (ي)منصات التدفئة؛ (ك)استشعار درجة الحرارة؛ (ل)السدادة لاصقة التي تحافظ على رقاقة من التجفيف. الشكل مستنسخ بإذن من لين وآخرون 201712. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: الشكل التخطيطي للإعداد التجريبي. إعداد التجربة، بما في ذلك نظام إمدادات الغاز، واتصال قنوات الغاز، واتصال العرض المتوسط ونظام التصوير. الشكل مستنسخ بإذن من لين وآخرون 201712. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: منحنيات النمو من PC3 في EA دون إجهاد. تم زراعة PC3 في EA دون وجود الإجهاد الخارجي. (أ)نمط EA مع تسميات الموضع. (ب)منحنيات النمو PC3 في المراكز المختارة من حيث التقاء الخلية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: الثقافة المشتركة لـ PC3-EPI وPC3-EMT في EA دون إجهاد. تم زراعة PC3-EPI (الأحمر) وPC3-EMT (الأخضر) في EA دون وجود الإجهاد الخارجي. (أ)تراكب قناتين فلورسنت في ر = 0 ح. (ب) صورة الفلورسنت التي اتخذت في ر = 95 ح . (C) منحنيات النمو من حيث التقاء الخلية. تم قياس التقاء الخلية من كل نوع الخلية على رقاقة كاملة. تمثل كل نقطة بيانات متوسط التقاء الخلية عند 3 نقاط زمنية متتالية يتم أخذها على فترات 15 دقيقة. تمثل أشرطة الخطأ الانحراف المعياري لالتقاء الخلية عند 3 نقاط زمنية متتالية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 6
الشكل 6: تحديد حركية الخلايا لبين السكان المختلطين. إظهار أداء تتبع الخلية الواحدة في مجموعة مختلطة من السكان. (أ)عرض توضيحي لكيفية اكتشاف الخلايا من قبل لابلاسيان من تقسيم غاوسيان (LoG). تشير الدوائر إلى موقع الخلايا التي تم اكتشافها بواسطة خوارزمية LoG. يتم ربط الخلايا المكتشفة من إطار إلى إطار استناداً إلى مشكلة التعيين الخطي لتحديد حركة الخلايا. (ب)"التئام الجروح" من PC3-EPI وPC3-EMT تجربة الثقافة المشتركة. تم زرع الخلايا محليا تصل إلى 100٪ التقاء مع حدود واضحة في المركز. بعد تركيب رقاقة EA، لوحظ تهاجر الخلايا من خلال صفيف الموائل الدقيقة كما هو مبين من قبل الأسهم البيضاء. (ج)رسم بياني طبيعي لحركية الخلايا. PC3-EMT أسرع من PC3-EPI بعامل 1.8x. تمثل أشرطة الخطأ الانحراف المعياري لـ 5 عينات تجارب. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 7
الشكل 7: تحديد الحركة لثقافة مشتركة طويلة الأجل لـ PC3-EPI وPC3-EMT. ثقافة مشتركة طويلة الأجل من PC3-EPI وPC3-EMT مع كثافة البذر الأولية موحدة. توزيع سرعة الخلية يختلف مع مرور الوقت. (أ)تطبيع توزيع سرعة الخلية في اليوم 2. (ب)التوزيع الطبيعي لسرعة الخلية في اليوم 6. (C)نسبة عدد PC3-EPI إلى PC3-EMT في كل فاصل زمني للفئة. (D)متوسط سرعة PC3-EPI وPC3-EMT كدالة للوقت. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

وقد وضعت ثقافة الخلايا التقليدية منذ ما يقرب من قرن من الزمان، ولا تزال النموذج ما قبل السريرية الأكثر استخداما في البحوث الطبية الحيوية، على الرغم من قدرتها المحدودة ثبت للتنبؤ النتائج السريرية في السرطان17. النماذج الحيوانية توفر أعلى الأهمية الفسيولوجية والتشابه الوراثي المعقول للبشر، ولكن منذ فترة طويلة تم الاعتراف بأن لديها قيود كبيرة في التنبؤ بالنتائج البشرية18. من بين جميع النماذج الموجودة قبل السريرية، يبدو أن نماذج السرطان على رقاقة microfluidic هي المرشح الأكثر واعدة لتلبية الحاجة غير الملباة في أبحاث السرطان9،19،20. ومع ذلك، فإن النماذج الحالية للسرطان على رقاقة لم تقدم بعد منصة قادرة على إعادة إنتاج المكونات الرئيسية والتفاعلات لتقليد بيئة الورم الدقيقة بطريقة شاملة، ولكن بسيطة بما فيه الكفاية لتوفير بيانات كمية موثوقة وقابلة للاستنساخ. تظهر بياناتنا التمثيلية أن تقنية زراعة الخلايا الدقيقة توفر ظروفًا فيزيائية وكيميائية حيوية مستقرة لثقافة الخلايا طويلة الأجل في البيئات الدقيقة غير المتجانسة. تتيح هذه المنصة متعددة الوظائف التعديل المتطور للتدرج الكيميائي المعتمد على الوقت بالإضافة إلى تكوين الغاز المحيط. المنصة محمولة ومتوافقة مع معظم المجاهر المقلوبة الفلورية للتصوير في الوقت الحقيقي عالية الدقة، والتي توفر معلومات متعددة الأبعاد من الخلايا كدالة للوقت، بما في ذلك مورفولوجيا الخلية، وديناميات السكان، والخلية الحركة وهجرة الخلايا على مستوى خلية واحدة.

بالمقارنة مع عملنا السابق11،نلاحظ أن هذا الضغط الختم التعبئة والتغليف وطريقة التجميع لجهاز microfluidic لدينا تمكن العديد من قدرات التجارب المصب (على سبيل المثال، FACS، استخراج المستقلب المحلية، والسكان تحت الكلون التوسع، إذا، الحمض النووي / الحمض النووي الريبي الأسماك، الخ) مكملة للصور الفاصلة الزمنية التي اتخذت في سياق التجارب. هذه القدرة على إزالة الخلايا من مواقع محددة في ثقافة غير متجانسة هو تقدم كبير بالمقارنة مع الأجهزة السابقة، حيث سطح الختم إلى رقاقة كان لا بد من إزالتها قبل أن يمكن للمرء الوصول إلى الثقافة11. وعلاوة على ذلك، وحتى في هذه الحالة، فإن إزالة الغطاء قد أزعجت الثقافة إلى حد كبير بحيث لا يكون من الممكن إجراء اختبار محلي للخلايا على مستويات موئل ية واحدة إلى قليلة. وكان هذا الاستخراج الموضعي ممكنا في حالتنا بسبب الطبيعة الناعمة "القابلة لإعادة الإغلاق" للغشاء المرن القابل للنفاذ ية الغاز.

هناك عدة خطوات حاسمة في البروتوكول المعروض. أولاوقبل كل شيء، لبدء تجربة طويلة الأجل مع ديناميات سيولة مستقرة، يجب تجنب microbubbles قدر الإمكان. لذلك، من المهم أن prewarm وdegas وسط الثقافة (الخطوة 3.4.2) قبل تحميل وسائل الإعلام في المحاقن. وينبغي أن يتم التلاعب في تحميل وسائل الإعلام والاستغناء ببطء وبلطف لمنع تشكيل فقاعة. وينبغي معالجة نمط PDMS ببلازما الأكسجين (الخطوة 3-4-3) قبل الاتصال بنظام الإمداد بوسائط الثقافة. العلاج بالبلازما الأكسجين يضمن الهيدروفيليسيتي من سطح PDMS ويقلل بشكل كبير من إمكانية ربط الفقاعات الدقيقة. في الخطوة 3.4.7.، عند وضع رقاقة على رأس غشاء ثقافة الخلية، يجب أن تقترب رقاقة PDMS من السطح السائل مع زاوية إمالة 15 درجة للتخلص من الفقاعات (إن وجدت) على السطح السائل داخل طبق الثقافة. ثانيا، تتطلب طريقة ختم الضغط نظام إمدادات الغاز المستقرالذي يضغط على غشاء ثقافة الخلية. يجب تعيين الضغط بين 0.2 إلى 0.6 رطل لكل بوصة مربعة. الضغط أقل من 0.2 رطل لكل بوصة مربعة غير كافية لختم رقاقة. فوق 1.2 رطل لكل بوصة مربعة، سوف تتخلل كمية كبيرة من الغاز من خلال الغشاء وتولد فقاعات داخل نمط microfluidic. نلاحظ أنه إذا لم يتم تجميع مكونات لوحة معدنية 3-جيدا بشكل صحيح (بما في ذلك الجسم لوحة، وحامل طبق ثقافة الغاز نفاذية، حامل رقاقة PDMS، حامل نافذة الزجاج، O-خواتم، وزوج من النوافذ الزجاجية 35 ملم)، واحد من شأنه أن يحدد تسرب الغاز كما قراءة الضغط ستكون غير مستجيبة لزيادة تدفق الغاز. يمكن حل مشكلة التسرب ببساطة عن طريق إجراء اختبار تسرب ومن ثم إعادة تجميع المكونات.

والشكل الرئيسي للبيانات التي يتم الحصول عليها باستخدام تكنولوجيا EA هو من خلال التصوير. كما ذكر سابقا، يمكن تثبيت تكنولوجيا EA على أي مجهر مقلوب. ومع ذلك، لاستغلال مزايا النظام بشكل كامل، فمن المستحسن للغاية لتثبيت النظام على مجهر الفلورسنت المقلوب مجهزة بمراحل x-Y الآلية، مقبض التركيز الآلي، مصراع بمحركات، ومكعب فلتر بمحركات. أيضا، يجب أن تدرك أن التركيز المثالي قد لا يضمن جودة الصورة مرضية. نقترح استخدام برنامج التصوير الذي يسمح بالحصول على صورة متعددة الأبعاد والبرنامج النصي للتصوير المخصص. يمكن أن يكون الحفاظ على الصور مركزة بشكل جيد أمرًا دوريًا (كل 24 ساعة أو 48 ساعة) لتركيز تلقائي، مما أدى إلى إنشاء سطح تركيز مخصص أثناء دورة الحصول على الصور.

وقد تم تنفيذ التكنولوجيا EA microfluidic المقدمة لدراسة ديناميات التكيف والتطور في خلايا سرطان البروستاتا metapopulations تحت المناظر الطبيعية الإجهاد العلاج الكيميائي12. وقد أظهرنا أيضا ظهور الخلايا السرطانية العملاقة متعددة الشابهين المقاومة للأدوية في هذه البيئة الدقيقة غير المتجانسة الشبيهة بالورم، مما يدل على أن التغاير البيئي جنبا إلى جنب مع هجرة الخلايا داخل السكان الورم من شأنه أن يسبب التضخيم على ظهور الأنماط الظاهرية المقاومة13. مع القدرة على التحكم في ومراقبة سلوكيات مجموعات الخلايا السرطانية المختلطة تحت تدرجات الإجهاد التي تسيطر عليها بشكل جيد، قد تعمل تقنية EA microfluidic أيضًا كمنصة لدراسة الآليات التنظيمية والتحول الفينوتيالي الذي ينطوي عليه EMT في سياق الاستراتيجيات العلاجية للسرطان21. وأخيراً وليس آخراً، يمكن أيضاً تنفيذ طريقة التعبئة والتغليف المعروضة لختم الضغط في نظم ميكروفلويديك الأخرى التي تتطلب إجراء تعديل متطور لتكوين الغاز المحيط فضلاً عن قدرات التجربة في المصب. على سبيل المثال، تم استخدام نفس طريقة التعبئة والتغليف لدمج نمط microfluidic مختلفة لدراسة كيفية انتشار موجات السكان البكتيرية من خلال الحواجز المادية22.

وباختصار، تختلف الديناميات السكانية الجماعية نوعياً عن سلوكيات الخلية الواحدة. تسمح تقنية EA الميكروfluidic بالدراسة الكمية للديناميات التطورية والسلوكيات الفينوتية بشكل فردي وجماعي كدالة للوقت. قد تقدم هذه التكنولوجيا نموذج ًا أكثر أهمية من الناحية الفسيولوجية في المختبر لبحوث السرطان، وربما لتطوير الأدوية قبل السريرية وفحصها.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

لم يعلن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

وقد تم دعم هذا العمل من قبل NSF PHY-1659940.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 mL BD Luer-Lok tip syringes BD 14-823-16E
Antibiotic-Antimycotic Sigma-Aldrich A5955 1x anti-anti
AZ 300 MIF Merck KGaA 18441123163 Photoresist developer
AZ1518 Merck KGaA AZ1518 Photoresist
AZ4330 Merck KGaA AZ4330 Photoresist
Cr Chromium Etchant Sigma-Aldrich 651826
Fetal bovine serum (FBS) Life Technologies Corporation 10437028
Heidelberg DWL 66+ laserwriter Heidelberg Instruments DWL66+ Writing photomask
Hexamethyldisilazane (HMDS) Sigma-Aldrich 379212 For photoresist adhesion enhancement
Hollow steel pins New England Small Tube NE-1300-01  .025 OD .017 ID x .500 long / type 304 WD fullhard
ibidi Heating System, Multi-Well Plates, K-Frame ibidi 10929 On-stage incubator 
Luer-Lok 23 G dispensing needle McMaster-Carr 75165A684 To connect syringes and tubings
Lumox dish 35 Sarstedt 94.6077.331 Gas-permeable cell culture dish
Microposit Remover 1165 Dow Electronic Materials Microposit Remover 1165 Photoresist stripper
Microseal B Adhesive Sealer Bio-Rad Laboratories MSB1001 Adhesive sealer
O-Ring (for Lumox plate sealing) McMaster-Carr 9452K114 Dash No. 27; 1-5/16" ID x 1-7/16" OD; Duro 70
O-Ring (for bottom glass window sealing) McMaster-Carr 9452K74 Dash No. 20; 7/8" ID x 1" OD; Duro 70
Plasma-Preen Plasma Cleaning/Etching System Plasmatic Systems, Inc Plasma-Preen Oxygen plasma system
RPMI 1640 Life Technologies Corporation 11875-093
Samco RIE800iPB DRIE Samco RIE800iPB Deep reactive-ion etching system
Suss MA6 mask aligner SUSS MicroTec MA6 Mask aligner 
Sylgard 184 Silicone Elastomer Fisher Scientific NC9285739 PDMS elastomer
TePla M4L plasma etcher PVA TePla M4L Plasma etcher
Trichloro-1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl-silane (PFOTS) Sigma-Aldrich 448931 For silicon wafer silanization
Tygon microbore tube (0.020" x 0.060"OD) Cole-Parmer EW-06419-01 Tubings for media delivery

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Meacham, C. E., Morrison, S. J. Tumour heterogeneity and cancer cell plasticity. Nature. 501 (7467), 328-337 (2013).
  2. Whiteside, T. L. The tumor microenvironment and its role in promoting tumor growth. Oncogene. 27 (45), 5904-5912 (2008).
  3. Lambert, G., et al. An analogy between the evolution of drug resistance in bacterial communities and malignant tissues. Nature Reviews Cancer. 11 (5), 375-382 (2011).
  4. Tannock, I. F., Lee, C. M., Tunggal, J. K., Cowan, D. S., Egorin, M. J. Limited penetration of anticancer drugs through tumor tissue: a potential cause of resistance of solid tumors to chemotherapy. Clinical Cancer Research. 8 (3), 878-884 (2002).
  5. Grantab, R. H., Tannock, I. F. Penetration of anticancer drugs through tumour tissue as a function of cellular packing density and interstitial fluid pressure and its modification by bortezomib. BMC Cancer. 12, 214 (2012).
  6. Fu, F., Nowak, M. A., Bonhoeffer, S. Spatial Heterogeneity in Drug Concentrations Can Facilitate the Emergence of Resistance to Cancer Therapy. PLoS Computational Biology. 11 (3), e1004142 (2015).
  7. Bogorad, M. I., et al. In vitro microvessel models. Lab on a Chip. 15 (22), 4242-4255 (2015).
  8. Caballero, D., et al. Organ-on-chip models of cancer metastasis for future personalized medicine: From chip to the patient. Biomaterials. 149, 98-115 (2017).
  9. Caballero, D., Blackburn, S. M., De Pablo, M., Samitier, J., Albertazzi, L. Tumour-vessel-on-a-chip models for drug delivery. Lab on a Chip. 17 (22), 3760-3771 (2017).
  10. Zhang, Q., et al. Acceleration of emergence of bacterial antibiotic resistance in connected microenvironments. Science. 333 (6050), 1764-1767 (2011).
  11. Wu, A., et al. Ancient hot and cold genes and chemotherapy resistance emergence. Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (33), 10467-10472 (2015).
  12. Lin, K. C., et al. Epithelial and mesenchymal prostate cancer cell population dynamics on a complex drug landscape. Convergent Science Physical Oncology. 3 (4), 045001 (2017).
  13. Lin, K. C., et al. The role of heterogeneous environment and docetaxel gradient in the emergence of polyploid, mesenchymal and resistant prostate cancer cells. Clinical & Experimental Metastasis. 36 (2), 97-108 (2019).
  14. Roca, H., et al. Transcription factors OVOL1 and OVOL2 induce the mesenchymal to epithelial transition in human cancer. PloS One. 8 (10), e76773 (2013).
  15. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  16. Tinevez, J. Y., et al. Trackmate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
  17. Caballero, D., et al. Organ-on-chip models of cancer metastasis for future personalized medicine: From chip to the patient. Biomaterials. 149, 98-115 (2017).
  18. Akhtar, A. The flaws and human harms of animal experimentation. Cambridge Quarterly of Healthcare Ethics. 24 (4), 407-419 (2015).
  19. Sontheimer-Phelps, A., Hassell, B. A., Ingber, D. E. Modelling cancer in microfluidic human organs-on-chips. Nature Reviews Cancer. 19 (2), 65-81 (2019).
  20. Bogorad, M. I., DeStefano, J., Karlsson, J., Wong, A. D., Gerecht, S., Searson, P. C. Review: in vitro microvessel models. Lab on a Chip. 15, 4242-4255 (2015).
  21. Zañudo, J. G. T., et al. Towards control of cellular decision-making networks in the epithelial-to-mesenchymal transition. Physical Biology. 16 (3), 031002 (2019).
  22. Morris, R. J., et al. Bacterial population solitary waves can defeat rings of funnels. New Journal of Physics. 19 (3), 035002 (2017).

Tags

الهندسة الحيوية، العدد 151، التصنيع الدقيق، السرطان على رقاقة، البيئة الدقيقة الورم، تدرج العلاج الكيميائي، المقاومة، هجرة الخلايا
توليد التدرجات المخدرات غير متجانسة عبر السكان السرطان على مسرّع تطور Microfluidic للمراقبة في الوقت الحقيقي
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lin, K. C., Torga, G., Sun, Y.,… More

Lin, K. C., Torga, G., Sun, Y., Pienta, K. J., Sturm, J. C., Austin, R. H. Generation of Heterogeneous Drug Gradients Across Cancer Populations on a Microfluidic Evolution Accelerator for Real-Time Observation. J. Vis. Exp. (151), e60185, doi:10.3791/60185 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter