Summary
Nós apresentamos um modelo microfluídicos do cancer-em-microplaqueta, a tecnologia do "acelerador evolução", que fornece uma plataforma controlável para estudos quantitativos em tempo real a longo prazo da dinâmica do cancro dentro das condições ambientais bem definidas no único-Cell Nível. Espera-se que esta tecnologia funcione como um modelo in vitro para pesquisa fundamental ou desenvolvimento de fármacos pré-clínicos.
Abstract
A cultura celular convencional continua sendo o modelo pré-clínico mais freqüentemente utilizado, apesar de sua comprovada capacidade limitada de prever resultados clínicos em câncer. Modelos de câncer microfluídico em chip têm sido propostos para colmatar a lacuna entre as culturas 2D convencionais supersimplificadas e modelos animais mais complicados, que têm capacidade limitada para produzir resultados quantitativos confiáveis e reprodutíveis. Aqui, nós apresentamos um modelo microfluídicos do cancer-em-microplaqueta que reproduz componentes chaves de um microambiente complexo do tumor em uma maneira detalhada, contudo é simples bastante fornecer descrições quantitativas robustas da dinâmica do cancro. Este modelo microfluídico de câncer em chip, o "Evolution Accelerator", divide uma grande população de células cancerosas em uma matriz interconectada de microambientes tumorais, gerando uma paisagem de estresse quimioterápico heterogêneo. A progressão e a dinâmica evolutiva do câncer em resposta ao gradiente de drogas podem ser monitoradas por semanas em tempo real, e inúmeros experimentos a jusante podem ser realizados de forma complementar às imagens de lapso de tempo tiradas no decorrer dos experimentos.
Introduction
O câncer tem sido cada vez mais reconhecido como um ecossistema complexo que depende não só da continuação da desregulação das populações de células mutadas, mas também de interações vitais entre as células cancerosas e o microambiente hospedeiro. Nesse sentido, o câncer evolui em uma paisagem adaptativa manifestada por uma combinação de fatores, incluindo um microambiente de tumor heterogêneo e conversa cruzada com uma variedade de células hospedeiras, todas as quais contribuem com pressões seletivas para mais genética ou alterações epigenéticas1,2,3. No contexto de tumores sólidos, a distribuição desigual de quimioterápicos e outros gradientes de recursos contribui para sua heterogeneidade molecular e pode desempenhar um papel no desenvolvimento da resistência a fármacos, aumento da angiogênese para o tumor particular subpopulações e até mesmo metástase4,5,6. Estudos de cultura de células 2D convencionais in vitro, possuindo capacidade experimental de grande escala e conveniente, proporcionam condições de campo médio, uniformes e fixas, muitas vezes faltando o controle ambiental preciso e espacial necessário para realmente emular a dinâmica tumoral in vivo. Assim, há a necessidade de modelos ex vivo mais representativos para reproduzir o microambiente tumoral antes dos modelos animais no pipeline de desenvolvimento de fármacos para uma melhor predição da progressão do câncer, bem como respostas a drogas dentro do estresse dinâmico Paisagens. Microfluínicos têm sido propostos para colmatar a lacuna entre estudos de cultura de células 2D e estudos em animais mais complexos in vivo que podem não ser capazes de suportar estudos quantitativos verificáveis7,8,9.
Um sistema in vitro ideal para caracterizar a dinâmica das células cancerosas deve possuir a capacidade de gerar um microambiente heterogêneo para imitar as respostas celulares adaptativas que podem ocorrer em um tumor, bem como permitir a observação dessas dinâmicas em um resolução de uma única célula. Neste artigo, descrevemos uma plataforma de cultura de células microfluídico, um dispositivo baseado em PDMS chamado "Evolution Accelerator" (EA), que permite estudos paralelos in vitro de dinâmicas de células cancerosas em resolução celular com aquisição de dados em tempo real sobre o curso de semanas, enquanto mantendo estavelmente gradientes de stress em toda a paisagem da cultura. O projeto desta plataforma é baseado em nosso trabalho precedente, em que a dinâmica evolutiva dos organismos em um metapopulação pode ser acelerada10,11. Especificamente, em um grupo de populações espacialmente separadas que interagem em algum nível, quando expostos a uma paisagem de estresse heterogêneo, as espécies mais aptos podem dominar em uma população local mais rapidamente em comparação com a de uma grande população uniforme. As espécies vantajosas então migram para os microhabitats vizinhos em busca de recursos e espaço, e eventualmente dominam toda a população. Como mostrado na Figura 1, o padrão do chip microfluídico ea é composto de (i) um par de canais serpentinos que fornecem circulação de mídia fresca e constroem condições de contorno fixo para difusão química, e (II) a região de cultura de células hexagonais que consiste em 109 câmaras sextavadas e 24 meio-hexagonais interconectadas no centro, assemelhando-se a uma estrutura alveolar. O chip é de 100 μm em profundidade. Os canais de mídia e a região da cultura celular estão conectados com pequenas fendas (cerca de 15 μm de largura), que impedem o fluxo direto de mídia e o estresse de cisalhamento resultante em toda a área de cultura celular, mas ainda permitem que os produtos químicos se difundem através de pequenas fendas e trocam nutrientes, resíduos metabólicos, etc. A geração de gradientes químicos é demonstrada na Figura 1B, onde um canal de mídia contém 0,1 mm de fluoresceina, enquanto o outro canal está livre de fluoresceina. As pilhas são cultivadas em uma membrana permeável do gás, encapsulada pelas microestruturas com a pressão traseira positiva na membrana de encontro à microplaqueta. Os componentes do suporte do dispositivo são ilustrados na Figura 2, e a configuração experimental é ilustrada na Figura 3, onde a cultura é mantida em um microscópio invertido a 37 ° c, com acima de 85% de umidade relativa, e condicionada composição do gás normóxia.
Este sistema fornece a observação detalhada de interações celulares localizadas através do brightfield e de canaletas fluorescentes e permite os ensaios a jusante espacialmente-resolvidos tais como a imunofluorescência, o borrão ocidental, ou a espectrometria maciça. Nós demonstramos previamente como uma prova--princípio deste modelo microfluídicos do cancer-em-microplaqueta na cocultura a longo prazo de pilhas epithelial e mesenquimais do cancro da próstata PC312 assim como o emergence do gigante poliplóides da droga-resistência células cancerosas usando a linha celular PC3 epitelial13. Quando nós apresentamos a aplicação desta plataforma para compreender a dinâmica armazenamento de PC3 epithelial e de pilhas mesenquimais do cancro da próstata um inclinação do stress de docetaxel, o sistema microfluídicos pode facilmente ser aplicado a toda a combinação de linhas de pilha e recursos (i.e., drogas, nutrientes, oxigênio) gradientes.
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Protocol
1. fabricação de microfluídico dispositivo
- Gere o padrão microfluídico desejado usando um software de design de layout (consulte materiais complementares).
- Fabricar a máscara fotográfica. Consulte tabela de materiais para obter mais detalhes.
- Utilizando um gravador de laser, escreva o padrão em uma placa de vidro de soda-cal revestida com 100 nm de CR e 500 nm de fotororesista AZ1518.
- Desenvolva o fotoresistente com o colaborador AZ300MIF para 60 s.
- Etch afastado o cromo sem proteção do fotoresistente usando CR-7 Chromium Etchant.
- Descasque fora o fotoresistente residual usando um descascador do fotoresistente em 70 ° c por 45 minutos.
- Teste padrão o photoresist. Consulte tabela de materiais para obter mais detalhes.
- Spin Coat HMDS em wafer de silício a 4000 rpm por 40 s.
- Spin Coat fotoresistente AZ4330 em wafer de silício a 4000 rpm por 40 s.
- Soft cozer a bolacha de silício a 95 ° c por 60 s.
- Utilize o alinhador da máscara para expor o UV à bolacha do silicone.
- Desenvolva o fotoresistente com o colaborador AZ300MIF por 4 minutos.
- Execute a gravura DRIE. Consulte tabela de materiais para obter mais detalhes.
- Seque-grave a bolacha modelada com o fotoresistente usando um sistema de Etching reactivo do íon do silício (Drie) para a profundidade de 100 μm.
- Descasque fora o fotoresistente com acetona e o plasma etch com um etcher do plasma.
- Oxidação e silanization da bolacha. Consulte tabela de materiais para obter mais detalhes.
- Realize a oxidação térmica no wafer de silício gravado em um forno a 1100 ° c por 1 h.
- Aguarde até que a bolacha de silício esfrie e, em seguida, coloque o wafer em um dessecador com algumas gotas de tricloro-1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl-silano (PFOTS) gotejados em um pequeno recipiente perto da bolacha.
- Bombeie a pressão do exsicador a 0,5 ATM na temperatura ambiente por 60 minutos. O molde da bolacha do silicone deve tornar-se hydrofóbico após o silanization apropriado, que pode ser testado adicionando diversas gotas da água no Wafer.
- Litografia suave. Consulte tabela de materiais para obter mais detalhes.
- Misture o pre-polímero e o cross-linker (do jogo do polimetilsiloxano (PDMS) em um 10:1 pela relação do peso.
- Despeje o PDMS misto para criar um filme de 10 mm de altura sobre o molde de wafer de silício SILANIZADOS.
- Degas o sistema de Wafer PDMS-silício resultante em um dessecador por 30 min a 1 h.
- Incubar a bolacha do PDMS-silicone em uma incubadora de 70 ° c durante a noite para curar o PDMS.
- Uma vez que o PDMS é curado, descasque a película de PDMS fora da bolacha do silicone com cuidado.
- Usando agulhas da biópsia, perfurar através-furos nas portas de entrada baseadas na posição do teste padrão no PDMS e empregar um perfurador circular para cortar microplaquetas 27 milímetros no diâmetro.
- Colagem da camada de PDMS.
- Cura de calor duas pilhas de cilindros PDMS de 27 mm (sem padronização), que se tornará a camada de reservatório e a camada tampando do dispositivo.
- Corte dois círculos de 7 milímetros em torno das entradas na camada do reservatório, e utilize uma agulha da biópsia para perfurar através-furos nas portas de entrada na camada tampando.
- Bond três pilhas de PDMS (pilha modelada, camada do reservatório, camada tampando) com tratamento do plasma do oxigênio.
- Com a agulha da biópsia, perfure através-furos nas tomadas e na porta Center do dispositivo.
2. mídia e linha de célula de preparação
- Prepare mídia para a cultura de linhas de células PC3, incluindo PC3-EMT e PC3-EPI: Misture o meio RPMI 1640 com soro bovino fetal a 10% (FBS) e 1x antibiótico-Antimicótico. Gere linhas de célula como descrito anteriormente14.
Nota: as linhas celulares PC3 são mantidas na mídia acima em incubadoras humidificadas a 37 ° c com 5% de CO2. Divida as células e subcultura a cada 3 dias, antes de atingirem 100% de confluência. - As linhas celulares do transfect com marcadores fluorescentes citoplasmáticos rotulados para melhor visualização, como descrito anteriormente12, tal que PC3-EMT expressa GFP citoplasmático e PC3-EPI expressa mcherry citoplasmática. Note-se que a tecnologia também é compatível com quaisquer células fluorescentes-rotuladas, bem como imagem brightfield de células sem rótulo.
3. configuração experimental
- Fabricação do suporte da placa de metal
- Fabricar um suporte da placa que seja suficiente para prender pratos de cultura gás-permeáveis simultâneos para experimentos paralelos fazendo à máquina ou à impressão 3D. O arquivo CAD 3D ("placa de 3 poços. FCStd ") pode ser encontrado no GitHub como uma referência (https://github.com/kechihl/3-well-plate).
- Desaparafuse os componentes do suporte (Figura 2) com uma chave de fenda. Desinfete os componentes através da exposição UV durante pelo menos 1 h e deixe-o num ambiente estéril.
Nota: o suporte é projetado para fornecer condições substanciais para o equilíbrio térmico e composições de gás ideal, com entradas de canal de gás que permitem o fluxo de ar. Mais detalhes podem ser encontrados em nosso trabalho anterior12. - Prepare até três pratos de cultura permeáveis a gás, dos quais a membrana de cultura celular é relativamente flexível.
- Propagação da linha celular
- 24 horas antes do início do experimento, colheita de células PC3-EPI e PC3-EMT por tripsinização por 5 min. Adicionar meios de cultura pré-aquecido, em seguida, centrifugar a 150 x g por 3 min e descartar o sobrenadante.
- Células de contagem de cada PC3-EPI e PC3-EMT usando um hemocitômetro e isolar um total de 2,5 x 104 de cada tipo de célula para cada gás-permeável cultura prato.
- Misture e ressuscite os dois tipos de células em 2 mL de meios de cultura e semente as células em cada um dos gás-permeável cultura prato.
- Deixe todo o suporte da placa na incubadora durante a noite para que as células se fixem.
- Desinfecte os dispositivos PDMS através de exposição UV por pelo menos 1 h e deixe em um ambiente estéril.
- Configurando unidade de controle térmico e sistema de abastecimento de gás
- Como mostrado na Figura 3, configurar um sistema de abastecimento de gás que consiste em ambas as unidades de controle co2 e O2 , uma bomba de gás, uma câmara de mistura de gás, um humidificador ou um borbulhador, e três conjuntos separados de válvulas de gás e medidores de pressão. Mais detalhes podem ser encontrados em nosso trabalho anterior12.
- Configure as unidades de controle CO2 e o2 de forma que ajustem a taxa de mistura do gás dos tanques co2 e N2 e da fonte o2 . Alternativamente, qualquer sistema de abastecimento de gás que fornece gás condição de normóxia funcionaria.
- Certifique-se que o gás que é combinado na câmara de mistura e humidificado por um Bubbler tal que a umidade relativa é aumentada até 85% (como lido para fora de um monitor da umidade relativa) e que o gás conduz a três válvulas de gás independentes com calibres de pressão a fim controle e monitore o caudal de gás no suporte da placa.
- Coloque todo o suporte da placa numa unidade de controlo térmico de incubação no palco com subunidades de aquecimento separadas para a tampa e a placa inferior, com todas as unidades situadas a 37 ° c. Consulte tabela de materiais para obter mais detalhes.
- Instalação de dispositivo microfluídico. Consulte tabela de materiais para obter mais detalhes.
- Identifique que os componentes detalhados do suporte da placa de 3 poços estão em ordem, como na Figura 2. Cada um dos três poços são idênticos e independentes, com um par de canais de gás para cada poço. Cada poço possui um suporte gás-permeável do prato da cultura, um suporte da microplaqueta de PDMS, um suporte de vidro da janela, e um par de janelas de vidro de 35 milímetros. Estes componentes podem ser montados usando os parafusos ajustados.
Nota: as janelas de vidro asseguram-se de que haja um espaço termicamente isolado entre a membrana da cultura gás-permeável e o poço tal que nenhuma condensação da água ocorre devido às diferenças da temperatura na relação. Note que os 3 poços são independentes, e 3 experimentos podem ser feitos separadamente. - Meio de cultura pré-aquecido a 37 ° c e Degas em câmara de vácuo por 20 min.
- Trate os chips PDMS usando um sistema de plasma de oxigênio para 30 s, a fim de manter a hidrofilicidade.
- Configure o sistema da seringa. Carregue duas seringas lentamente com meios de crescimento e outras duas seringas com reagente de interesse desejado (meios de comunicação, meios de comunicação com drogas, etc.). Conecte cada seringa individual a uma tubulação de 50 cm (0, 20 "x 0.060" OD) por uma agulha de distribuição de 23 G em um pino de aço oco. Insira um pino de aço oco na outra extremidade da tubulação.
- Prime a tubagem e insere o pino de aço em cada chip PDMS através da camada de nivelamento. Encha acima a camada do reservatório e molhe o teste padrão da camada do teste padrão de PDMS com meios. A camada do reservatório trabalha como uma armadilha da bolha da em-microplaqueta para impedir que as bolhas de ar começ no teste padrão microfluídicos.
- Carregue uma seringa de 1 mL com meios de cultura. Conecte a seringa a uma tubulação de 5 cm (0, 20 "x 0.060" OD) por uma agulha de distribuição de 23 G em um pino de aço oco. Insira um pino de aço oco na outra extremidade da tubagem e prima a tubagem.
- Insira o pino de aço oco no furo central da microplaqueta, onde os meios excessivos podem ser extraídos para fora da microplaqueta mais tarde durante o processo da selagem da microplaqueta.
- Como cada dispositivo PDMS requer 4 10 mL seringas carregadas em uma bomba de seringa, carga 2 10 mL seringas por chip na plataforma para a frente. Coloque as duas outras seringas na plataforma de retirada do sistema da seringa.
- Coloque o chip diretamente no topo das membranas de cultura permeável a gás (com células já aderiram às membranas). A fim de evitar a entrada de microbolhas no padrão microfluídico, dispensar 1 mL de meios pré-aquecidos e desgaseificados no prato de cultura de gás permeável de 35 mm antes da montagem e, em seguida, certifique-se de que o chip se aproxima da superfície líquida com um ângulo de inclinação de 15 graus.
- Prenda o prato gás-permeável da cultura e o poço no suporte gás-permeável do prato da cultura para cada microplaqueta, com o suporte de microplaqueta de PDMS que empurra o dispositivo de PDMS para baixo.
- Tape uma folha de um aferidor na parte superior do dispositivo PDMS e braçadeira com o suporte de chip PDMS, a fim de evitar que o chip de secar.
- Defina a taxa de fluxo de mídia ao redor da matriz para 20 μL/h.
- Ajuste a placa inteira na incubadora do em-estágio na fase motorizada de um microscópio invertido. Conecte o sistema de fornecimento de gás aos canais de gás e pressurizando a membrana de cultura permeável a gás contra o chip PDMS instalado para garantir a vedação do dispositivo. Mantenha a pressão do calibre em 0,2 libras por polegada quadrada (1,4 x 104 PA).
- Extraia lentamente a mídia excessiva no chip usando a seringa de 1 mL do orifício central. Observe o chip o microscópio durante a extração de mídia e, em seguida, parar de extrair quando o chip é selado. A selagem da microplaqueta deve ser óbvia desde que uma parte das pilhas seria esmagada pelas microestruturas.
- Ligue a unidade de detecção de temperatura da incubadora no palco à placa de 3 poços e defina a 37 ° c.
- Identifique que os componentes detalhados do suporte da placa de 3 poços estão em ordem, como na Figura 2. Cada um dos três poços são idênticos e independentes, com um par de canais de gás para cada poço. Cada poço possui um suporte gás-permeável do prato da cultura, um suporte da microplaqueta de PDMS, um suporte de vidro da janela, e um par de janelas de vidro de 35 milímetros. Estes componentes podem ser montados usando os parafusos ajustados.
4. imagem de lapso de tempo de célula única
- Configurar software de imagem utilizando um microscópio invertido para aquisição de imagens de lapso de tempo. Observe que um microscópio fluorescente invertido com estágio x-y totalmente motorizado, botão de foco, obturador e cubos de filtro é necessário para uma experiência de EA.
- Configure o software para adquirir imagens em dois canais com ampliação de 10x para cada chip com costura automática de imagem após uma rodada de autofoco. Esteja ciente de que os sistemas de correção automática como o foco perfeito não garantem qualidade de imagem satisfatória. É mais recomendável gerar uma superfície de foco personalizada para aquisição de imagem de longo prazo com base em foco automático ou focagem manual em todo o chip.
- Tire imagens a cada hora e deixe a experiência em execução na escala de tempo de semanas. Monitore a qualidade da imagem em uma base diária e atualize a superfície de foco, se necessário.
- Prepare a microplaqueta de PDMS e o prato gás-permeável da cultura para a análise imunofluorescente subseqüente, como descrito previamente13.
5. processamento e análise de imagens
- Processamento pós-experimental
- Converta imagens em formato TIFF para processamento de imagem e medições utilizando Fiji/ImageJ.
- Compacte arquivos TIFF para facilitar o processamento de imagens.
- Análise de Fiji/ImageJ
- Para identificar células, realize subtração de fundo e análise de partículas para identificar pontos brilhantes fluorescentes para detecção de localização de células e contagem automática de células.
- Utilize plugins (rastreamento manual, quimiotaxia, ferramenta de migração, Trackmate) para analisar a motilidade celular e a migração.
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Representative Results
Validação do crescimento celular ideal no chip
Um dos principais objetivos da plataforma experimental é reproduzir os principais componentes e interações em um microambiente de tumor complexo de forma abrangente, mas simples o suficiente para fornecer dados quantitativos, confiáveis e reprodutíveis. Este objetivo só pode ser alcançado se tivermos controle total dos fatores ambientais físicos e bioquímicos. Devemos excluir os fatores indesejados ou descobrir uma maneira de incorporar os fatores incontroláveis no modelo quantitativo para interpretar corretamente os comportamentos populacionais.
O primeiro teste é assegurar o crescimento ideal da pilha no dispositivo. A taxa de proliferação celular no dispositivo precisa ser idêntica ou comparável ao seu perfil de crescimento na cultura celular convencional. Como uma prova do princípio, as pilhas humanas do cancro de próstata da linha de célula PC3 foram cultivadas na microplaqueta de PDMS sem a presença de esforço externo. Estas pilhas foram etiquetadas fluorescently no citoplasma assim que nós poderíamos observar e quantificar a população das pilhas usando a microscopia fluorescente invertida. A confluência de células, definida como a área coberta por células, foi medida em cada microhabitat em diferentes períodos de tempo, dado um limiar de intensidade selecionado nas imagens fluorescentes usando Fiji15. As curvas de crescimento das células em cada posição escolhida são plotadas na Figura 4. As posições escolhidas são espalhadas através do chip, da região perto do ápice da entrada de mídia para o ápice perto de meios de comunicação.
As curvas de crescimento na Figura 4B são bem alinhadas, sugerindo a identicalidade do perfil de proliferação celular em função da posição em todo o chip. A inclinação inicial das curvas revela a taxa de proliferação. O tempo de duplicação para as células no dispositivo é de cerca de 24 horas, como mostrado na Figura 4B do tempo de 0 a 24 horas, que é o mesmo que o tempo de duplicação no no convencional13. Conclui-se, portanto, que sem a presença de uma fonte externa de estresse, os fatores físicos e bioquímicos são uniformemente distribuídos, levando ao crescimento celular homogêneo e otimizado do tempo 50 para 100 horas.
Consideramos ainda a capacidade de quantificar a dinâmica celular entre as subpopulações em um microambiente. A GFP-expressando PC3-EMT e as linhagens de células PC3-EPI expressadas por mCherry foram cocultivadas no EA, como mostra a Figura 5. A confluência celular, definida como a porcentagem de área coberta pelas células, é medida como a indicação do tamanho da população. Partindo de 40% confluência, a cocultura cresceu totalmente confluente dentro de 3 dias. Curiosamente, podemos observar a progressão de cada fenótipo no microambiente. Enquanto a curva de crescimento da confluência total é na forma de modelo de crescimento logístico, a população de PC3-EMT continuou a se expandir e PC3-EPI foi suprimida na fase assíptica.
Demonstração do ensaio de motilidade celular em uma população mista
A motilidade celular é um importante comportamento fenotípico. A distribuição da motilidade de uma população pode fornecer informações sobre a interação física das células, as propriedades mecânicas do microambiente local e, às vezes, pode ser analisada como uma indicação de variação epigenética das células. Dado que nossa plataforma melhorada da cultura de pilha permite a imagem latente quase contínua, a vantagem de ter a definição temporal fina maximiza o potencial do único seguimento da pilha em uma população heterogênea.
Nós usamos o plugin TrackMate16 em Fiji (http://Fiji.SC) com macro personalizado para implementar e automatizar o processo de rastreamento. TrackMate permite ao usuário implementar e personalizar um algoritmo de rastreamento usando uma linguagem de script do editor de scripts Fiji. O processo de rastreamento é dividido em uma série de etapas: os processos de segmentação, filtragem e vinculação de partículas.
Como mostrado na Figura 6B, realizamos um "ensaio de cicatrização de feridas" como uma demonstração para estudar a migração coletiva de células e a interação célula-célula. As células PC3-EPI e PC3-EMT foram densamente semeadas no centro do dispositivo e foram autorizadas a migrar livremente para a região vazia. O histograma normalizado da velocidade de ambos os fenótipos é plotado na Figura 6C. A velocidade de PC3-EMT era significativamente mais elevada do que PC3-EPI por um fator de 1.8 x, que seja consistente com o fato de que o phenotype mesenquimais sere como um componente da cura Cutaneous da ferida com habilidade excepcional de migrar ao contrário do comparàvel fenótipo epitelial estacionário.
Além disso, a fim de observar a progressão da motilidade celular em um ambiente livre de estresse, realizamos uma cocultura de longo prazo de PC3-EPI e PC3-EMT com densidade de semeadura inicial uniforme e rastreamos a distribuição da velocidade celular variando com o tempo. Como mostrado na Figura 7A, B, após 6 dias de cultura, à medida que as células atingiram maior confluência, as distribuições de velocidade celular para ambos os fenótipos inclinaram-se para as caudas esquerdas.
Nós podemos comparar a relação do número de PC3-EPI a PC3-EMT em cada intervalo da classe. Como mostrado na Figura 7C, independentemente dos dias de cultura ou densidade das células, o PC3-EMT dominou a região de alta velocidade, enquanto o PC3-EPI ocupou a zona de baixa velocidade. Embora a velocidade total diminuiu significativamente para ambos os phenotypes, PC3-EMT permaneceu motile e foi afetada menos pela multidões do microambiente como mostrado na Figura 7D. A velocidade média de PC3-EPI caiu em torno de 40%, enquanto que a de PC3-EMT só caiu 14%.
Existem vários fatores que podem afetar a distribuição da velocidade da célula e a média das velocidades, como a multidões da população. O rastreamento e monitoramento contínuo da célula sobre toda a subpopulação é essencial para compreender a progressão do comportamento fenotípico. Por exemplo, se gostaríamos de quantificar o nível do status mesenquimais de uma subpopulação sem rótulo, seria mais informativo adquirir não apenas a distribuição da quantidade física (por exemplo, velocidade) da subpopulação interessada em função do tempo, mas também a de todo o resto da subpopulação coexistente de células.
Figura 1: a microplaqueta microfluídico da ea da seringa-bomba-conduzida. (A) o dispositivo microfluídico tem duas entradas médias separadas, duas tomadas e uma porta central para a semeadura de células ou extração de meio excessivo. Note-se que entre as entradas médias e as matrizes de cultura de células, um par de canais serpentina que permitem que o meio para equilibrar com a atmosfera passou abaixo da membrana permeável a gás. (B) a geração de gradiente. As seringas bombeiam o meio com ~ 0,1 milímetros da fluoresceina e nenhuma fluoresceína respectivamente na microplaqueta através das 2 entradas médias na direita, extraído para fora da microplaqueta nas 2 tomadas médias na esquerda. A concentração de fluoresceina é proporcional à intensidade do sinal de fluorescência, e é perfilada perto das entradas/saídas médias a e perto do centro b. figura reproduzida com permissão de Lin et al. 201712. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: os componentes da placa de amostra personalizada de 3 poços. (a) o corpo principal de 3 placas de poço; (b) um par de canais de gás que permitem a atmosfera condicionada a ser bombeado e exalado através dos septos na entrada dos canais de gás; (c) um anel-o projetado selar o espaço entre a placa do poço e o prato gás-permeável da cultura; d) o prato de cultura permeável a gás de 35 mm de diâmetro; (e) o titular do prato; (f) o dispositivo PDMS; (g) os suportes de chip PDMS; (h) as janelas de vidro da camada dobro 35 milímetro projetadas manter o isolamento térmico e impedir a condensação da água; (i) porta janela de vidro; (j) almofadas de aquecimento; (k) sensor de temperatura; (l) o aferidor adesivo que mantem a microplaqueta da secagem para fora. Figura reproduzida com permissão de Lin et al. 201712. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: a figura esquemática da configuração experimental. A configuração do experimento, incluindo o sistema de abastecimento de gás, conexão de canais de gás, a conexão de fornecimento médio e o sistema de imagem. Figura reproduzida com permissão de Lin et al. 201712. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: curvas de crescimento do PC3 no ea sem estresse. PC3 foram cultivados na EA sem a presença de estresse externo. (A) padrão da ea com rótulos de posição. (B) curvas de crescimento de PC3 nas posições escolhidas em termos de confluência celular. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: a cocultura de PC3-EPI e PC3-EMT no ea sem estresse. PC3-EPI (vermelho) e PC3-EMT (verde) foram cocultivados no EA sem a presença de estresse externo. (A) sobreposição de dois canais fluorescentes em t = 0 h. (B) imagem fluorescente tomada em t = 95 h. (C) curvas de crescimento em termos de confluência celular. A confluência celular de cada tipo de célula foi medida em todo o chip. Cada ponto de dados representa a confluência celular média em 3 pontos de tempo consecutivos tomados em intervalos de 15 min. As barras de erro representam o desvio padrão da confluência de células nos 3 pontos de tempo consecutivos. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: ensaio de motilidade celular em uma população mista. A demonstração do desempenho de rastreamento de célula única em uma população mista. (A) uma demonstração de como as células são detectadas pelo Laplaciano da segmentação gaussiana (log). Os círculos indicam o local das células detectadas pelo algoritmo LoG. As células detectadas são vinculadas de quadro a quadro com base no problema de atribuição linear para quantificar a motilidade celular. (B) o "ensaio de cicatrização de feridas" do experimento de COCULTURA PC3-EPI e PC3-EMT. As células foram semeadas localmente até 100% de confluência com um limite claro no centro. Após a instalação do chip EA, as células foram observadas para migrar através da matriz de microhabitat, conforme indicado pelas setas brancas. (C) histograma normalizado da motilidade celular. PC3-EMT é mais rápido do que PC3-EPI por um fator de 1,8 x. As barras de erro representam o desvio padrão de 5 amostras de experimento. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7: o ensaio de motilidade de uma cocultura de longo prazo de PC3-EPI e PC3-EMT. Uma cocultura A longo prazo de PC3-EPI e de PC3-EMT com densidade inicial uniforme da semeadura. A distribuição da velocidade da célula varia com o tempo. (A) distribuição normalizada da velocidade celular no 2º dia. (B) a distribuição normalizada da velocidade celular no 6º dia. (C) proporção do número de PC3-EPI para PC3-EMT em cada intervalo de classe. (D) velocidade média de PC3-EPI e PC3-EMT em função do tempo. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
A cultura celular convencional foi desenvolvida há quase um século e continua sendo o modelo pré-clínico mais freqüentemente utilizado na pesquisa biomédica, apesar de sua comprovada capacidade limitada de prever resultados clínicos no câncer17. Os modelos animais oferecem a maior relevância fisiológica e similaridade genética razoável para os seres humanos, mas há muito têm sido reconhecidos para ter limitações significativas na predição de resultados humanos18. Entre todos os modelos pré-clínicos existentes, os modelos microfluídico de câncer em chip parecem ser o candidato mais promissor para satisfazer a necessidade não atendida na pesquisa oncológica9,19,20. No entanto, os modelos atuais de câncer em chip ainda têm a oferecer uma plataforma que é capaz de reproduzir componentes-chave e interações para imitar um microambiente tumoral de uma forma abrangente, mas simples o suficiente para fornecer dados quantitativos confiáveis e reprodutíveis. Nossos dados representativos demonstram que nossa tecnologia microfluídicos da cultura da pilha fornece condições físicas e bioquímicas estáveis para a cultura de pilha a longo prazo em microambientes heterogêneos. Esta plataforma multifuncional permite o ajuste sofisticado de um gradiente químico dependente do tempo, bem como a composição de gás ambiente. A plataforma é portátil e compatível com a maioria dos microscópios invertidos fluorescentes para a imagem latente em tempo real de alta resolução, que oferece a informação multidimensional das pilhas em função do tempo, incluindo a morfologia da pilha, a dinâmica da população, a pilha motilidade e migração celular em um nível de célula única.
Comparado a nosso trabalho precedente11, nós anotamos que este empacotamento da pressão-selagem e o método do conjunto para nosso dispositivo microfluídicos permitem capacidades a jusante numerosas do experimento (por exemplo, FACS, extração local do metabolito, populações subclonal expansão, se, DNA/RNA FISH, etc.) complementar às imagens de lapso de tempo tiradas no decorrer dos experimentos. Esta capacidade de remover as células de locais específicos em uma cultura heterogénea é um avanço importante em comparação com dispositivos anteriores, onde a superfície de vedação para um chip teve que ser removida antes que se pudesse acessar a cultura11. Além disso, mesmo nesse caso, o ato de remover a cobertura perturbou significativamente a cultura para que o teste local de células em um único a poucos níveis de habitat não era possível. Tal extração localizada foi possível em nosso caso devido à natureza "resealable" macia da membrana gás-permeável flexível.
Existem várias etapas críticas no protocolo apresentado. Em primeiro lugar, para iniciar um experimento de longo prazo com dinâmica fluídico estável, microbolhas precisam ser evitados, tanto quanto possível. Portanto, é importante para pré-aquecer e Degas o meio de cultura (passo 3.4.2) antes de carregar a mídia para as seringas. A manipulação do carregamento e da distribuição dos meios deve ser feita lentamente e delicadamente para impedir a formação da bolha. O padrão PDMS deve ser tratado com plasma de oxigênio (etapa 3.4.3) antes de se conectar ao sistema de fornecimento de mídia de cultura. O tratamento do plasma do oxigênio assegura o Hidrofilia da superfície de PDMS e reduz significativamente a possibilidade de entrapping do de microbolhas. Na etapa 3.4.7., ao coloc a microplaqueta sobre a membrana da cultura da pilha, a microplaqueta de PDMS deve aproximar a superfície líquida com um ângulo de inclinação de 15 graus para começ livrado das bolhas (se alguma) na superfície líquida dentro do prato da cultura. Em segundo lugar, o método da pressão-selagem exige um sistema estável do abastecimento de gás que pressurize a membrana da cultura da pilha. A pressão deve ser ajustada entre 0,2 a 0,6 libras por polegada quadrada. Pressão inferior a 0,2 psi é insuficiente para vedação de cavacos. Acima de 1,2 psi, uma quantidade significativa de gás permeiam através da membrana e geram bolhas dentro do padrão microfluídico. Notamos que, se os componentes da placa metálica de 3 poços não forem montados corretamente (incluindo o corpo da placa, o suporte de prato de cultura permeável a gás, um suporte de chip PDMS, um suporte de janela de vidro, O-rings e um par de janelas de vidro de 35 mm), um identificaria o vazamento de gás como a leitura da pressão seria irresponsiva ao aumento do fluxo de gás. O problema de vazamento pode ser resolvido simplesmente fazendo um teste de vazamento e, em seguida, remontando os componentes.
A principal forma de dados adquiridos com a utilização da tecnologia EA é através de imagens. Como mencionado anteriormente, a tecnologia EA pode ser instalada em qualquer microscópio invertido. No entanto, para explorar plenamente as vantagens do sistema, é altamente recomendável instalar o sistema em um microscópio fluorescente invertido equipado com estágio x-y totalmente motorizado, botão de foco motorizado, obturador motorizado e cubo de filtro motorizado. Além disso, esteja ciente de que o foco perfeito pode não garantir a qualidade da imagem satisfatória. Sugerimos o uso de um software de imagem que permite aquisição de imagens multidimensionais e script de imagens personalizadas. Manter as imagens bem focalizadas pode ser desafiador sem um comando de autofoco periódico (a cada 24 horas ou 48 horas), que gerou uma superfície de foco personalizada durante o ciclo de aquisição de imagens.
A tecnologia de EA microfluídico apresentada foi implementada para estudar a dinâmica de adaptação e evolução em metapopulações de células cancerosas de próstata uma paisagem de estresse quimioterápico12. Nós igualmente demonstramos o emergence de pilhas de cancro gigantes poliplóides da droga-resistência neste tumor-como a microecologia heterogênea, mostrando que a heterogeneidade ambiental combinada com a migração da pilha dentro da população do tumor causaria a amplificação sobre o surgimento de fenótipos resistentes13. Com a capacidade de controlar e monitorar os comportamentos de populações de células tumorais mistas gradientes de estresse bem controlados, nossa tecnologia microfluídico EA também pode servir como uma plataforma para estudar mecanismos regulatórios e a transformação fenotípica envolvida na EMT no contexto de estratégias terapêuticas de câncer21. Por último, mas não menos importante, o método de empacotamento de vedação de pressão apresentado também pode ser implementado em outros sistemas microfluílicos que exigem o ajuste sofisticado da composição do gás ambiente, bem como as capacidades de experimento a jusante. Por exemplo, o mesmo método de embalagem foi utilizado para incorporar diferentes padrões microfluílicos para estudar como as ondas populacionais bacterianas se propagam através de barreiras físicas22.
Em síntese, a dinâmica populacional coletiva é qualitativamente diferente dos comportamentos de uma única célula. A tecnologia microfluídico EA permite o estudo quantitativo da dinâmica evolutiva e dos comportamentos fenotípicos individualmente e coletivamente em função do tempo. Esta tecnologia pode apresentar um modelo in vitro mais fisiologicamente relevante para a pesquisa oncológica, e potencialmente para o desenvolvimento e triagem de fármacos pré-clínicos.
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Disclosures
Nenhum conflito de interesses declarado.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pelo NSF PHY-1659940.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL BD Luer-Lok tip syringes | BD | 14-823-16E | |
| Antibiotic-Antimycotic | Sigma-Aldrich | A5955 | 1x anti-anti |
| AZ 300 MIF | Merck KGaA | 18441123163 | Photoresist developer |
| AZ1518 | Merck KGaA | AZ1518 | Photoresist |
| AZ4330 | Merck KGaA | AZ4330 | Photoresist |
| Cr Chromium Etchant | Sigma-Aldrich | 651826 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Life Technologies Corporation | 10437028 | |
| Heidelberg DWL 66+ laserwriter | Heidelberg Instruments | DWL66+ | Writing photomask |
| Hexamethyldisilazane (HMDS) | Sigma-Aldrich | 379212 | For photoresist adhesion enhancement |
| Hollow steel pins | New England Small Tube | NE-1300-01 | .025 OD .017 ID x .500 long / type 304 WD fullhard |
| ibidi Heating System, Multi-Well Plates, K-Frame | ibidi | 10929 | On-stage incubator |
| Luer-Lok 23 G dispensing needle | McMaster-Carr | 75165A684 | To connect syringes and tubings |
| Lumox dish 35 | Sarstedt | 94.6077.331 | Gas-permeable cell culture dish |
| Microposit Remover 1165 | Dow Electronic Materials | Microposit Remover 1165 | Photoresist stripper |
| Microseal B Adhesive Sealer | Bio-Rad Laboratories | MSB1001 | Adhesive sealer |
| O-Ring (for Lumox plate sealing) | McMaster-Carr | 9452K114 | Dash No. 27; 1-5/16" ID x 1-7/16" OD; Duro 70 |
| O-Ring (for bottom glass window sealing) | McMaster-Carr | 9452K74 | Dash No. 20; 7/8" ID x 1" OD; Duro 70 |
| Plasma-Preen Plasma Cleaning/Etching System | Plasmatic Systems, Inc | Plasma-Preen | Oxygen plasma system |
| RPMI 1640 | Life Technologies Corporation | 11875-093 | |
| Samco RIE800iPB DRIE | Samco | RIE800iPB | Deep reactive-ion etching system |
| Suss MA6 mask aligner | SUSS MicroTec | MA6 | Mask aligner |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer | Fisher Scientific | NC9285739 | PDMS elastomer |
| TePla M4L plasma etcher | PVA TePla | M4L | Plasma etcher |
| Trichloro-1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl-silane (PFOTS) | Sigma-Aldrich | 448931 | For silicon wafer silanization |
| Tygon microbore tube (0.020" x 0.060"OD) | Cole-Parmer | EW-06419-01 | Tubings for media delivery |
References
- Meacham, C. E., Morrison, S. J. Tumour heterogeneity and cancer cell plasticity. Nature. 501 (7467), 328-337 (2013).
- Whiteside, T. L. The tumor microenvironment and its role in promoting tumor growth. Oncogene. 27 (45), 5904-5912 (2008).
- Lambert, G., et al. An analogy between the evolution of drug resistance in bacterial communities and malignant tissues. Nature Reviews Cancer. 11 (5), 375-382 (2011).
- Tannock, I. F., Lee, C. M., Tunggal, J. K., Cowan, D. S., Egorin, M. J. Limited penetration of anticancer drugs through tumor tissue: a potential cause of resistance of solid tumors to chemotherapy. Clinical Cancer Research. 8 (3), 878-884 (2002).
- Grantab, R. H., Tannock, I. F. Penetration of anticancer drugs through tumour tissue as a function of cellular packing density and interstitial fluid pressure and its modification by bortezomib. BMC Cancer. 12, 214 (2012).
- Fu, F., Nowak, M. A., Bonhoeffer, S. Spatial Heterogeneity in Drug Concentrations Can Facilitate the Emergence of Resistance to Cancer Therapy. PLoS Computational Biology. 11 (3), e1004142 (2015).
- Bogorad, M. I., et al.
- Caballero, D., et al. Organ-on-chip models of cancer metastasis for future personalized medicine: From chip to the patient. Biomaterials. 149, 98-115 (2017).
- Caballero, D., Blackburn, S. M., De Pablo, M., Samitier, J., Albertazzi, L. Tumour-vessel-on-a-chip models for drug delivery. Lab on a Chip. 17 (22), 3760-3771 (2017).
- Zhang, Q., et al. Acceleration of emergence of bacterial antibiotic resistance in connected microenvironments. Science. 333 (6050), 1764-1767 (2011).
- Wu, A., et al. Ancient hot and cold genes and chemotherapy resistance emergence. Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (33), 10467-10472 (2015).
- Lin, K. C., et al. Epithelial and mesenchymal prostate cancer cell population dynamics on a complex drug landscape. Convergent Science Physical Oncology. 3 (4), 045001 (2017).
- Lin, K. C., et al. The role of heterogeneous environment and docetaxel gradient in the emergence of polyploid, mesenchymal and resistant prostate cancer cells. Clinical & Experimental Metastasis. 36 (2), 97-108 (2019).
- Roca, H., et al. Transcription factors OVOL1 and OVOL2 induce the mesenchymal to epithelial transition in human cancer. PloS One. 8 (10), e76773 (2013).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Tinevez, J. Y., et al. Trackmate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
- Caballero, D., et al. Organ-on-chip models of cancer metastasis for future personalized medicine: From chip to the patient. Biomaterials. 149, 98-115 (2017).
- Akhtar, A. The flaws and human harms of animal experimentation. Cambridge Quarterly of Healthcare Ethics. 24 (4), 407-419 (2015).
- Sontheimer-Phelps, A., Hassell, B. A., Ingber, D. E. Modelling cancer in microfluidic human organs-on-chips. Nature Reviews Cancer. 19 (2), 65-81 (2019).
- Bogorad, M. I., DeStefano, J., Karlsson, J., Wong, A. D., Gerecht, S., Searson, P. C.
- Zañudo, J. G. T., et al. Towards control of cellular decision-making networks in the epithelial-to-mesenchymal transition. Physical Biology. 16 (3), 031002 (2019).
- Morris, R. J., et al. Bacterial population solitary waves can defeat rings of funnels. New Journal of Physics. 19 (3), 035002 (2017).
