Summary

Gerçek Zamanlı Gözlem için Mikroakışkan Evrim Hızlandırıcı kanser popülasyonları arasında Heterojen İlaç Gradyanların Üretimi

Published: September 19, 2019
doi:

Summary

Tek hücreli de iyi tanımlanmış çevre koşulları içinde kanser dinamikleri uzun vadeli gerçek zamanlı kantitatif çalışmalar için kontrol edilebilir bir platform sağlayan bir mikroakışkan kanser-on-çip modeli, “Evrim Hızlandırıcı” teknolojisi saiyoruz Düzey. Bu teknolojinin temel araştırma veya klinik öncesi ilaç geliştirme için bir in vitro model olarak çalışması beklenmektedir.

Abstract

Konvansiyonel hücre kültürü en sık kullanılan preklinik model olmaya devam etmektedir, kanserklinik sonuçları tahmin etmek için kanıtlanmış sınırlı yeteneğine rağmen. Mikroakışkan kanser-on-chip modelleri, güvenilir ve tekrarlanabilir kantitatif sonuçlar üretmek için sınırlı yeteneği olan aşırı basitleştirilmiş konvansiyonel 2D kültürler ve daha karmaşık hayvan modelleri arasındaki boşluğu köprü önerilmiştir. Burada, karmaşık bir tümör mikroortamının temel bileşenlerini kapsamlı bir şekilde üreten, ancak kanser dinamiklerinin sağlam kantitatif açıklamalarını sağlayacak kadar basit olan mikroakışkan kanser-on-chip modelini salıyoruz. Bu mikroakışkan kanser-on-çip modeli, “Evrim Hızlandırıcı,” heterojen kemoterapötik stres manzara oluştururken tümör mikroortamların birbirine bağlı bir dizi içine kanser hücrelerinin büyük bir nüfus ayırır. İlerleme ve ilaç gradyan yanıt olarak kanser evrimsel dinamikleri gerçek zamanlı olarak haftalarca izlenebilir, ve çok sayıda downstream deneyler deneyleri boyunca alınan zaman atlamalı görüntüleri tamamlayıcı yapılabilir.

Introduction

Kanser giderek mutasyona uğramış hücre popülasyonlarının sürekli disregülasyon değil, aynı zamanda kanser hücreleri ve konak mikroçevre arasındaki hayati etkileşimlere bağlıdır karmaşık bir ekosistem olarak kabul edilmiştir. Bu anlamda, kanser, heterojen bir tümör mikroçevre ve konak hücrelerin çeşitli ile crosstalk da dahil olmak üzere faktörlerin bir kombinasyonu ile tezahür adaptif bir manzara üzerinde gelişir, tüm bunlar daha fazla genetik veya daha fazla seçici baskılar katkıda epigenetik değişiklikler1,2,3. Solid tümörler bağlamında, kefireutics ve diğer kaynak gradyanlarının düzensiz dağılımı moleküler heterojenitelerine katkıda bulunur ve ilaç direncigelişiminde rol oynayabilir, belirli tümöre anjiyogenez artmış alt popülasyonlar ve hatta metastaz4,5,6. Konvansiyonel in vitro 2D hücre kültürü çalışmaları, büyük ölçekli, uygun deneysel kapasiteye sahip iken, ortalama alan sağlar, üniforma, ve sabit koşullar, genellikle gerçekten gerekli hassas mekansal ve zamansal çevresel kontrol yoksun in vivo tümör dinamikleri taklit. Bu nedenle, kanser insidansının daha iyi tahmin edilebilmesi ve dinamik stres içindeki ilaçlara verilen tepkilerin daha iyi tahmin edilebilmesi için, ilaç geliştirme boru hattındaki hayvan modellerinden önce tümör mikroçevresini yeniden üretmek için daha fazla temsili ex vivo modeline ihtiyaç vardır. Manzara. Mikroakışkanlar 2D hücre kültürü çalışmaları ve kontrol edilebilir kantitatif çalışmaları desteklemek mümkün olmayabilir vivo hayvan çalışmaları daha karmaşık arasındaki boşluğu köprü önerilmiştir7,8,9.

Kanser hücre dinamiklerini karakterize etmek için ideal bir in vitro sistem, bir tümörde meydana gelen adaptif hücresel yanıtları taklit etmek için heterojen bir mikroortam oluşturma yeteneğine sahip olmalıdır, hem de bu dinamiklerin gözlem için izin tek hücreli çözünürlük. Bu makalede, bir mikroakışkan hücre kültür platformu, bir PDMS tabanlı cihaz “Evrim Hızlandırıcı” (EA), hücresel çözünürlükte kanser hücre dinamikleri paralel in vitro çalışmalar için izin veren bir gerçek zamanlı veri toplama üzerinde hafta ders, stably kültür manzara genelinde stres degradeleri korurken. Bu platformun tasarımı, metapopülasyondaki organizmaların evrimsel dinamiklerinin10,11hızlandırılabildiği önceki çalışmamıza dayanmaktadır. Özellikle, bir düzeyde etkileşim mekansal olarak ayrılmış popülasyonlar bir grup, heterojen bir stres manzara maruz kaldığında, en uygun türler daha hızlı büyük bir tektip nüfus ile karşılaştırıldığında yerel bir popülasyonhakim olabilir. Avantajlı türler daha sonra kaynak ve uzay arayışı içinde komşu mikrohabitatlara göç eder ve sonunda tüm popülasyona hükmeder. Şekil 1’degösterildiği gibi, mikroakışkan EA yongasının deseni (i) taze ortam sirkülasyonu sağlayan ve kimyasal difüzyon için sabit sınır koşulları oluşturan bir çift serpantin kanaldan ve (ii) altıgen hücre kültür bölgesinden oluşur. merkezde 109 birbirine bağlı altıgen ve 24 yarı altıgen odaktan oluşan petek yapısına benzer. Çip 100 μm derinliğindedir. Medya kanalları ve hücre kültürü bölgesi, doğrudan medya akışını ve hücre kültürü alanında ortaya çıkan kesme stresini önleyen küçük kilerek (yaklaşık 15 μm genişliğinde) bağlanır, ancak yine de kimyasalların küçük kerektonlar aracılığıyla dağılmasına ve besin alışverişine izin verir, metabolik atık, vb. Kimyasal degradelerin üretimi Şekil 1B’degösterilmiştir, bir medya kanalı 0.1 mM floresan içerirken diğer kanalfloresan içermez. Hücreler, mikroyapılar tarafından çipe karşı membran üzerindeki pozitif geri basınç yoluyla kapsüllenen, geçirilebilir bir gaz membranı üzerinde kültürlenir. Cihaz tutucunun bileşenleri Şekil 2’degösterilmiştir ve deneysel kurulum Şekil 3’tegösterilmiştir , burada kültür 37 °C’de ters bir mikroskop üzerinde korunur, %85’in üzerinde bağıl nem ile ve normoksia gaz bileşimi.

Bu sistem, brightfield ve floresan kanallar aracılığıyla lokalize hücresel etkileşimlerin ayrıntılı gözlemini sağlar ve immünoffloresan, Batı lekeleri veya kütle spektrometresi gibi mekansal olarak çözülmüş downstream tahlillerine olanak sağlar. Daha önce epitel ve mezenkimal PC3 prostat kanseri hücrelerinin uzun vadeli ortak kültür bu mikroakışkan kanser-on-chip modelinin bir kanıtı olarak göstermiştir12 yanı sıra ilaca dirençli poliploid dev ortaya çıkması epitel PC3 hücre hattı13kullanarak kanser hücreleri . Biz docetaxel bir stres gradyanı altında epitelyal PC3 ve mezenkimal prostat kanseri hücrelerinin spatiotemporal dinamikleri anlamak için bu platformun uygulama sunarken, mikroakışkan sistem kolayca hücre hatlarının herhangi bir kombinasyonu uygulanabilir ve kaynak (yani, ilaç, besin, oksijen) degradeler.

Protocol

1. Mikroakışkan cihazın imalatı Bir düzen tasarım yazılımı kullanarak istenilen mikroakışkan deseni oluşturun (Bkz. Ek Malzemeler). Fotomaskeyi üret. Daha fazla bilgi için Malzeme Tablosu’na bakın. Bir lazer yazar kullanarak, cr 100 nm ve photoresist AZ1518 500 nm ile kaplı bir soda-kireç cam plaka üzerinde desen yazın. 60 s için geliştirici AZ300MIF ile photoresist geliştirin. Cr-7 Krom Etchant kullanarak fotodiren?…

Representative Results

Çipte optimum hücre büyümesinin doğrulanmasıDeney platformunun temel amacı, karmaşık bir tümör mikroortamında ki temel bileşenleri ve etkileşimleri kapsamlı bir şekilde yeniden üretmektir, ancak nicel, güvenilir ve tekrarlanabilir veriler sağlayacak kadar basittir. Bu amaca ancak fiziksel ve biyokimyasal çevresel faktörlerin tam kontrolü ne olursa olsun ulaşılabiliyor. İstenmeyen faktörleri dışlamalı veya popülasyon davranışlarını do?…

Discussion

Konvansiyonel hücre kültürü neredeyse bir yüzyıl önce geliştirilen ve biyomedikal araştırmalarda en sık kullanılan preklinik modeli kalır, kanser klinik sonuçları tahmin etmek için kanıtlanmış sınırlı yeteneğine rağmen17. Hayvan modelleri en yüksek fizyolojik alaka ve insanlar için makul genetik benzerlik sunuyoruz, ama uzun insan sonuçları tahmin önemli sınırlamalar olduğu kabul edilmiştir18. Tüm mevcut preklinik modeller arasında, mikroa…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışma NSF PHY-1659940 tarafından desteklenmiştir.

Materials

10 mL BD Luer-Lok tip syringes BD 14-823-16E
Antibiotic-Antimycotic Sigma-Aldrich A5955 1x anti-anti
AZ 300 MIF Merck KGaA 18441123163 Photoresist developer
AZ1518 Merck KGaA AZ1518 Photoresist
AZ4330 Merck KGaA AZ4330 Photoresist
Cr Chromium Etchant Sigma-Aldrich 651826
Fetal bovine serum (FBS) Life Technologies Corporation 10437028
Heidelberg DWL 66+ laserwriter Heidelberg Instruments DWL66+ Writing photomask
Hexamethyldisilazane (HMDS) Sigma-Aldrich 379212 For photoresist adhesion enhancement
Hollow steel pins New England Small Tube NE-1300-01  .025 OD .017 ID x .500 long / type 304 WD fullhard
ibidi Heating System, Multi-Well Plates, K-Frame ibidi 10929 On-stage incubator 
Luer-Lok 23 G dispensing needle McMaster-Carr 75165A684 To connect syringes and tubings
Lumox dish 35 Sarstedt 94.6077.331 Gas-permeable cell culture dish
Microposit Remover 1165 Dow Electronic Materials Microposit Remover 1165 Photoresist stripper
Microseal B Adhesive Sealer Bio-Rad Laboratories MSB1001 Adhesive sealer
O-Ring (for Lumox plate sealing) McMaster-Carr 9452K114 Dash No. 27; 1-5/16" ID x 1-7/16" OD; Duro 70
O-Ring (for bottom glass window sealing) McMaster-Carr 9452K74 Dash No. 20; 7/8" ID x 1" OD; Duro 70
Plasma-Preen Plasma Cleaning/Etching System Plasmatic Systems, Inc Plasma-Preen Oxygen plasma system
RPMI 1640 Life Technologies Corporation 11875-093
Samco RIE800iPB DRIE Samco RIE800iPB Deep reactive-ion etching system
Suss MA6 mask aligner SUSS MicroTec MA6 Mask aligner 
Sylgard 184 Silicone Elastomer Fisher Scientific NC9285739 PDMS elastomer
TePla M4L plasma etcher PVA TePla M4L Plasma etcher
Trichloro-1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl-silane (PFOTS) Sigma-Aldrich 448931 For silicon wafer silanization
Tygon microbore tube (0.020" x 0.060"OD) Cole-Parmer EW-06419-01 Tubings for media delivery

References

  1. Meacham, C. E., Morrison, S. J. Tumour heterogeneity and cancer cell plasticity. Nature. 501 (7467), 328-337 (2013).
  2. Whiteside, T. L. The tumor microenvironment and its role in promoting tumor growth. Oncogene. 27 (45), 5904-5912 (2008).
  3. Lambert, G., et al. An analogy between the evolution of drug resistance in bacterial communities and malignant tissues. Nature Reviews Cancer. 11 (5), 375-382 (2011).
  4. Tannock, I. F., Lee, C. M., Tunggal, J. K., Cowan, D. S., Egorin, M. J. Limited penetration of anticancer drugs through tumor tissue: a potential cause of resistance of solid tumors to chemotherapy. Clinical Cancer Research. 8 (3), 878-884 (2002).
  5. Grantab, R. H., Tannock, I. F. Penetration of anticancer drugs through tumour tissue as a function of cellular packing density and interstitial fluid pressure and its modification by bortezomib. BMC Cancer. 12, 214 (2012).
  6. Fu, F., Nowak, M. A., Bonhoeffer, S. Spatial Heterogeneity in Drug Concentrations Can Facilitate the Emergence of Resistance to Cancer Therapy. PLoS Computational Biology. 11 (3), e1004142 (2015).
  7. Bogorad, M. I., et al. In vitro microvessel models. Lab on a Chip. 15 (22), 4242-4255 (2015).
  8. Caballero, D., et al. Organ-on-chip models of cancer metastasis for future personalized medicine: From chip to the patient. Biomaterials. 149, 98-115 (2017).
  9. Caballero, D., Blackburn, S. M., De Pablo, M., Samitier, J., Albertazzi, L. Tumour-vessel-on-a-chip models for drug delivery. Lab on a Chip. 17 (22), 3760-3771 (2017).
  10. Zhang, Q., et al. Acceleration of emergence of bacterial antibiotic resistance in connected microenvironments. Science. 333 (6050), 1764-1767 (2011).
  11. Wu, A., et al. Ancient hot and cold genes and chemotherapy resistance emergence. Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (33), 10467-10472 (2015).
  12. Lin, K. C., et al. Epithelial and mesenchymal prostate cancer cell population dynamics on a complex drug landscape. Convergent Science Physical Oncology. 3 (4), 045001 (2017).
  13. Lin, K. C., et al. The role of heterogeneous environment and docetaxel gradient in the emergence of polyploid, mesenchymal and resistant prostate cancer cells. Clinical & Experimental Metastasis. 36 (2), 97-108 (2019).
  14. Roca, H., et al. Transcription factors OVOL1 and OVOL2 induce the mesenchymal to epithelial transition in human cancer. PloS One. 8 (10), e76773 (2013).
  15. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  16. Tinevez, J. Y., et al. Trackmate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
  17. Caballero, D., et al. Organ-on-chip models of cancer metastasis for future personalized medicine: From chip to the patient. Biomaterials. 149, 98-115 (2017).
  18. Akhtar, A. The flaws and human harms of animal experimentation. Cambridge Quarterly of Healthcare Ethics. 24 (4), 407-419 (2015).
  19. Sontheimer-Phelps, A., Hassell, B. A., Ingber, D. E. Modelling cancer in microfluidic human organs-on-chips. Nature Reviews Cancer. 19 (2), 65-81 (2019).
  20. Bogorad, M. I., DeStefano, J., Karlsson, J., Wong, A. D., Gerecht, S., Searson, P. C. Review: in vitro microvessel models. Lab on a Chip. 15, 4242-4255 (2015).
  21. Zañudo, J. G. T., et al. Towards control of cellular decision-making networks in the epithelial-to-mesenchymal transition. Physical Biology. 16 (3), 031002 (2019).
  22. Morris, R. J., et al. Bacterial population solitary waves can defeat rings of funnels. New Journal of Physics. 19 (3), 035002 (2017).

Play Video

Cite This Article
Lin, K., Torga, G., Sun, Y., Pienta, K. J., Sturm, J. C., Austin, R. H. Generation of Heterogeneous Drug Gradients Across Cancer Populations on a Microfluidic Evolution Accelerator for Real-Time Observation. J. Vis. Exp. (151), e60185, doi:10.3791/60185 (2019).

View Video