Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

הדור של מעברי מדרגות של סמים הטרוגנית ברחבי אוכלוסיות סרטן על מאיץ האבולוציה Microfluidic להתבוננות בזמן אמת

Published: September 19, 2019 doi: 10.3791/60185
Automatic Translation
1, 2, 1, 2, 1, 1
1Princeton University, 2Johns Hopkins Medical Institute

Summary

אנו מציגים מודל סרטן על שבב מיקרופלואידים, הטכנולוגיה "מאיץ האבולוציה", אשר מספק פלטפורמה לשליטה לטווח ארוך בזמן אמת מחקרים כמותיים של הדינמיקה של סרטן בתנאים סביבתיים המוגדרים היטב בתא יחיד רמת. טכנולוגיה זו צפויה לעבוד כמודל מבחנה עבור מחקר בסיסי או פיתוח תרופות טרום-קליני.

Abstract

תרבות התא קונבנציונאלי נשאר מודל טרום קליני בשימוש תכוף, למרות היכולת המוגבלת שלה מוכחת לחזות תוצאות קליניות בסרטן. סרטן מיקרופלואידיג-על שבב מודלים כבר הציעו לגשר על הפער בין תרבויות 2D קונבנציונאלי מסובכים יותר מודלים בעלי חיים מורכבים יותר, אשר יש יכולת מוגבלת לייצר תוצאות כמותיים אמין ומחורץ. כאן, אנו מציגים מודל מיקרופלואידיג סרטן על שבב שמתרבה רכיבים מרכזיים של מיקרוסביבה מורכבת הגידול באופן מקיף, עדיין הוא פשוט מספיק כדי לספק תיאורים כמותיים חזקים של הדינמיקה של סרטן. זה סרטן מיקרופלואידיג מודל על שבב, "המאיץ האבולוציה," מפרק את האוכלוסייה הגדולה של תאים סרטניים לתוך מערך מחובר של מיקרוסביבות הגידול תוך יצירת מתחים הטרוגנית כימותרפיה. ההתקדמות ואת הדינמיקה האבולוציונית של סרטן בתגובה מעבר הצבע התרופה יכול להיות מנוטר במשך שבועות בזמן אמת, וניסויים רבים במורד הזרם ניתן לבצע משלים את התמונות בזמן הקפיצה שנלקחו במהלך הניסויים.

Introduction

סרטן כבר הוכר יותר ויותר כמערכת אקולוגית מורכבת, כי תלוי לא רק על המשך בלתי מתמשך של אוכלוסיות תאים מוטציה אלא גם על אינטראקציות חיוניות בין תאים סרטניים לבין מיקרואקולוגיה המארחת. במובן זה, הסרטן מתפתח על נוף אדפטיבית המתבטא על ידי שילוב של גורמים, כולל מיקרוסביבה גידול הטרוגנית והוצלב עם מגוון של תאים מארחים, כולם לתרום לחצים סלקטיבית עבור גנטי נוסף או . שינויים אפיגנטיים1,2,3 בהקשר של גידולים מוצקים, התפלגות אחידה של chemotherapeutics ומעברי צבע אחרים התורמים לטרוגניות המולקולריים שלהם ועשויים לשחק תפקיד בפיתוח התנגדות לסמים, הגדילה אנגיוגנזה לגידול מסוים אוכלוסיות משנה, ואפילו גרורות4,5,6. קונבנציונאלי בלימודי תרבות תא 2D, תוך שליטה בקנה מידה גדול, היכולת ניסיוני נוח, מספק שדה ממוצע, אחיד, וקבוע התנאים, לעתים קרובות חסר בקרת הסביבה המרחבית מדויק הזמני הדרושים באמת לחקות הדינמיקה הגידול vivo. כך, יש צורך יותר מודלים לשעבר vivo ex לשכפל את מיקרוסביבה הגידול לפני מודלים בעלי חיים בצינור פיתוח התרופה כדי חיזוי טוב יותר של התקדמות הסרטן, כמו גם תגובות סמים בתוך מתח דינמיות נופים. מיקרופלואידיקה הוצעו לגשר על הפער בין לימודי תרבות תא 2d ומורכבות יותר במחקרים בעלי חיים vivo שייתכן שלא יוכלו לתמוך במחקרים כמותיים שניתן לשליטה7,8,9.

אידיאלי במערכת מבחנה כדי לאפיין את הדינמיקה תאים סרטניים צריך להחזיק את היכולת ליצור מיקרוסביבה הטרוגנית כדי לחקות את התגובות הסלולר אדפטיבית שעשוי להתרחש בגידול, כמו גם לאפשר התבוננות של הדינמיקה הזאת ב רזולוציה של תא בודד. במאמר זה, אנו מתארים פלטפורמת מיקרופלואידיג תא התרבות, מכשיר מבוסס PDMS שנקרא "מאיץ האבולוציה" (EA), המאפשר מקבילים במחקרים מחוץ לגופית של דינמיקה תא סרטן ברזולוציה התאית עם רכישת נתונים בזמן אמת על משך שבועות, בעוד שמירה על מעברי מדרגות של מתח ברחבי הנוף התרבותי. העיצוב של פלטפורמה זו מתבסס על עבודתנו הקודמת, שבה ניתן להאיץ את הדינמיקה ההתפתחותית של אורגניזמים במטא-מטאפיסיה10,11. באופן ספציפי, בקבוצה של אוכלוסיות מופרדות הדדית האינטראקציה ברמה מסוימת, כאשר נחשפים לנוף הטרוגנית הלחץ, המינים המתאימים ביותר יכול להשתלט על האוכלוסייה המקומית מהר יותר לעומת זאת של אוכלוסיה גדולה אחידה. לאחר מכן, המינים הכדניים עוברים לבתי גידול שכנים בחיפוש אחר משאבים ומרחב, ובסופו של דבר שולטים באוכלוסיה כולה. כפי שמוצג באיור 1, התבנית של שבב EA microflu, מורכב (i) זוג של ערוצי הסרפנטיין המספקים מחזור מדיה טרי ולבנות תנאי גבול קבוע לדיפוזיה כימית, ו (ii) האזור תרבות התא משושה אשר מורכב 109 משושה המחוברים ו 24 חדרי חצי משושה במרכז, דמוי המבנה חלת דבש. השבב הוא 100 יקרומטר לעומק. ערוצי מדיה ואזור תרבות התא מקושרים עם חריצים קטנים (כ-15 יקרומטר רחב), אשר מונעים זרימת מדיה ישירה ומתח ההטיה כתוצאה מעבר לאזור התרבות של התא, ועדיין מאפשרים לכימיקלים לפזר באמצעות חריצים קטנים וחומרים מזינים של החליפין, פסולת מטבולית, וכו '. הדור של מעברי צבע כימיים מוצג באיור 1B, שבו ערוץ מדיה אחד מכיל 0.1 מ"מ של fluorescein בעוד הערוץ השני הוא חינם של fluorescein. תאים הם מתורבתים על ממברנה חדיר גז, כאשר כחלחל על ידי המיקרו מבנים דרך לחץ האחורי חיובי על הקרום נגד השבב. מרכיבי בעל ההתקן מומחשים באיור 2, והכיוונון הנסיוני מומחש באיור 3, כאשר התרבות נשמרת על מיקרוסקופ הפוך ב-37 ° c, עם מעל 85% לחות יחסית, וממוזג תחת הרכב גז נורמוסקסיה.

מערכת זו מספקת תצפית מפורטת של אינטראקציות הסלולר המותאמות לשפות אחרות באמצעות שדות פלורסנט ומאפשר העברה של הזרם החוצה, כגון immunofluorescence, אבן חשופה מערבית או ספקטרומטר מסה. הדגמנו בעבר כהוכחה של העיקרון של סרטן זה microflu, מודל על שבב של המודל על שיתוף לטווח ארוך של האפיתל ואת mesenchymal PC3 סרטן הערמונית תאים12 , כמו גם הופעתה של ענק סמים התנגדות פוליפואיד ענקית תאים סרטניים באמצעות האפיתל PC3 תא קו13. בעוד אנו מציגים את היישום של הפלטפורמה הזאת כדי להבין את הדינמיקה הטמפורלית של האפיתל PC3 ו mesenchymal סרטן הערמונית תאים תחת הדרגתי לחץ של doceel, מערכת microfluidic ניתן להחיל בקלות על כל שילוב של קווי התא ומשאבים (כלומר, תרופות, מזינים, חמצן) מעברי צבע.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. ייצור מכשיר מיקרופלואידיג

  1. צור את דפוס המיקרופלואידיג הרצוי באמצעות תוכנת עיצוב פריסה (ראה חומרים משלימים).
  2. . הרכיבו את הפושאול לפרטים נוספים עיין ברשימת החומרים .
    1. ניצול כותב לייזר, לכתוב את התבנית על צלחת סודה ליים מצופה עם 100 ננומטר של Cr ו 500 nm של photoresist AZ1518.
    2. לפתח את photoresist עם מפתח AZ300MIF עבור 60 s.
    3. לחרוט את כרום ללא הגנה מphotoresist באמצעות מזמור כרום Cr-7.
    4. להסיר את photoresist שיורית באמצעות חשפנית photoresist ב 70 ° c עבור 45 דקות.
  3. . Photoresist את התבנית לפרטים נוספים עיין ברשימת החומרים .
    1. ספין מעיל HMDS על סיליקון וופל ב 4000 סל ד עבור 40 s.
    2. ספין מעיל photoresist AZ4330 על סיליקון וופל ב 4000 סל ד עבור 40 s.
    3. לאפות רך סיליקון וופל ב 95 ° c עבור 60 s.
    4. לנצל את המסכה לתנינים כדי לחשוף UV לפרוסת סיליקון.
    5. לפתח את photoresist עם מפתח AZ300MIF עבור 4 דקות.
  4. בצע חריטה DRIE. לפרטים נוספים עיין ברשימת החומרים .
    1. יבש-לסדר את הפרוסת וופל עם הphotoresist באמצעות מערכת סיליקון עמוק מאוד מגיב (DRIE) לעומק 100 יקרומטר.
    2. להסיר את הphotoresist עם אצטון ואיכול פלזמה עם etcher פלזמה.
  5. . חמצון וופל וסילניזציה לפרטים נוספים עיין ברשימת החומרים .
    1. לבצע חמצון תרמי על וופל סיליקון חרוט בכבשן ב 1100 ° c עבור 1 h.
    2. לחכות הסיליקון וופל להתקרר, ולאחר מכן למקם את הפרוסת לתוך desiccator עם כמה טיפות של trichloro-1H, 1H, 2H, 2H-ההופעה-silane (PFOTS) מטפטפים במיכל קטן ליד וופל.
    3. משאבת הלחץ של desiccator ל0.5 כספומט בטמפרטורת החדר עבור 60 דקות. עובש סיליקון וופל צריך להיות הידרופובי לאחר silanization הנכון, אשר ניתן נבדק על ידי הוספת מספר טיפות של מים על וופל.
  6. . ליתוגרפיה רכה לפרטים נוספים עיין ברשימת החומרים .
    1. מערבבים טרום פולימר ו-cross-מקשר (מ polyמתיל siloxane) ב 10:1 על ידי יחס משקל.
    2. יוצקים את ה-PDMS המעורב ליצירת סרט בגובה של 10 מ"מ על העובש הsilanized סיליקון.
    3. דגה את מערכת הסיליקון המתקבלת PDMS בdesiccator במשך 30 דקות עד 1 h.
    4. מודלת את ה-PDMS-סיליקון וופל בחממה ב70 ° c כדי לרפא את ה-PDMS.
    5. לאחר PDMS הוא נרפא, לקלף את הסרט PDMS את וופל סיליקון בזהירות.
    6. באמצעות מחטים ביופסיה, אגרוף דרך-חורים ביציאות כהים מבוסס על מיקום התבנית על PDMS ולהעסיק אגרוף עגול כדי לחתוך צ'יפס 27 מ"מ קוטר.
  7. התחברות שכבה PDMS.
    1. מחממים שתי ערימות של 27 צילינדרים מסוג PDMS (ללא היטרונינג), שיהפכו לשכבת האגירה ולשכבת הסגירה של המכשיר.
    2. גזור שני עיגולים 7 מ"מ סביב אינלטס על שכבת המאגר, ולנצל מחט ביופסיה כדי אגרוף דרך-חורים ביציאות מפרץ על שכבת הסגירה.
    3. בונד שלוש ערימות של PDMS (מחסנית בדוגמת, שכבת אגירה, שכבת הסגירה) עם טיפול פלזמה חמצן.
    4. עם מחט הביופסיה, להכות דרך חורים בשקעים ובנמל המרכזי של המכשיר.

2. הכנה למדיה ולקו התאים

  1. הכן מדיה עבור קווי תא PC3 culturing, כולל PC3-חובש ו PC3-אפינפרין: לערבב RPMI 1640 בינוני עם סרום העובר 10% (FBS) ו-1x אנטיביוטי-antimycotic. צור קווי תא כמתואר בעבר14.
    הערה: קווי התא PC3 נשמרים באמצעי התקשורת שלעיל בעזרת מחולל חממות ב-37 ° c עם 5% CO2. לפצל תאים תת-תרבות כל 3 ימים, לפני שהם מגיעים 100% השטף.
  2. שורות תא transfect עם סמנים פלורסנט מתויג cytoplasmic עבור הדמיה טובה יותר, כפי שמתואר בעבר12, כך PC3-פרמדיק מבטא CYTOPLASMIC gfp ו PC3-אפינפרין מביע Cytoplasmic mcherry. שים לב כי הטכנולוגיה תואמת גם עם כל התאים המסומנים פלורסנט, כמו גם הדמיה ברייטפילד של תאים ללא תווית.

3. התקנה ניסויית

  1. ייצור מחזיק לוחית מתכת
    1. הרכיבו מחזיק לוחית המספיק להחזיק מנות תרבות בו חדירות בו לניסויים מקבילים על ידי עיבוד שבבי או 3D הדפסה. קובץ ה-3D CAD (צלחת 3-טוב. FCStd ") ניתן למצוא ב-GitHub כהפניה (https://github.com/kechihl/3-well-plate).
    2. להתיר את המרכיבים של המחזיק (איור 2) עם מברג. לחטא את הרכיבים באמצעות חשיפה UV לפחות 1 h ולעזוב בסביבה סטרילית.
      הערה: המחזיק נועד לספק תנאים משמעותיים עבור שיווי משקל תרמי וקומפוזיציות גז אידיאלי, עם ערוץ הגז המאפשר זרימת אוויר. פרטים נוספים ניתן למצוא בעבודה הקודמת שלנו12.
    3. היכונו עד שלוש מנות תרבות חדירות, אשר קרום התרבות התא הוא גמיש יחסית.
  2. זריעת שורות תאים
    1. 24 שעות לפני תחילת הניסוי, הקציר PC3-אפינפרין ו-PC3-בתאי החירום על ידי טריסיזציה עבור 5 דקות. הוסף מדיה התרבות prewarmed, ולאחר מכן צנטריפוגה ב 150 x g עבור 3 דקות ולהיפטר supernatant.
    2. לספור את התאים של כל PC3-אפינפרין ו-PC3-פרמדיק באמצעות הומוציטוטומטר ולבודד סך של 2.5 x 104 של כל סוג תא עבור כל צלחת תרבות חדיר.
    3. ערבבו והשהה את שני סוגי התאים ב -2 מ ל של מדיית תרבות וזרע את התאים לתוך כל אחד מכלי התרבות הניתן לחדירות הגז.
    4. השאירו את מחזיק הצלחת כולו בחממה למשך הלילה כדי לצרף תאים.
    5. חטא את התקני PDMS באמצעות חשיפה UV לפחות 1 h ולעזוב בסביבה סטרילית.
  3. הקמת יחידת בקרה תרמית ומערכת אספקת גז
    1. כפי שמוצג באיור 3, להגדיר מערכת אספקת גז המורכבת הן CO2 ו O2 יחידות בקרה, משאבת גז, תא ערבוב גז, מכשיר אדים או בובלר, ושלושה סטים נפרדים של שסתומי גז ומאבחנים לחץ. פרטים נוספים ניתן למצוא בעבודה הקודמת שלנו12.
    2. להגדיר את שיתוף2 ו O2 יחידות הבקרה כגון שהם מתאימים את קצב ערבוב של הגז מ CO2 ו-N2 טנקים מקור O2 . לחילופין, כל מערכת אספקת גז המספקת גז תחת מצב normoxia יעבוד.
    3. ודא שהגז המשולב בחדר הערבוב ומחולל לחות על-ידי בובלר, כך שהלחות היחסית גדלה עד 85% (לקריאה מתוך צג לחות יחסית) וכי הגז מוביל לשלושה שסתומי גז עצמאיים עם ממדי לחץ כדי ל שליטה וניטור שיעור זרימת גז במחזיק הצלחת.
    4. מניחים את מחזיק לוחית כולה ביחידת הבקרה התרמית של הדגירה בשלב עם יחידות משנה חימום נפרד עבור המכסה ואת הצלחת התחתונה, עם כל היחידות להגדיר ב 37 ° c. לפרטים נוספים עיין ברשימת החומרים .
  4. התקנת מכשיר מיקרופלואידיג. לפרטים נוספים עיין ברשימת החומרים .
    1. לזהות את המרכיבים המפורטים של בעל 3-הצלחות היטב בסדר, כמו באיור 2. כל אחת משלוש הבארות זהות ועצמאית, עם זוג ערוצי גז לכל באר. בכל באר יש מחזיק גז חדיר החברה בעל יכולת, מחזיק שבב PDMS, מחזיק חלון זכוכית, וזוג של 35 מילימטר חלונות זכוכית. ניתן להרכיב רכיבים אלה באמצעות הברגים המצוידים.
      הערה: חלונות זכוכית להבטיח כי יש מרחב תרמי מבודד בין קרום התרבות חדיר מסוגל היטב כגון כי עיבוי מים לא מתרחשת עקב הבדלי טמפרטורה בממשק. שימו לב כי 3 בארות הם עצמאיים, ו 3 ניסויים ניתן לעשות בנפרד.
    2. מדיום התרבות לפני החום ב 37 ° c ו דגה בחדר ריק עבור 20 דקות.
    3. התייחס לאסימונים PDMS באמצעות מערכת פלזמה חמצן עבור 30 s כדי לשמור על hydrophilicity.
    4. . הגדר את מערכת המזרק טען שני מזרקים באיטיות עם מדיית צמיחה ושני מזרקים אחרים בעלי התעניינות מלאה (מדיה, מדיה עם סמים וכו '). לחבר כל מזרק בודד לצינורות 50 ס מ (0.020 "x 0.060" OD) על ידי מחט בגובה 23 גר' לתוך סיכת פלדה חלולה אחת. הכנס סיכת פלדה חלול לקצה השני של אבובים.
    5. הראשי אבובים ולהכניס את סיכת הפלדה לכל שבב PDMS דרך שכבת הסגירה. מלאו את שכבת האגירה והרטבת את תבנית שכבת הדפוס של PDMS עם מדיה. שכבת המאגר פועלת כמלכודת בועה על שבב כדי למנוע בועות אוויר מלקבל לתוך דפוס microfluidic.
    6. . העמיסו מזרק מ-mL עם מדיית תרבות לחבר את המזרק לצינורות 5 ס מ (0.020 "x 0.060" OD) באמצעות מחט של 23 גר' לתוך סיכת פלדה חלולה אחת. הכנס סיכת פלדה חלול לקצה השני של אבובים הממשלה אבובים.
    7. הכנס את סיכת הפלדה חלול לתוך החור במרכז של השבב, שם מדיה מוגזמת ניתן לחלץ מן השבב מאוחר יותר במהלך תהליך איטום השבב.
    8. כמו כל התקן PDMS דורש מזרקים 4 10 mL טעון על משאבת מזרק, טען 2 10 mL מזרקים לכל שבב בסיפון הקדמי. הניחו את שני המוזרקים האחרים בסיפון הנסיגה של מערכת המזרק.
    9. מניחים שבב ישירות על גבי קרום התרבות חדירות גז (עם תאים כבר דבקה הקרומים). על מנת למנוע בועות מיקרו הראפ בתבנית microflu, לחלק 1 מ ל של מדיה מראש ומגנטיות לתוך המנה התרבותית של 35 מ"מ גז חדיר לפני ההרכבה, ולאחר מכן לוודא כי השבב מתקרב למשטח הנוזלי עם זווית להטות 15 מעלות.
    10. מהדק את צלחת התרבות חדיר הדלק ואת הבאר של מחזיק את הכלים התרבות חדיר החקלאות עבור כל שבב, עם המחזיק שבב PDMS דוחף את המכשיר PDMS כלפי מטה.
    11. קלטת גיליון של החותם על גבי התקן PDMS ומלחציים עם מחזיק שבב PDMS כדי למנוע את השבב מייבוש.
    12. הגדר קצב זרימת מדיה מסביב למערך כדי להיות 20 μL/h.
    13. הגדר את כל הצלחת בחממה על הבמה בשלב המונע של מיקרוסקופ הפוך. לחבר את מערכת אספקת הגז לתעלות הגז והלחץ על קרום התרבות חדיר מסוגל גז נגד שבב PDMS מותקן כדי להבטיח איטום של המכשיר. לשמור על לחץ מד ב 0.2 psi (1.4 x 104 פא).
    14. באיטיות לחלץ מדיה מוגזמת בשבב באמצעות מזרק 1-mL מהחור במרכז. שימו לב לשבב מתחת למיקרוסקופ תוך חילוץ מדיה ולאחר מכן להפסיק חילוץ כאשר השבב אטום. איטום שבב צריך להיות ברור מאז חלק של התאים יהיה נמחץ על ידי מיקרו מבנים.
    15. חברו את יחידת חישת הטמפרטורה של החממה על הבמה לצלחת 3-היטב וה37 ° c.

4. תא יחיד לפקיעה הדמיה

  1. להגדיר תוכנת דימות ניצול מיקרוסקופ הפוך לרכישת תמונה בזמן הקפיצה. שים לב כי מיקרוסקופ פלורסנט הפוכה עם ממונע מלא x-y שלב, כפתור המיקוד, תריס, וקוביות מסנן נדרש עבור ניסוי EA.
  2. קביעת תצורה של תוכנה לרכישת תמונות על פני שני ערוצים בהגדלה 10x עבור כל שבב עם תמונה אוטומטית-תפרים לאחר סיבוב אחד של פוקוס אוטומטי. שים לב כי מערכות תיקון אוטומטי כמו פוקוס מושלם לא להבטיח איכות תמונה מספקת. מומלץ יותר ליצור משטח מיקוד מותאם אישית עבור רכישת תמונה ארוכת טווח מבוסס על פוקוס אוטומטי או פוקוס ידני על פני השבב.
  3. לקחת תמונות כל שעה ולהשאיר ניסוי פועל בסרגל הזמן של שבועות. הצג איכות תמונה על בסיס יומי ועדכן את משטח המיקוד במידת הצורך.
  4. הכינו את שבב ה-PDMS ומיכל התרבות החדיר לטיפול בגז לניתוח האימונולומידורף שלאחר מכן, כמתואר בעבר13.

5. עיבוד תמונה וניתוח

  1. עיבוד לאחר ניסיוני
    1. המרת תמונות לפורמט TIFF לעיבוד תמונה ומדידות באמצעות פיג'י/ImageJ.
    2. דחיסת קבצי TIFF כדי להקל על עיבוד תמונה נוסף.
  2. ניתוח פיג'י/דפוס
    1. כדי לזהות תאים, בצע ' חיסור רקע ' ו'ניתוח חלקיקים ' כדי לזהות כתמים בהירים של פלורסנט לאיתור מיקום התא וספירת תאים אוטומטיים.
    2. להשתמש בתוספים (מעקב ידני, כימוטקסיס, כלי הגירה, Trackmate) כדי לנתח את התנועתיות תאים והגירה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

אימות של צמיחת תאים אופטימליים בשבב
המטרה העיקרית של פלטפורמת הניסוי היא לשכפל רכיבים מרכזיים ואינטראקציות בסביבה מורכבת של גידולים מורכבים באופן מקיף, אך פשוט מספיק כדי לספק נתונים כמותיים, אמינים ומתכלים. מטרה זו יכולה להיות מושגת רק אם יש לנו שליטה מלאה על הגורמים הסביבתיים הפיזיים והביוכימיים. אנחנו חייבים להוציא את הגורמים הבלתי רצויים או למצוא דרך לשלב את הגורמים בלתי נשלט לתוך המודל הכמותי כדי לפרש כראוי את התנהגויות האוכלוסייה.

המבחן הראשון הוא להבטיח צמיחת תאים אופטימלית על המכשיר. שיעור הפצת התאים בהתקן צריך להיות זהה או דומה לפרופיל הגדילה שלהם בתרבות התא המקובלת. כהוכחה לעיקרון, סרטן הערמונית האדם קו התא PC3 תאים היו מתורבתים שבב PDMS ללא נוכחות של מתח חיצוני. תאים אלה היו מסומנים בעזרת הציטופלסמה כדי שנוכל להתבונן ולכמת את אוכלוסיית התאים באמצעות מיקרוסקופ פלורסנט הפוך. המפגש תאים, המוגדר כאזור שמכוסה על-ידי תאים, נמדד בכל מיקרובית גידול במסגרות זמן שונות, שניתנו לו סף עוצמה שנבחר על תמונות הפלורסנט באמצעות פיג'י15. עקומות הגדילה של תאים בכל תנוחה שנבחרה מותווים באיור 4. העמדות הנבחרות פזורות על פני השבב, מהאזור שליד קודקוד התקשורת הנכנס לפיסגה הקרובה לאמצעי התקשורת.

הצמיחה עקומות באיור 4ב מיושר היטב, מציע את הזהות של פרופיל הפצת התא כפונקציה של מיקום על פני השבב. השיפוע הראשוני של העיקולים חושף את קצב ההתפשטות. זמן ההכפלה של תאים במכשיר הוא סביב 24 שעות כפי שמוצג באיור 4ב מזמן 0 עד 24 שעות, שהוא זהה לזמן ההכפלה ב cultureware הקונבנציונלי13. לפיכך, אנו מסיקים כי ללא נוכחות של מקור מתח חיצוני, הגורמים הפיזיים והביוכימיים מופצים בצורה אחידה, המובילה לצמיחת התאים הומוגנית והאופטימיזציה מזמן 50 עד 100 שעות.

אנו שוקלים עוד לשקול את היכולת לכמת דינמיקה של תאים בין אוכלוסיות משנה של מיקרואקולוגיה. GFP-הביע PC3-חובש ושורות התא המבטא PC3-אפי היו שיתוף תרבותי ב-EA כפי שמוצג באיור 5. זרימה תאית, המוגדרת כאחוז השטח המכוסה על-ידי התאים, נמדדת כאינדיקציה לגודל האוכלוסיה. החל מ40, התרבות המשותף צמחה באופן מלא תוך 3 ימים. מעניין, אנחנו יכולים לצפות את ההתקדמות של כל הפנוטיפ ב מיקרוסביבה. בעוד עקומת הצמיחה של המפגש הכולל הוא בצורה של מודל הצמיחה הלוגיסטית, האוכלוסייה של PC3-פרמדיק המשיכה להתרחב ו-PC3-אפינפרין דוכאו בשלב האסימפטוטית.

הפגנה בעלת שיטת תנועתיות תאים באוכלוסייה מעורבת
תנועתיות תאים היא. התנהגות מאוד חשובה התפלגות התנועתיות של אוכלוסיה יכולה לספק מידע לגבי האינטראקציה הפיזית של התאים, התכונות המכאניות של מיקרואקולוגיה המקומית, וניתן לעיתים לנתח אותן כאינדיקציה לווריאציה של תאים. בהתחשב בעובדה שפלטפורמת התרבות הסלולרית המשופרת שלנו מאפשרת דימות מתמשך כמעט, היתרון של הרזולוציה הטמפורלית העדינה מגדיל את הפוטנציאל של מעקב תאים בודד באוכלוסיה הטרוגנית.

אנו משתמשים the plugin TrackMate16 בפיג (http://fiji.sc) עם מאקרו מותאם אישית כדי ליישם ולהפוך את תהליך המעקב. TrackMate מאפשר למשתמש ליישם ולהתאים אישית אלגוריתם מעקב באמצעות שפת scripting מעורך סקריפט פיג'י. תהליך המעקב מחולק לסידרת שלבים: הפילוח, הסינון ותהליכי הקישור לחלקיקים.

כפי שמוצג באיור 6B, ביצעו "שיטת ריפוי הפצע" כהדגמה ללימוד תא הגירה קולקטיבית ואינטראקציה תא תא. התאים הPC3-אפי ו-PC3-החובשים היו בצפיפות במרכז המכשיר והורשו להגר בחופשיות לעבר אזור ריק. ההיסטוגרמה המנורמלת של המהירות של שני פנוטיפים מותוות באיור 6ג. המהירות של PC3-פרמדיק היה גבוה באופן משמעותי PC3-אפינפרין על-ידי גורם של 1.8 x, אשר מתאים לעובדה כי הפנוטיפים mesenchymal משמש מרכיב של ריפוי הפצע עורית עם יכולת יוצאת דופן להעביר בניגוד לזהובה .

יתרה מזאת, כדי להתבונן בהתקדמות של תנועתיות תאים בסביבה נטולת לחץ, ביצעו תרבות שיתוף ארוכת טווח של PC3-אפינפרין ו-PC3-חובש עם צפיפות אחידה של זריעה ומעקב אחר התפלגות מהירות התא המשתנה עם הזמן. כפי שמוצג באיור 7א, ב, לאחר 6 ימים של תרבות, כאשר התאים הגיעו למפגש גבוה יותר, ההפצות של מהירות התא עבור שני פנוטיפים רכן לכיוון זנבות שמאל.

אנו עשויים להשוות את היחס של מספר PC3-אפינפרין ל-PC3-החובשים בכל מרווח מחלקה. כפי שמוצג באיור 7C, ללא קשר לימי התרבות או הצפיפות של התאים, PC3-החובשים שלטו באזור במהירות גבוהה בעוד PC3-אפינפרין כבשו את אזור המהירות הנמוכה. למרות המהירות הכוללת ירד באופן משמעותי עבור שני פנוטיפים, PC3-החובש נשאר נעים והוא הושפע פחות על ידי המונים של הסביבה מיקרו כמוצג באיור 7D. המהירות הממוצעת של PC3-אפינפרין ירדה ב-40% בזמן שPC3-חובשים הורידו רק 14%.

ישנם מספר גורמים שיכולים להשפיע על התפלגות מהירות התא והמהירות הממוצעת, כגון מעוגלות האוכלוסיה. מעקב אחר תאים וניטור רציפים על כל אוכלוסיית המשנה חיוני כדי להבין את ההתקדמות של התנהגות פנוטימית. לדוגמה, אם היינו רוצים לכמת את הרמה של מעמד mesenchymal של אוכלוסיית משנה ללא תווית, זה יהיה יותר אינפורמטיבי לרכוש לא רק את התפלגות הכמות הפיזית (למשל, מהירות) של האוכלוסיה המעוניינים כפונקציה של זמן, אך גם של כל שאר אוכלוסיית המשנה הקיימת של תאים.

Figure 1
איור 1: שבב המיקרו-משאבה מונחה-משאבת המיקרופלואידים. (א) המכשיר microflu, יש שני מפרידים נפרדים בינוניים, שתי שקעים, ויציאה אחת מרכזית עבור שזריעת תאים או הפקת מדיום מוגזמת. שימו לב כי בין ההפוגות המדיום לבין מערכי תרבות התא, זוג ערוצי הסרפנטיין המאפשרים למדיום להתמצא עם האטמוספירה העוברת מתחת לקרום חדירות הגז. (ב) דור הדרגתי. מזרקים לשאוב את המדיום עם ~ 0.1 מ"מ של fluorescein ואין fluorescein בהתאמה לתוך השבב דרך 2 בינוני אינלטס בצד ימין, הופק מן השבב ב 2 שקעים בינוניים בצד שמאל. הריכוז של fluorescein הוא פרופורציונלי לעוצמת האות הפלואורסצנטית, והוא הפרופיל ליד המאפשרים/שקעים בינוניים וקרוב למרכז b. איור שוחזר עם אישור לין ואח '. 201712. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: הרכיבים של צלחת מותאמת אישית 3 היטב לדוגמה. (א) הגוף העיקרי של 3 טוב צלחת; (ב) זוג ערוצי גז המאפשרים אווירה ממוזגת להיות נשאב ו פרקו דרך septa בכניסה של ערוצי הגז; (ג) טבעת O שנועדה לאטום את החלל בין צלחת הבאר לבין המנה הניתנת לחדירות הגז; (ד) מיכל התרבות החדיר של הגז בקוטר 35 מ"מ; (ה) מחזיק הכלים; (ו) התקן pdms; (g) מחזיקי שבב pdms; (ח) השכבה הכפולה 35 זכוכית מסוג mm המיועדים לשמור על בידוד תרמי ולמנוע עיבוי מים; (i) מחזיק חלון זכוכית; (j) חימום רפידות; (k) חיישן טמפרטורה; (l) איטום דבק שמחזיק את השבב מתייבש. איור ששוחזר באישור לין ואח '. 201712. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: הדמות הסכמטית של הכיוונון הניסיוני. כיוונון הניסוי, כולל מערכת אספקת הגז, ערוצי הגז, חיבור האספקה הבינונית ומערכת ההדמיה. איור ששוחזר באישור לין ואח '. 201712. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: עקומות גדילה של PC3 ב-EA ללא מתח. PC3 היו מתורבתים ב-EA ללא נוכחות של מתח חיצוני. (א) תבנית של EA עם תוויות מיקום. (ב) הצמיחה עקומות של PC3 בעמדות שנבחרו במונחים של זרימה תא. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: שיתוף התרבות של PC3-אפינפרין ו PC3-חובשים ב EA ללא מתח. PC3-אפינפרין (אדום) ו-PC3-חובש (ירוק) היו שיתוף תרבותי ב-EA ללא נוכחות של מתח חיצוני. (א) כיסוי של שני ערוצי פלורסנט ב t = 0 h. (ב) תמונת פלורסנט נלקח ב t = 95 h. (ג) הצמיחה עקומות במונחים של המפגש התא. הזרימה התאית של כל סוג תא נמדדה בשבב כולו. כל נקודת נתונים מייצגת את המפגש התא הממוצע ב-3 נקודות זמן רצופות שצולמו במרווחים של 15 דקות. קווי השגיאה מייצגים את סטיית התקן של המפגש בין תאים ב-3 נקודות הזמן הרצופות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 6
איור 6: שיטת תנועתיות תאים באוכלוסיה מעורבת. הפגנה של ביצועי מעקב אחר תא בודד באוכלוסיה מעורבת. (א) הפגנה של אופן הזיהוי של תאים לפי פילוח של לפלאיאן מגאוסיאני (LoG). העיגולים מציינים את מיקום התאים שזוהו על-ידי האלגוריתם LoG. התאים שזוהו מקושרים ממסגרת למסגרת בהתבסס על בעיית ההקצאה הליניארית כדי לכמת תנועתיות תאים. (ב) "שיטת ריפוי הפצעים" של ניסוי PC3-אפי ו-PC3-חובש. תאים הופרה באופן מקומי עד 100% המפגש עם גבול ברור במרכז. לאחר ההתקנה של שבב EA, התאים נצפו להעביר דרך מערך מיקרוביטאט כפי שצוין על ידי החצים הלבנים. (ג) היסטוגרמה מנורמלת של תא לתנועתיות. PC3-חובש הוא מהיר יותר PC3-אפינפרין על-ידי גורם של 1.8 x. קווי השגיאה מייצגים את סטיית התקן של 5 דוגמאות ניסוי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 7
איור 7: שיטת התנועתיות של תרבות משותפת ארוכת טווח של PC3-אפי ו-PC3-פרמדיק. שיתוף תרבות לטווח ארוך של PC3-אפינפרין ו-PC3-חובש עם צפיפות מדים הראשונית זריעה. התפלגות מהירות התא משתנה עם הזמן. (A) התפלגות מנורמלת של מהירות התא ביום 2. (ב) התפלגות מנורמלת של מהירות התא ביום 6. (ג) יחס של מספר PC3-אפינפרין לPC3-חובש בכל מרווח מחלקה. (ד) מהירות ממוצעת של PC3-אפי ו-PC3-חובש כפונקציה של זמן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

תרבות התא קונבנציונאלי פותחה כמעט לפני מאה שנה והוא נשאר המודל הנפוץ ביותר טרום קלינית במחקר ביו, למרות היכולת המוגבלת שלה מוכחת לחזות תוצאות קליניות סרטן17. דגמי בעלי חיים מציעים את הרלוונטיות הפיזיולוגית הגבוהה ביותר והדמיון הגנטי הסביר לבני האדם, אך זמן רב הכירו במגבלות משמעותיות בחיזוי התוצאות האנושיות18. בין כל הדגמים הקיימים פרה, סרטן מיקרופלואידיג-על שבב מודלים להיראות המועמד המבטיח ביותר כדי לספק את הצורך קליניות במחקר סרטן9,19,20. עם זאת, הנוכחי סרטן על שבב מודלים עדיין להציע פלטפורמה כי הוא מסוגל לשכפל רכיבים מרכזיים ואינטראקציות לחקות מיקרוסביבה הגידול באופן מקיף, עדיין מספיק פשוט כדי לספק נתונים כמותיים אמין ומתרבה. נתוני הנציג שלנו מדגימים כי טכנולוגיית התאים המיקרופלואידיג שלנו מספקת תנאים פיזיים וביוכימיים יציבים לתרבות תא ארוכת טווח הטרוגנית במיקרוסביבות מיקרו. זו פלטפורמה משולבות מאפשר התאמה מתוחכמת של מעבר הדרגתי כימי תלוי זמן, כמו גם הרכב גז סביבתי. הפלטפורמה היא ניידת ותואמת את רוב מיקרוסקופ הפוך פלורסנט עבור הדמיה בזמן אמת ברזולוציה גבוהה, אשר מציעה מידע רב מימדית של תאים כפונקציה של זמן, כולל מורפולוגיה התא, דינמיקה האוכלוסייה, תא תנועתיות והעברת תאים ברמה של תא בודד.

לעומת העבודה הקודמת שלנו11, אנו מודעים לכך האריזה הלחץ-איטום ושיטת ההרכבה עבור התקן microfluidic שלנו מאפשר מספר רב של יכולות ניסוי במורד הזרם (למשל, facs, חילוץ המטטבולייט מקומי, אוכלוסיות תת שבטים התרחבות, IF, דנ א/דגי RNA, וכו '. משלימה את התמונות מעידה בזמן שצולמו במהלך הניסויים. יכולת זו של הסרת תאים ממיקומים ספציפיים בתרבות הטרוסוגני היא מקדמה גדולה בהשוואה למכשירים קודמים, שבו משטח איטום לשבב היה צריך להיות מוסר לפני שאחד יכול לגשת לתרבות11. יתר על כן, גם במקרה זה, הפעולה של הסרת המכסה הפריעו באופן משמעותי את התרבות, כך בדיקות מקומיות של תאים על בודד עד כמה רמות הגידול לא היה אפשרי. הוצאה מקומית כזאת הייתה אפשרית במקרה שלנו בשל האופי הרך "מאפשר" מחדש של קרום חדירות הגז הגמיש.

קיימים מספר שלבים קריטיים בפרוטוקול המוצג. קודם כל, כדי ליזום ניסוי ארוך טווח עם דינמיקה פלואידיסי יציבה, מיקרו בועות צריך להימנע ככל האפשר. לכן, חשוב לחמם מראש ולדגה את מדיום התרבות (שלב 3.4.2) לפני טעינת המדיה לתוך מזרקים. מניפולציה של מדיה טעינה וחילוק צריך להיעשות באיטיות ובעדינות כדי למנוע היווצרות בועה. דפוס PDMS צריך להיות מטופלים עם פלזמה חמצן (שלב 3.4.3) לפני ההתחברות למערכת התקשורת התרבות הספק. הטיפול בפלזמה חמצן מבטיח את הhydrophilicity של משטח PDMS ומפחית באופן משמעותי את האפשרות של מיקרובועה entrapping. בשלב 3.4.7., כאשר הצבת השבב על גבי קרום התרבות התא, שבב PDMS צריך לגשת למשטח הנוזלי עם זווית להטות 15 מעלות כדי להיפטר בועות (אם בכלל) על משטח נוזלי בתוך הצלחת התרבות. שנית, שיטת איטום הלחץ דורש מערכת אספקת גז יציבה הלחץ על קרום התרבות התא. הלחץ צריך להיות מוגדר בין 0.2 עד 0.6 psi. הלחץ נמוך מ 0.2 psi אינו מספיק עבור איטום שבב. מעל 1.2 psi, כמות משמעותית של גז היה מחלחל דרך קרום וליצור בועות בתוך דפוס microfluidic. אנו מודעים לכך, אם המרכיבים של המתכת 3-באר הצלחת לא מורכבים כראוי (כולל את הגוף צלחת, מחזיק גז חדיר הצלחת התרבות, מחזיק שבב PDMS, מחזיק חלון זכוכית, O-טבעות, וזוג 35 מילימטר זכוכית), אחד היה לזהות דליפת גז כמו קריאת הלחץ לא תהיה מגיבה להגדלת זרימת הגז. בעיית דליפה ניתן לפתור פשוט על ידי עשיית בדיקת דליפה ולאחר מכן הרכיב את הרכיבים.

הצורה העיקרית של נתונים שנרכשו עם ניצול של טכנולוגיית EA היא באמצעות דימות. כפי שהוזכר קודם לכן, הטכנולוגיה EA יכול להיות מותקן על כל מיקרוסקופ הפוך. עם זאת, כדי לנצל באופן מלא את היתרונות של המערכת, מומלץ מאוד להתקין את המערכת על מיקרוסקופ פלורסנט הפוכה מצויד בשלב x-y ממונע מלא, כפתור מיקוד מוטורי, תריס ממונע, וקוביית סינון ממונע. כמו כן, שים לב כי המיקוד המושלם עשוי לא להבטיח איכות תמונה מספקת. אנו ממליצים להשתמש בתוכנת דימות המאפשרת רכישת תמונה רב ממדית וסקריפט הדמיה מותאם אישית. שמירה על תמונות ממוקדות היטב יכול להיות מאתגר ללא תקופתי (כל 24 שעות או 48 שעות) הפקודה פוקוס אוטומטי, אשר יצרה משטח מיקוד מותאם אישית במהלך מחזור רכישת תמונה.

הטכנולוגיה המוצגת microfluidic EA מיושם כדי ללמוד את הסתגלות דינמיקה האבולוציה של סרטן הערמונית תא מטאוכלוסיות תחת לחץ כימותרפיות נוף12. כמו כן הדגמנו את הופעתה של תאים סרטניים התנגדות התרופות הענק בגידולים מיקרו-אקולוגיה הטרוגנית כמו גידול, מראה כי הסביבה טרוגניות בשילוב עם הגירה התא בתוך אוכלוסיית הגידול יגרום להגברה על הופעתה של פנוטיפים עמידים13. עם היכולת לשלוט ולנטר את ההתנהגויות של אוכלוסיות מעורבות של תאים סרטניים תחת מעברי לחץ מבוקרת היטב, הטכנולוגיה שלנו מיקרופלואידיג EA עשוי גם לשמש פלטפורמה למחקר מנגנונים הרגולציה ואת הטרנספורמציה פנוטימית המעורבים חובשים בהקשר של אסטרטגיות טיפוליות לסרטן21. אחרון חביב, הציג לחץ איטום שיטת האריזה ניתן גם ליישם במערכות microfluidic אחרים הדורשים התאמה מתוחכמת של הרכב גז הסביבה, כמו גם את היכולות ניסוי במורד הזרם. למשל, אותה שיטת אריזה שימש לשלב דפוס מיקרופלואידיג שונים כדי ללמוד כיצד גלי האוכלוסייה חיידקים הפיץ באמצעות מחסומים פיזיים22.

לסיכום, הדינמיקה של האוכלוסיה הקולקטיבית שונה באופן איכותי מהתנהגויות של תא יחיד. טכנולוגיית EA מיקרופלואידיc מאפשרת לימוד כמותי של הדינמיקה ההתפתחותית והתנהגויות פנותיות בנפרד ובאופן קולקטיבי כפונקציה של זמן. טכנולוגיה זו עשויה להציג רלוונטי יותר מבחינה פיזיולוגית במודל לחקר הסרטן, ועל פוטנציאל פיתוח תרופות טרום קלינית והקרנה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

אין קונפליקטים של עניין מוצהר.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכת על ידי NSF PHY-1659940.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 mL BD Luer-Lok tip syringes BD 14-823-16E
Antibiotic-Antimycotic Sigma-Aldrich A5955 1x anti-anti
AZ 300 MIF Merck KGaA 18441123163 Photoresist developer
AZ1518 Merck KGaA AZ1518 Photoresist
AZ4330 Merck KGaA AZ4330 Photoresist
Cr Chromium Etchant Sigma-Aldrich 651826
Fetal bovine serum (FBS) Life Technologies Corporation 10437028
Heidelberg DWL 66+ laserwriter Heidelberg Instruments DWL66+ Writing photomask
Hexamethyldisilazane (HMDS) Sigma-Aldrich 379212 For photoresist adhesion enhancement
Hollow steel pins New England Small Tube NE-1300-01  .025 OD .017 ID x .500 long / type 304 WD fullhard
ibidi Heating System, Multi-Well Plates, K-Frame ibidi 10929 On-stage incubator 
Luer-Lok 23 G dispensing needle McMaster-Carr 75165A684 To connect syringes and tubings
Lumox dish 35 Sarstedt 94.6077.331 Gas-permeable cell culture dish
Microposit Remover 1165 Dow Electronic Materials Microposit Remover 1165 Photoresist stripper
Microseal B Adhesive Sealer Bio-Rad Laboratories MSB1001 Adhesive sealer
O-Ring (for Lumox plate sealing) McMaster-Carr 9452K114 Dash No. 27; 1-5/16" ID x 1-7/16" OD; Duro 70
O-Ring (for bottom glass window sealing) McMaster-Carr 9452K74 Dash No. 20; 7/8" ID x 1" OD; Duro 70
Plasma-Preen Plasma Cleaning/Etching System Plasmatic Systems, Inc Plasma-Preen Oxygen plasma system
RPMI 1640 Life Technologies Corporation 11875-093
Samco RIE800iPB DRIE Samco RIE800iPB Deep reactive-ion etching system
Suss MA6 mask aligner SUSS MicroTec MA6 Mask aligner 
Sylgard 184 Silicone Elastomer Fisher Scientific NC9285739 PDMS elastomer
TePla M4L plasma etcher PVA TePla M4L Plasma etcher
Trichloro-1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl-silane (PFOTS) Sigma-Aldrich 448931 For silicon wafer silanization
Tygon microbore tube (0.020" x 0.060"OD) Cole-Parmer EW-06419-01 Tubings for media delivery

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Meacham, C. E., Morrison, S. J. Tumour heterogeneity and cancer cell plasticity. Nature. 501 (7467), 328-337 (2013).
  2. Whiteside, T. L. The tumor microenvironment and its role in promoting tumor growth. Oncogene. 27 (45), 5904-5912 (2008).
  3. Lambert, G., et al. An analogy between the evolution of drug resistance in bacterial communities and malignant tissues. Nature Reviews Cancer. 11 (5), 375-382 (2011).
  4. Tannock, I. F., Lee, C. M., Tunggal, J. K., Cowan, D. S., Egorin, M. J. Limited penetration of anticancer drugs through tumor tissue: a potential cause of resistance of solid tumors to chemotherapy. Clinical Cancer Research. 8 (3), 878-884 (2002).
  5. Grantab, R. H., Tannock, I. F. Penetration of anticancer drugs through tumour tissue as a function of cellular packing density and interstitial fluid pressure and its modification by bortezomib. BMC Cancer. 12, 214 (2012).
  6. Fu, F., Nowak, M. A., Bonhoeffer, S. Spatial Heterogeneity in Drug Concentrations Can Facilitate the Emergence of Resistance to Cancer Therapy. PLoS Computational Biology. 11 (3), e1004142 (2015).
  7. Bogorad, M. I., et al. In vitro microvessel models. Lab on a Chip. 15 (22), 4242-4255 (2015).
  8. Caballero, D., et al. Organ-on-chip models of cancer metastasis for future personalized medicine: From chip to the patient. Biomaterials. 149, 98-115 (2017).
  9. Caballero, D., Blackburn, S. M., De Pablo, M., Samitier, J., Albertazzi, L. Tumour-vessel-on-a-chip models for drug delivery. Lab on a Chip. 17 (22), 3760-3771 (2017).
  10. Zhang, Q., et al. Acceleration of emergence of bacterial antibiotic resistance in connected microenvironments. Science. 333 (6050), 1764-1767 (2011).
  11. Wu, A., et al. Ancient hot and cold genes and chemotherapy resistance emergence. Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (33), 10467-10472 (2015).
  12. Lin, K. C., et al. Epithelial and mesenchymal prostate cancer cell population dynamics on a complex drug landscape. Convergent Science Physical Oncology. 3 (4), 045001 (2017).
  13. Lin, K. C., et al. The role of heterogeneous environment and docetaxel gradient in the emergence of polyploid, mesenchymal and resistant prostate cancer cells. Clinical & Experimental Metastasis. 36 (2), 97-108 (2019).
  14. Roca, H., et al. Transcription factors OVOL1 and OVOL2 induce the mesenchymal to epithelial transition in human cancer. PloS One. 8 (10), e76773 (2013).
  15. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  16. Tinevez, J. Y., et al. Trackmate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
  17. Caballero, D., et al. Organ-on-chip models of cancer metastasis for future personalized medicine: From chip to the patient. Biomaterials. 149, 98-115 (2017).
  18. Akhtar, A. The flaws and human harms of animal experimentation. Cambridge Quarterly of Healthcare Ethics. 24 (4), 407-419 (2015).
  19. Sontheimer-Phelps, A., Hassell, B. A., Ingber, D. E. Modelling cancer in microfluidic human organs-on-chips. Nature Reviews Cancer. 19 (2), 65-81 (2019).
  20. Bogorad, M. I., DeStefano, J., Karlsson, J., Wong, A. D., Gerecht, S., Searson, P. C. Review: in vitro microvessel models. Lab on a Chip. 15, 4242-4255 (2015).
  21. Zañudo, J. G. T., et al. Towards control of cellular decision-making networks in the epithelial-to-mesenchymal transition. Physical Biology. 16 (3), 031002 (2019).
  22. Morris, R. J., et al. Bacterial population solitary waves can defeat rings of funnels. New Journal of Physics. 19 (3), 035002 (2017).

Tags

Bioengineering סוגיה 151 microfabrication מיקרו סרטן על-ידי-שבב מיקרוסביבה הגידול כימותרפיה הדרגתי התנגדות תא הגירה
הדור של מעברי מדרגות של סמים הטרוגנית ברחבי אוכלוסיות סרטן על מאיץ האבולוציה Microfluidic להתבוננות בזמן אמת
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lin, K. C., Torga, G., Sun, Y.,… More

Lin, K. C., Torga, G., Sun, Y., Pienta, K. J., Sturm, J. C., Austin, R. H. Generation of Heterogeneous Drug Gradients Across Cancer Populations on a Microfluidic Evolution Accelerator for Real-Time Observation. J. Vis. Exp. (151), e60185, doi:10.3791/60185 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter