Summary
Wir präsentieren ein mikrofluidisches Krebs-on-Chip-Modell, die "Evolution Accelerator"-Technologie, die eine kontrollierbare Plattform für langfristige Echtzeit-quantitative Studien zur Krebsdynamik innerhalb klar definierter Umweltbedingungen an der Einzelzelle bietet. niveau. Es wird erwartet, dass diese Technologie als In-vitro-Modell für die Grundlagenforschung oder die präklinische Arzneimittelentwicklung funktioniert.
Abstract
Die konventionelle Zellkultur bleibt das am häufigsten verwendete präklinische Modell, trotz seiner nachgewiesenen begrenzten Fähigkeit, klinische Ergebnisse bei Krebs vorherzusagen. Mikrofluidische Krebs-on-Chip-Modelle wurden vorgeschlagen, um die Lücke zwischen den zu vereinfachten konventionellen 2D-Kulturen und komplizierteren Tiermodellen zu überbrücken, die nur begrenzt in der Lage sind, zuverlässige und reproduzierbare quantitative Ergebnisse zu erzielen. Hier stellen wir ein mikrofluidisches Krebs-on-Chip-Modell vor, das Schlüsselkomponenten einer komplexen Tumormikroumgebung umfassend reproduziert, aber einfach genug ist, um robuste quantitative Beschreibungen der Krebsdynamik zu liefern. Dieses mikrofluidische Krebs-on-Chip-Modell, der "Evolution Accelerator", zerlegt eine große Population von Krebszellen in eine miteinander verbundene Reihe von Tumor-Mikroumgebungen und erzeugt gleichzeitig eine heterogene chemotherapeutische Stresslandschaft. Das Fortschreiten und die evolutionäre Dynamik von Krebs als Reaktion auf den Arzneimittelgradienten können wochenlang in Echtzeit überwacht werden, und zahlreiche nachgelagerte Experimente können komplementär zu den Zeitrafferbildern durchgeführt werden, die im Laufe der Experimente aufgenommen wurden.
Introduction
Krebs wird zunehmend als komplexes Ökosystem anerkannt, das nicht nur von der anhaltenden Dysregulation mutierter Zellpopulationen abhängt, sondern auch von lebenswichtigen Wechselwirkungen zwischen Krebszellen und der Mikroumgebung des Wirts. In diesem Sinne entwickelt sich Krebs auf einer adaptiven Landschaft, die sich durch eine Kombination von Faktoren manifestiert, einschließlich einer heterogenen Tumormikroumgebung und Übersprechen mit einer Vielzahl von Wirtszellen, die alle selektive Drücke für weitere genetische oder epigenetische Veränderungen1,2,3. Im Zusammenhang mit soliden Tumoren trägt die ungleichmäßige Verteilung von Chemotherapeutika und anderen Ressourcengradienten zu ihrer molekularen Heterogenität bei und kann eine Rolle bei der Entwicklung von Arzneimittelresistenzen, erhöhter Angiogenese auf bestimmte Tumortumoren spielen. Subpopulationen und sogar Metastasen4,5,6. Herkömmliche In-vitro-Zellkulturstudien in einer großen, bequemen Experimentellen Kapazität verfügen d.B. bieten mittlere Feld-, Gleichmäßig- und Fixbedingungen, wobei oft die genaue räumliche und zeitliche Umweltkontrolle fehlt, die notwendig ist, um wirklich in vivo Tumordynamik zu emulieren. Daher sind repräsentativere Ex-vivo-Modelle erforderlich, um die Tumormikroumgebung vor Tiermodellen in der Arzneimittelentwicklungspipeline zu reproduzieren, um eine bessere Vorhersage der Krebsprogression sowie Reaktionen auf Medikamente innerhalb dynamischer Belastungen zu erhalten. Landschaften. Mikrofluidik wurde vorgeschlagen, um die Lücke zwischen 2D-Zellkulturstudien und komplexeren in vivo Tierstudien zu überbrücken, die möglicherweise nicht in der Lage sind, kontrollierbare quantitative Studien7,8,9zu unterstützen.
Ein ideales In-vitro-System zur Charakterisierung der Krebszelldynamik sollte die Fähigkeit besitzen, eine heterogene Mikroumgebung zu erzeugen, um die adaptiven zellulären Reaktionen nachzuahmen, die in einem Tumor stattfinden können, und die Beobachtung dieser Dynamik an einem Einzelzellenauflösung. In diesem Artikel beschreiben wir eine plattform für die mikrofluidische Zellkultur, ein PDMS-basiertes Gerät namens "Evolution Accelerator" (EA), das parallele In-vitro-Studien der Krebszelldynamik bei zellulärer Auflösung mit Echtzeit-Datenerfassung über die Wochen, unter stabiler Aufrechterhaltung von Stressgradienten in der gesamten Kulturlandschaft. Das Design dieser Plattform basiert auf unserer bisherigen Arbeit, in der die evolutionäre Dynamik von Organismen in einer Metapopulation beschleunigt werden kann10,11. Insbesondere in einer Gruppe von räumlich getrennten Populationen, die auf einer gewissen Ebene interagieren, können die am besten geeigneten Arten in einer lokalen Population schneller dominieren als eine große einheitliche Population. Die vorteilhafte Art wandert dann auf der Suche nach Ressourcen und Raum in benachbarte Mikrohabitate und dominiert schließlich die gesamte Population. Wie in Abbildung 1dargestellt, besteht das Muster des mikrofluidischen EA-Chips aus (i) einem Paar Serpentinkanäle, die eine Frischmedienzirkulation ermöglichen und feste Randbedingungen für die chemische Diffusion konstruieren, und (ii) der sechseckigen Zellkulturregion die aus 109 miteinander verbundenen sechseckigen und 24 halbsechseckigen Kammern in der Mitte besteht, die einer Wabenstruktur ähneln. Der Chip ist 100 m tief. Medienkanäle und Zellkulturbereich sind mit kleinen Schlitzen (ca. 15 m Breit) verbunden, die einen direkten Medienfluss und die daraus resultierende Scherspannung im Zellkulturbereich verhindern und dennoch Chemikalien durch kleine Schlitze diffundieren und Nährstoffe austauschen können. Stoffwechselabfälle usw. Die Erzeugung chemischer Gradienten wird in Abbildung 1Bdargestellt, wo ein Medienkanal 0,1 mM Fluorescein enthält, während der andere Kanal frei von Fluorescein ist. Die Zellen werden auf einer gasdurchlässigen Membran kultiviert, die durch die Mikrostrukturen durch den positiven Gegendruck auf die Membran gegen den Chip eingekapselt wird. Die Komponenten des Gerätehalters sind in Abbildung 2dargestellt, und der Versuchsaufbau ist in Abbildung 3dargestellt, wo die Kultur auf einem invertierten Mikroskop bei 37 °C, mit über 85 % relativer Luftfeuchtigkeit, gepflegt und unter Normoxia-Gaszusammensetzung.
Dieses System bietet eine detaillierte Beobachtung lokalisierter zellulärer Wechselwirkungen über Hellfeld- und Fluoreszenzkanäle und ermöglicht räumlich aufgelöste downstream Assays wie Immunfluoreszenz, Western Blot oder Massenspektrometrie. Wir haben zuvor als Proof-of-Prinzip dieses mikrofluidischen Krebs-on-Chip-Modells auf die langfristige Co-Kultur von epitheliale und mesenchymalePC3 Prostatakrebszellen12 sowie die Entstehung von drogenresistenten polyploiden Riesen Krebszellen mit der epitheliale PC3-Zelllinie13. Während wir die Anwendung dieser Plattform präsentieren, um die raumzeitliche Dynamik von epitheliaalen PC3- und mesenchymalen Prostatakrebszellen unter einem Spannungsgradienten von Docetaxel zu verstehen, kann das mikrofluidische System leicht auf eine beliebige Kombination von Zelllinien angewendet werden. Ressourcen (d. h. Drogen, Nährstoffe, Sauerstoff) Gradienten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Herstellung von mikrofluidischen Geräten
- Generieren Sie das gewünschte mikrofluidische Muster mit einer Layout-Design-Software (siehe Ergänzende Materialien).
- Fertigen Sie die Fotomaske. Weitere Informationen finden Sie unter Tabelle der Materialien.
- Mit einem Laser-Schreiber, schreiben Sie das Muster auf eine Soda-Kalk-Glasplatte mit 100 nm Cr und 500 nm Photoresist AZ1518 beschichtet.
- Entwickeln Sie den photoresist mit Entwickler AZ300MIF für 60 s.
- Das Chrom ohne Schutz vor dem Photoresist mit Cr-7 Chromium Etchant abzweige.
- Rest-Photoresist mit einem photoresist bei 70 °C für 45 min abstreifen.
- Mustern Sie den Photoresist. Weitere Informationen finden Sie unter Tabelle der Materialien.
- SpinCoat HMDS auf Siliziumwafer bei 4000 U/min für 40 s.
- Spin Mantel Photoresist AZ4330 auf Silizium-Wafer bei 4000 U/min für 40 s.
- Den Siliziumwafer bei 95 °C für 60 s weich backen.
- Verwenden Sie den Maskenaligner, um UV dem Siliziumwafer auszusetzen.
- Entwickeln Sie den photoresist mit Entwickler AZ300MIF für 4 min.
- Führen Sie DRIE-Ätzen durch. Weitere Informationen finden Sie unter Tabelle der Materialien.
- Trocknen Sie den mit dem Photoresist gemusterten Wafer mit einem Silicon Deep Reactive Ion Etching (DRIE) System für eine Tiefe von 100 m.
- Entfernen Sie den Photoresist mit Aceton und Plasmaätz mit einem Plasma-Etcher.
- Waferoxidation und Silanisierung. Weitere Informationen finden Sie unter Tabelle der Materialien.
- Thermische Oxidation auf dem geätzten Siliziumwafer in einem Ofen bei 1100 °C für 1 h durchführen.
- Warten Sie, bis der Siliziumwafer abgekühlt ist, und legen Sie den Wafer dann in einen Trockenbau mit ein paar Tropfen Trichlor-1H,1H,2H-2H-Perfluoroctyl-Silan (PFOTS), der in einem kleinen Behälter in der Nähe des Wafers tropft.
- Pumpen Sie den Druck des Trockenators auf 0,5 atm bei Raumtemperatur für 60 min. Die Siliziumwaferform sollte nach der richtigen Silanisierung hydrophob werden, die durch Zugabe mehrerer Wassertröpfchen auf den Wafer getestet werden kann.
- Weiche Lithographie. Weitere Informationen finden Sie unter Tabelle der Materialien.
- Vorpolymer und Verkreuzer (aus Polymethylsiloxan (PDMS)-Kit) mit einem Gewichtsverhältnis von 10:1 mischen.
- Gießen Sie das gemischte PDMS, um eine 10 mm-Folie in der Höhe auf die silanisierte Siliziumwaferform zu erzeugen.
- Entgasen Sie das resultierende PDMS-Silizium-Wafersystem in einem Trockenmittel für 30 min bis 1 h.
- Inkubieren Sie den PDMS-Silizium-Wafer über Nacht in einem 70 °C-Inkubator, um das PDMS auszuhärten.
- Sobald das PDMS ausgehärtet ist, schälen Sie den PDMS-Film vorsichtig vom Siliziumwafer ab.
- Mit Biopsienadeln durchstanzen Sie Durchbohrungen an den Einlassöffnungen basierend auf der Position des Musters auf dem PDMS und schneiden Sie mit einem kreisförmigen Stempel Späne mit einem Durchmesser von 27 mm.
- PDMS-Schichtbindung.
- Wärmehärten Sie zwei Stapel von 27 mm PDMS-Zylindern (ohne Muster), die zur Reservoirschicht und zur Verschlussschicht des Geräts werden.
- Schneiden Sie zwei 7 mm Kreise um die Einlässe auf der Reservoirschicht aus und verwenden Sie eine Biopsienadel, um Durchbohrungen an den Einlassöffnungen auf der Verschlussschicht zu stanzen.
- Verkleben Sie drei Stapel PDMS (gemusterter Stapel, Reservoirschicht, Verschlussschicht) mit Sauerstoffplasmabehandlung.
- Mit der Biopsienadel durchstanzen Löcher an den Auslässen und am Mittelanschluss des Gerätes.
2. Medien- und Zelllinienvorbereitung
- Bereiten Sie Medien für die Kultivierung von PC3-Zelllinien vor, einschließlich PC3-EMT und PC3-EPI: Mischen Sie RPMI 1640 medium mit 10% fetalem Rinderserum (FBS) und 1x Antimykotik. Generieren Sie Zelllinien wie zuvorbeschrieben 14.
HINWEIS: PC3-Zelllinien werden in den obigen Medien in befeuchteten Inkubatoren bei 37 °C mit 5%CO2gehalten. Teilen Sie Zellen und Subkultur alle 3 Tage, bevor sie 100% Konfluenz erreichen. - Transfekte Zelllinien mit zytoplasmatisch-markierten Fluoreszenzmarkern zur besseren Visualisierung, wie zuvorbeschrieben 12, so dass PC3-EMT zytoplasmatisches GFP ausdrückt und PC3-EPI zytoplasmatischem mCherry ausdrückt. Beachten Sie, dass die Technologie auch mit allen fluoreszierend gekennzeichneten Zellen sowie mit hellfeldgeographierten Zellen kompatibel ist.
3. Versuchsaufbau
- Herstellung von Metallplattenhalter
- Fertigen Sie einen Plattenhalter, der ausreicht, um gleichzeitig gasdurchlässige Kulturgerichte für parallele Experimente durch Bearbeitung oder 3D-Druck zu halten. Die 3D-CAD-Datei ("3-Well-Platte. FCStd") finden Sie auf GitHub als Referenz (https://github.com/kechihl/3-well-plate).
- Lösen Sie die Komponenten des Halters(Abbildung 2) mit einem Schraubendreher. Desinfizieren Sie die Komponenten über UV-Belastung für mindestens 1 h und lassen Sie sie in einer sterilen Umgebung.
HINWEIS: Der Halter ist so konzipiert, dass er wesentliche Bedingungen für das thermische Gleichgewicht und ideale Gaszusammensetzungen bietet, mit Gaskanaleinlässe, die einen Luftstrom ermöglichen. Weitere Informationen finden Sie in unserer vorherigen Arbeit12. - Bereiten Sie bis zu drei gasdurchlässige Kulturgerichte zu, von denen die Zellkulturmembran relativ flexibel ist.
- Zelllinien-Seeding
- 24 Stunden vor Beginn des Experiments PC3-EPI und PC3-EMT-Zellen durch Trypsinisierung für 5 min ernten. Vorwarme Kulturmedien hinzufügen, dann bei 150 x g für 3 min zentrifugieren und den Überstand entsorgen.
- Zählen Sie die Zellen jedes PC3-EPI und PC3-EMT mit einem Hämozytometer und isolieren Sie insgesamt 2,5 x 104 jedes Zelltyps für jede gasdurchlässige Kulturschale.
- Mischen und suspendieren Sie die beiden Zelltypen in 2 ml Kulturmedien und säen Sie die Zellen in jede der gasdurchlässigen Kulturschale.
- Lassen Sie den gesamten Plattenhalter über Nacht im Inkubator, damit sich die Zellen anbringen können.
- Desinfizieren Sie die PDMS-Geräte über UV-Belastung für mindestens 1 h und lassen Sie sie in einer sterilen Umgebung.
- Einrichten von Wärmeleiteinheit und Gasversorgungssystem
- Wie in Abbildung 3dargestellt, richten Sie ein Gasversorgungssystem ein, das sowohl aus CO2- als aucho2-Steuergeräten, einer Gaspumpe, einer Gasmischkammer, einem Luftbefeuchter oder Blasen sowie drei separaten Sätzen von Gasventilen und Manometern besteht. Weitere Informationen finden Sie in unserer vorherigen Arbeit12.
- Richten Sie die CO2- und O2-Steuergeräte so ein, dass sie die Mischrate des Gases ausCO2- undN2-Tanks und der O2-Quelle anpassen. Alternativ würde jedes Gasversorgungssystem, das Gas unter Normoxia-Zustand liefert, funktionieren.
- Stellen Sie sicher, dass das Gas, das in der Mischkammer kombiniert und durch einen Blasen so befeuchtet wird, dass die relative Luftfeuchtigkeit um bis zu 85 % erhöht wird (wie aus einem relativen Feuchtigkeitsmonitor ausgelesen) erhöht wird und dass das Gas zu drei unabhängigen Gasventilen mit Manometern führt, um Gasdurchfluss im Plattenhalter zu steuern und zu überwachen.
- Legen Sie den gesamten Plattenhalter in eine inkubationsthermische Steuerung auf der Bühne mit separaten Heizuntereinheiten für den Deckel und die Bodenplatte, wobei alle Einheiten auf 37 °C eingestellt sind. Weitere Informationen finden Sie unter Tabelle der Materialien.
- Installation von mikrofluidischen Geräten. Weitere Informationen finden Sie unter Tabelle der Materialien.
- Identifizieren Sie, dass die detaillierten Komponenten des 3-Well-Plattenhalters in Ordnung sind, wie in Abbildung 2. Jeder der drei Brunnen ist identisch und unabhängig, mit einem Paar Gaskanäle für jeden Brunnen. Jeder Brunnen verfügt über einen gasdurchlässigen Kulturschalenhalter, einen PDMS-Chiphalter, einen Glasfensterhalter und ein Paar 35-mm-Glasfenster. Diese Komponenten können mit den montierten Schrauben montiert werden.
HINWEIS: Die Glasfenster sorgen dafür, dass sich zwischen der gasdurchlässigen Kulturmembran und dem Brunnen ein thermisch isolierter Raum befindet, so dass aufgrund von Temperaturunterschieden an der Schnittstelle keine Wasserkondensation auftritt. Beachten Sie, dass die 3 Brunnen unabhängig sind und 3 Experimente separat durchgeführt werden können. - Vorwarme Kulturmedium bei 37 °C und Entgasen in einer Vakuumkammer für 20 min.
- Behandeln Sie die PDMS-Chips mit einem Sauerstoffplasmasystem für 30 s, um die Hydrophilie aufrechtzuerhalten.
- Richten Sie das Spritzensystem ein. Laden Sie zwei Spritzen langsam mit Wachstumsmedien und zwei weitere Spritzen mit gewünschtem Reagenz von Interesse (Medien, Medien mit Medikament, etc.). Verbinden Sie jede einzelne Spritze mit einem 50 cm Schlauch (0,020" x 0,060"OD) durch eine 23 G Dosiernadel in einem Hohlstahlstift. Setzen Sie einen hohlen Stahlstift in das andere Ende des Schlauches ein.
- Prime die Schläuche und stecken Sie den Stahlstift in jeden PDMS-Chip durch die Verschlussschicht. Füllen Sie die Reservoirschicht auf und befeuchten Sie das PDMS-Musterschichtmuster mit Medien. Die Reservoirschicht funktioniert als Auf-Chip-Blasenfalle, um zu verhindern, dass Luftblasen in das mikrofluidische Muster gelangen.
- Legen Sie eine 1 ml Spritze mit Kulturmedien ein. Schließen Sie die Spritze mit einem 5 cm Schlauch (0,020" x 0,060"OD) durch eine 23 G Dosiernadel in einen Hohlstahlstift ein. Legen Sie einen hohlen Stahlstift in das andere Ende des Schlauches und grundieren Sie die Schläuche.
- Setzen Sie den Hohlstahlstift in das mittlere Loch des Chips ein, wo später während des Spanabdichtungsprozesses übermäßige Medien aus dem Chip herausgezogen werden können.
- Da jedes PDMS-Gerät vier 10 ml Spritzen benötigt, die auf eine Spritzenpumpe geladen werden, laden Sie zwei 10 ml Spritzen pro Chip in das Vorderdeck. Legen Sie die beiden anderen Spritzen in das Entnahmedeck des Spritzensystems.
- Legen Sie den Chip direkt auf die gasdurchlässigen Kulturmembranen (mit Zellen, die bereits an den Membranen haften). Um mikrofluidische Mikroblasen nicht in das mikrofluidische Muster einzuschließen, geben Sie vor der Montage 1 ml vorgewärmte und entgaste Medien in die 35 mm gasdurchlässige Kulturschale aus und stellen Sie dann sicher, dass sich der Chip der flüssigen Oberfläche mit einem Neigungswinkel von 15 Grad nähert.
- Klemmen Sie die gasdurchlässige Kulturschale und den Brunnen im gasdurchlässigen Kulturschalenhalter für jeden Chip, wobei der PDMS-Chiphalter das PDMS-Gerät nach unten drückt.
- Kleben Sie eine Dichtungsplatte auf die Oberseite des PDMS-Geräts und klemmen Sie mit dem PDMS-Chiphalter, um ein Austrocknen des Chips zu verhindern.
- Legen Sie die Mediendurchflussrate um das Array auf 20 l/h fest.
- Stellen Sie die gesamte Platte im Inkubator auf der motorisierten Bühne eines invertierten Mikroskops ein. Schließen Sie das Gasversorgungssystem an die Gaskanäle an und drücken Sie die gasdurchlässige Kulturmembran mit dem installierten PDMS-Chip, um die Abdichtung des Geräts zu gewährleisten. Halten Sie den Messdruck bei 0,2 psi (1,4 x 104 Pa).
- Extrahieren Sie langsam übermäßige Medien im Chip mit der 1-ml-Spritze aus dem mittleren Loch. Beobachten Sie den Chip unter dem Mikroskop beim Extrahieren von Medien und beenden Sie dann das Extrahieren, wenn der Chip versiegelt ist. Die Spanversiegelung sollte selbstverständlich sein, da ein Teil der Zellen von den Mikrostrukturen zerkleinert würde.
- Schließen Sie die Temperaturerfassungseinheit des On-Stage-Inkubators an die 3-Well-Platte an und stellen Sie sie auf 37 °C ein.
- Identifizieren Sie, dass die detaillierten Komponenten des 3-Well-Plattenhalters in Ordnung sind, wie in Abbildung 2. Jeder der drei Brunnen ist identisch und unabhängig, mit einem Paar Gaskanäle für jeden Brunnen. Jeder Brunnen verfügt über einen gasdurchlässigen Kulturschalenhalter, einen PDMS-Chiphalter, einen Glasfensterhalter und ein Paar 35-mm-Glasfenster. Diese Komponenten können mit den montierten Schrauben montiert werden.
4. Einzelzellige Zeitraffer-Bildgebung
- Einrichten einer Bildgebungssoftware mit einem invertierten Mikroskop zur Zeitraffer-Bildaufnahme. Beachten Sie, dass für ein EA-Experiment ein invertiertes Fluoreszenzmikroskop mit vollmotorisierter x-y-Stufe, Fokusknopf, Verschluss und Filterwürfel erforderlich ist.
- Konfigurieren Sie Software, um Bilder über zwei Kanäle mit 10-facher Vergrößerung für jeden Chip mit automatischer Bildnahtung nach einer Runde Autofokus zu erfassen. Beachten Sie, dass automatische Korrektursysteme wie Perfect Focus keine befriedigende Bildqualität garantieren. Es wird eher empfohlen, eine angepasste Fokusoberfläche für die langfristige Bildaufnahme zu generieren, die entweder auf Autofokus oder manuellen Fokus auf dem Chip basiert.
- Nehmen Sie stündlich Bilder auf und lassen Sie das Experiment auf der Zeitskala von Wochen laufen. Überwachen Sie die Bildqualität täglich und aktualisieren Sie bei Bedarf die Fokusfläche.
- Bereiten Sie den PDMS-Chip und die gasdurchlässige Kulturschale für die nachfolgende Immunfluoreszenzanalyse vor, wie zuvorbeschrieben 13.
5. Bildverarbeitung und -analyse
- Nachexperimentelle Verarbeitung
- Konvertieren Sie Bilder in das TIFF-Format für die Bildverarbeitung und Messungen unter Verwendung von Fidschi/ImageJ.
- Komprimieren Sie TIFF-Dateien, um die weitere Bildverarbeitung zu vereinfachen.
- Fidschi/ImageJ-Analyse
- Um Zellen zu identifizieren, führen Sie Hintergrundsubtraktion und Partikelanalyse durch, um fluoreszierende Hellflecken für die Zellpositionserkennung und automatische Zellzählung zu identifizieren.
- Verwenden Sie Plugins (Manual Tracking, Chemotaxis, Migration Tool, Trackmate), um die Beweglichkeit und Migration von Zellen zu analysieren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Validierung des optimalen Zellwachstums auf dem Chip
Ein wichtiges Ziel der Experimentierplattform ist es, Schlüsselkomponenten und Wechselwirkungen in einer komplexen Tumormikroumgebung umfassend zu reproduzieren, aber dennoch einfach genug, um quantitative, zuverlässige und reproduzierbare Daten bereitzustellen. Dieses Ziel kann nur erreicht werden, wenn wir die physikalischen und biochemischen Umweltfaktoren vollständig im Griff haben. Wir müssen entweder die unerwünschten Faktoren ausschließen oder einen Weg finden, die unkontrollierbaren Faktoren in das quantitative Modell zu integrieren, um das Verhalten der Bevölkerung richtig zu interpretieren.
Der erste Test besteht darin, ein optimales Zellwachstum auf dem Gerät zu gewährleisten. Die Zellproliferationsrate auf dem Gerät muss mit ihrem Wachstumsprofil in der konventionellen Zellkultur identisch oder vergleichbar sein. Als Beweis des Prinzips wurden menschliche Prostatakrebs-Zelllinien-PC3-Zellen im PDMS-Chip ohne äußeren Stress kultiviert. Diese Zellen wurden im Zytoplasma fluoreszierend gekennzeichnet, so dass wir die Population der Zellen mit hilfe invertierter Fluoreszenzmikroskopie beobachten und quantifizieren konnten. Der Zusammenfluss von Zellen, definiert als der Bereich, der von Zellen bedeckt ist, wurde in jedem Mikrohabitat zu unterschiedlichen Zeitrahmen gemessen, wobei ein ausgewählter Intensitätsschwellenwert auf den fluoreszierenden Bildern mit Fidschi15angegeben wurde. Die Wachstumskurven von Zellen an jeder gewählten Position sind in Abbildung 4dargestellt. Die gewählten Positionen sind über den Chip verstreut, von der Region in der Nähe der Spitze des Medienzuflusses bis zur Spitze in der Nähe von Medien.
Die Wachstumskurven in Abbildung 4B sind gut ausgerichtet, was auf die Identischigkeit des Zellproliferationsprofils als Funktion der Position über den Chip hindeutet. Die anfängliche Steigung der Kurven zeigt die Proliferationsrate. Die Verdoppelungszeit für Zellen im Gerät beträgt etwa 24 Stunden, wie in Abbildung 4B von der Zeit 0 bis 24 Stunden dargestellt, was der Verdoppelungszeit in herkömmlichen Cultureware13entspricht. Daher kommen wir zu dem Schluss, dass ohne das Vorhandensein einer externen Stressquelle die physikalischen und biochemischen Faktoren gleichmäßig verteilt sind, was zu einem homogenen und optimierten Zellwachstum von 50 bis 100 Stunden führt.
Wir haben ferner die Fähigkeit geprüft, die Zelldynamik zwischen Subpopulationen in einer Mikroumgebung zu quantifizieren. GFP-extierende PC3-EMT und die mCherry-extierbaren PC3-EPI-Zelllinien wurden im EA mitkultiviert, wie in Abbildung 5dargestellt. Der Zellzusammenfluss, definiert als Prozentsatz der von den Zellen abgedeckten Fläche, wird als Angabe der Größe der Grundgesamtheit gemessen. Ab 40 % Zusammenfluss wuchs die Kokultur innerhalb von 3 Tagen vollständig konfluent. Interessanterweise können wir das Fortschreiten jedes Phänotyps in der Mikroumgebung beobachten. Während die Wachstumskurve des Gesamtzusammenflusses in Form eines logistischen Wachstumsmodells erfolgt, wuchs die Population von PC3-EMT weiter und PC3-EPI wurde in der asymptotischen Phase unterdrückt.
Demonstration des Zellmotilitäts-Assays in einer gemischten Population
Zellmotilität ist ein wichtiges phänotypisches Verhalten. Die Motilitätsverteilung einer Population kann Informationen über die physikalische Interaktion von Zellen, die mechanischen Eigenschaften der lokalen Mikroumgebung liefern und manchmal als Hinweis auf epigenetische Variation von Zellen analysiert werden. Da unsere verbesserte Zellkulturplattform eine nahezu kontinuierliche Bildgebung ermöglicht, maximiert der Vorteil einer feinen zeitlichen Auflösung das Potenzial der Einzelzellverfolgung in einer heterogenen Population.
Wir verwenden das Plugin TrackMate16 in Fidschi (http://fiji.sc) mit angepasstem Makro, um den Tracking-Prozess zu implementieren und zu automatisieren. TrackMate ermöglicht es dem Benutzer, einen Tracking-Algorithmus mithilfe einer Skriptsprache aus dem Fidschi-Skript-Editor zu implementieren und anzupassen. Der Nachverfolgungsprozess ist in eine Reihe von Schritten unterteilt: Segmentierungs-, Filter- und Partikelverknüpfungsprozesse.
Wie in Abbildung 6Bgezeigt, führten wir einen "Wundheilungstest" als Demonstration zur Untersuchung der zellkollektiven Migration und zell-zell-Interaktion durch. PC3-EPI- und PC3-EMT-Zellen waren dicht in der Mitte des Geräts ausgesät und durften frei in den leeren Bereich migrieren. Das normalisierte Histogramm der Geschwindigkeit beider Phänotypen ist in Abbildung 6Cdargestellt. Die Geschwindigkeit von PC3-EMT war um den Faktor 1,8x signifikant höher als pc3-EPI, was mit der Tatsache übereinstimmt, dass der mesenchymale Phänotyp als Bestandteil der hautförmigen Wundheilung mit außergewöhnlicher Migrationsfähigkeit im Gegensatz zu den vergleichbaren stationären epitheliale phänotyp.
Um das Fortschreiten der Zellmotilität in einer stressfreien Umgebung zu beobachten, führten wir eine langfristige Kokultur von PC3-EPI und PC3-EMT mit gleichmäßiger Anfangssaatdichte durch und verfolgten die zeitlich unterschiedliche Verteilung der Zellgeschwindigkeit. Wie in Abbildung 7A,Bdargestellt, nach 6 Tagen Kultur, als Zellen einen höheren Zusammenfluss erreichten, neigten sich die Verteilungen der Zellgeschwindigkeit für beide Phänotypen zu den linken Schwänzen.
Wir können das Verhältnis der Anzahl der PC3-EPI zu PC3-EMT in jedem Klassenintervall vergleichen. Wie in Abbildung 7Cdargestellt, dominierte PC3-EMT unabhängig von den Tagen der Kultur oder Dichte der Zellen den Hochgeschwindigkeitsbereich, während PC3-EPI die Niedriggeschwindigkeitszone belegte. Obwohl die Gesamtgeschwindigkeit für beide Phänotypen signifikant abnahm, blieb PC3-EMT motil und wurde weniger von der Überfüllung der Mikroumgebung beeinflusst, wie in Abbildung 7Ddargestellt. Die durchschnittliche Geschwindigkeit von PC3-EPI sank um rund 40%, während die von PC3-EMT nur um 14% sank.
Es gibt mehrere Faktoren, die die Verteilung der Zellgeschwindigkeit und die durchschnittliche Geschwindigkeit beeinflussen können, wie z. B. die Überfüllung der Bevölkerung. Kontinuierliche Zellverfolgung und Überwachung über alle Subpopulationen ist wichtig, um das Fortschreiten des phänotypischen Verhaltens zu verstehen. Wenn wir z. B. das Niveau des mesenchymalen Status einer nicht beschrifteten Teilpopulation quantifizieren möchten, wäre es informativer, nicht nur die Verteilung der physikalischen Menge (z. B. Geschwindigkeit) der interessierten Teilpopulation in Abhängigkeit von Zeit, sondern auch die aller übrigen koexistierenden Teilpopulationen von Zellen.
Abbildung 1: Der spritzpumpengetriebene mikrofluidische EA-Chip. (A) Die mikrofluidische Vorrichtung verfügt über zwei getrennte mittlere Einlässe, zwei Auslässe und einen zentralen Port für die Zellaussaat oder Extraktion von übermäßigem Medium. Beachten Sie, dass zwischen den mittleren Einlässe und den Zellkultur-Arrays ein Paar Serpentinkanäle, die es dem Medium ermöglichen, mit der Atmosphäre zu equigieren, die unter der gasdurchlässigen Membran vorbeigeht. (B) Die Erzeugung des Farbverlaufs. Die Spritzen pumpen das Medium mit 0,1 mM Fluorescein bzw. ohne Fluorescein durch die 2 mittleren Einlässe auf der rechten Seite in den Chip, der aus dem Chip an den 2 mittleren Auslässe auf der linken Seite extrahiert wird. Die Fluoresceinkonzentration ist proportional zur Intensität des Fluoreszenzsignals und wird in der Nähe der mittleren Einlässe/Auslässe a und in der Nähe des Zentrums b profiliert. Abbildung reproduziert mit Genehmigung von Lin et al. 201712. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Die Komponenten der kundenspezifischen 3 Brunnenprobenplatte. (a) der Hauptkörper von 3 Brunnenplatte; (b) ein Paar Gaskanäle, mit denen konditionierte Atmosphäre durch die Septa am Eingang der Gaskanäle eingepumpt und ausgelüftet werden kann; (c) ein O-Ring, der den Raum zwischen der Brunnenplatte und der gasdurchlässigen Kulturschale versiegeln soll; (d) die gasdurchlässige Kulturschale mit einem Durchmesser von 35 mm; (e) der Tellerhalter; (f) das PDMS-Gerät; (g) die PDMS-Chiphalter; h) die doppellagigen 35-mm-Glasfenster, die zur Aufrechterhaltung der Wärmeisolierung und zur Vermeidung von Wasserkondensation ausgelegt sind; (i) Glasfensterhalter; (j) Heizkissen; (k) Temperatursensor; (l) die Klebeversiegelung, die den Chip vor dem Austrocknen schützt. Abbildung reproduziert mit Genehmigung von Lin et al. 201712. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Die schematische Abbildung des Versuchsaufbaus. Der Aufbau des Experiments, einschließlich des Gasversorgungssystems, gaskanalverbindung, der mittleren Versorgungsverbindung und des Bildgebungssystems. Abbildung reproduziert mit Genehmigung von Lin et al. 201712. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Wachstumskurven von PC3 im EA ohne Stress. PC3 wurden in EA ohne äußere Belastung kultiviert. (A) Muster von EA mit Positionsbeschriftungen. (B) Wachstumskurven von PC3 an den gewählten Positionen in Bezug auf den Zellzusammenfluss. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Die Co-Kultur von PC3-EPI und PC3-EMT im EA ohne Stress. PC3-EPI (rot) und PC3-EMT (grün) wurden im EA ohne äußere Belastung kokultiviert. (A) Überlagerung von zwei fluoreszierenden Kanälen bei t = 0 h. (B) Fluoreszierendes Bild, aufgenommen bei t = 95 h. (C) Wachstumskurven in Bezug auf den Zellzusammenfluss. Der Zellzusammenfluss jedes Zelltyps wurde auf dem gesamten Chip gemessen. Jeder Datenpunkt stellt den durchschnittlichen Zellzusammenfluss bei 3 aufeinanderfolgenden Zeitpunkten in 15-min-Intervallen dar. Die Fehlerbalken stellen die Standardabweichung des Zellzusammenflusses bei den 3 aufeinanderfolgenden Zeitpunkten dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 6: Zellmotilitätstest in einer gemischten Population. Die Demonstration der Einzelzellenverfolgungsleistung in einer gemischten Grundgesamtheit. (A) Eine Demonstration, wie Zellen durch Laplacian der Gaußschen (LoG) Segmentierung erkannt werden. Die Kreise geben die Position der Zellen an, die vom LoG-Algorithmus erkannt werden. Die erkannten Zellen werden von Frame zu Frame verknüpft, basierend auf dem problem der linearen Zuweisung, um die Beweglichkeit der Zelle zu quantifizieren. (B) Der "Wundheilungstest" des KOkulturexperiments PC3-EPI und PC3-EMT. Die Zellen wurden lokal bis zu 100% Zusammenfluss mit einer klaren Grenze in der Mitte gesät. Nach der Installation des EA-Chips wurden Zellen beobachtet, die durch das Mikrohabitat-Array migrierten, wie durch die weißen Pfeile angegeben. (C) Normalisiertes Histogramm der Zellbewegung. PC3-EMT ist um den Faktor 1.8x schneller als PC3-EPI. Die Fehlerbalken stellen die Standardabweichung von 5 Versuchsbeispielen dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 7: Der Motilitätstest einer langfristigen Kokultur von PC3-EPI und PC3-EMT. Eine langfristige Co-Kultur von PC3-EPI und PC3-EMT mit einheitlicher Anfänglicher Saatdichte. Die Verteilung der Zellgeschwindigkeit variiert mit der Zeit. (A) Normalisierte Verteilung der Zellengeschwindigkeit am 2. Tag. (B) Die normalisierte Verteilung der Zellgeschwindigkeit am 6. Tag. (C) Verhältnis der Anzahl von PC3-EPI zu PC3-EMT in jedem Klassenintervall. (D) Durchschnittsgeschwindigkeit von PC3-EPI und PC3-EMT als Funktion der Zeit. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Konventionelle Zellkultur wurde vor fast einem Jahrhundert entwickelt und bleibt das am häufigsten verwendete präklinische Modell in der biomedizinischen Forschung, trotz seiner nachgewiesenen begrenzten Fähigkeit, klinische Ergebnisse bei Krebs vorherzusagen17. Tiermodelle bieten die höchste physiologische Relevanz und vernünftige genetische Ähnlichkeit mit dem Menschen, aber seit langem anerkannt, dass erhebliche Einschränkungen bei der Vorhersage menschlicher Ergebnisse18. Unter allen bestehenden präklinischen Modellen scheinen mikrofluidische Krebs-on-Chip-Modelle der vielversprechendste Kandidat zu sein, um den unerfüllten Bedarf in der Krebsforschungzubefriedigen 9,19,20. Allerdings haben die aktuellen Krebs-on-Chip-Modelle noch keine Plattform bieten, die in der Lage ist, Schlüsselkomponenten und Wechselwirkungen zu reproduzieren, um eine Tumormikroumgebung umfassend nachzuahmen, aber dennoch einfach genug, um zuverlässige und reproduzierbare quantitative Daten bereitzustellen. Unsere repräsentativen Daten zeigen, dass unsere mikrofluidische Zellkulturtechnologie stabile physikalische und biochemische Bedingungen für die langfristige Zellkultur in heterogenen Mikroumgebungen bietet. Diese multifunktionale Plattform ermöglicht die ausgeklügelte Einstellung eines zeitabhängigen chemischen Gradienten sowie der Umgebungsgaszusammensetzung. Die Plattform ist tragbar und kompatibel zu den meisten fluoreszierenden invertierten Mikroskopen für hochauflösende Echtzeit-Bildgebung, die multidimensionale Informationen von Zellen als Funktion der Zeit bietet, einschließlich Zellmorphologie, Populationsdynamik, Zelle Motilität und Zellmigration auf einzelzeller Ebene.
Im Vergleich zu unseren bisherigen Arbeiten11stellen wir fest, dass dieses druckversiegelnde Verpackungs- und Montageverfahren für unser mikrofluidisches Gerät zahlreiche nachgeschaltete Experimentierkapazitäten (z.B. FACS, lokale Metabolitenextraktion, subklonale Populationen) ermöglicht. Erweiterung, IF, DNA/RNA FISH, etc.) ergänzend zu den Zeitrafferbildern, die im Laufe der Experimente aufgenommen wurden. Diese Fähigkeit, Zellen von bestimmten Orten in einer heterogenen Kultur zu entfernen, ist ein großer Fortschritt im Vergleich zu früheren Geräten, bei denen die Dichtfläche zu einem Chip entfernt werden musste, bevor man auf die Kultur11zugreifen konnte. Auch in diesem Fall störte die Entfernung der Abdeckung die Kultur erheblich, so dass lokale Tests von Zellen auf ein bis wenigen Lebensraumniveau nicht möglich waren. Eine solche lokalisierte Extraktion war in unserem Fall aufgrund der weichen "wiederverschließbaren" Natur der flexiblen gasdurchlässigen Membran möglich.
Es gibt mehrere wichtige Schritte im vorgestellten Protokoll. Um zunächst ein Langzeitexperiment mit stabiler Fluiddynamik zu initiieren, müssen Mikroblasen so weit wie möglich vermieden werden. Daher ist es wichtig, das Kulturmedium (Schritt 3.4.2) vor dem Laden der Medien in die Spritzen vorzuwärmen und zu entgasen. Die Manipulation des Ladens und Dosierens von Medien sollte langsam und schonend erfolgen, um Blasenbildung zu verhindern. Das PDMS-Muster sollte vor dem Anschluss an das Kulturmedienversorgungssystem mit Sauerstoffplasma (Schritt 3.4.3) behandelt werden. Die Sauerstoffplasmabehandlung gewährleistet die Hydrophilie der PDMS-Oberfläche und reduziert die Möglichkeit der Mikrobubble-Entrapping deutlich. In Schritt 3.4.7. sollte sich der PDMS-Chip beim Auflegen des Chips auf der Zellkulturmembran der flüssigen Oberfläche mit einem Neigungswinkel von 15 Grad nähern, um die Blasen (falls vorhanden) auf der flüssigen Oberfläche innerhalb der Kulturschale loszuwerden. Zweitens erfordert das Druckabdichtungsverfahren ein stabiles Gasversorgungssystem, das die Zellkulturmembran unter Druck setzt. Der Druck sollte zwischen 0,2 und 0,6 psi eingestellt werden. Ein Druck unter 0,2 psi reicht für die Spanabdichtung nicht aus. Oberhalb von 1,2 psi würde eine signifikante Menge Gas durch die Membran durchdringen und Blasen innerhalb des mikrofluidischen Musters erzeugen. Wir stellen fest, dass, wenn die Komponenten der Metall-3-Well-Platte nicht richtig montiert sind (einschließlich des Plattenkörpers, des gasdurchlässigen Kulturschalenhalters, eines PDMS-Chiphalters, eines Glasfensterhalters, O-Ringe und eines Paares von 35-mm-Glasfenstern), die Druckmessung wäre auf die Erhöhung des Gasstroms nicht mehr reagieren. Das Leckageproblem kann einfach durch eine Dichtheitsprüfung und anschließende Wiedermontage der Komponenten behoben werden.
Die wichtigste Form von Daten, die mit der Nutzung der EA-Technologie erfasst werden, ist die Bildgebung. Wie bereits erwähnt, kann die EA-Technologie auf jedem invertierten Mikroskop installiert werden. Um jedoch die Vorteile des Systems voll auszuschöpfen, wird dringend empfohlen, das System auf einem invertierten Fluoreszenzmikroskop zu installieren, das mit vollmotorisierter x-y-Stufe, motorisiertem Fokusknopf, motorisiertem Verschluss und motorisiertem Filterwürfel ausgestattet ist. Beachten Sie auch, dass Perfect Focus möglicherweise keine befriedigende Bildqualität garantiert. Wir empfehlen die Verwendung einer Bildverarbeitungssoftware, die eine mehrdimensionale Bilderfassung und ein angepasstes Bildgebungsskript ermöglicht. Die Bilder gut fokussiert zu halten, könnte ohne einen regelmäßigen Autofokus-Befehl (alle 24 Stunden oder 48 Stunden) eine Herausforderung darstellen, der während des Bildaufnahmezyklus eine angepasste Fokusfläche generiert.
Die vorgestellte mikrofluidische EA-Technologie wurde implementiert, um die Anpassungs- und Evolutionsdynamik in Prostatakrebszellmetapopulationen unter einer chemotherapeutischen Stresslandschaft zu untersuchen12. Wir haben auch die Entstehung von drogenresistenten polyploiden Riesenkrebszellen in dieser tumorartigen heterogenen Mikroökologie nachgewiesen, was zeigt, dass Umweltheterogenität in Kombination mit Zellmigration innerhalb der Tumorpopulation eine Amplifikation verursachen würde. über die Entstehung resistenter Phänotypen13. Mit der Fähigkeit, das Verhalten gemischter Tumorzellpopulationen unter gut kontrollierten Spannungsgradienten zu kontrollieren und zu überwachen, kann unsere mikrofluidische EA-Technologie auch als Plattform dienen, um regulatorische Mechanismen und die phänotypische Transformation zu untersuchen, die an EMT im Rahmen krebstherapeutischer Strategien21. Nicht zuletzt kann die vorgestellte Druckversiegelungsverpackungsmethode auch in anderen mikrofluidischen Systemen eingesetzt werden, die eine ausgeklügelte Anpassung der Umgebungsgaszusammensetzung sowie der nachgelagerten Versuchskapazitäten erfordern. Zum Beispiel wurde die gleiche Verpackungsmethode verwendet, um verschiedene mikrofluidische Muster zu integrieren, um zu untersuchen, wie sich bakterielle Populationswellen durch physikalische Barrieren ausbreiten22.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass sich die kollektive Bevölkerungsdynamik qualitativ von einzelligen Verhaltensweisen unterscheidet. Die mikrofluidische EA-Technologie ermöglicht die quantitative Untersuchung der evolutionären Dynamik und des phänotischen Verhaltens einzeln und kollektiv als Funktion der Zeit. Diese Technologie kann ein physiologisch relevanteres In-vitro-Modell für die Krebsforschung und möglicherweise für die präklinische Arzneimittelentwicklung und -vorsorge darstellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Es wurden keine Interessenkonflikte angemeldet.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von NSF PHY-1659940 unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL BD Luer-Lok tip syringes | BD | 14-823-16E | |
| Antibiotic-Antimycotic | Sigma-Aldrich | A5955 | 1x anti-anti |
| AZ 300 MIF | Merck KGaA | 18441123163 | Photoresist developer |
| AZ1518 | Merck KGaA | AZ1518 | Photoresist |
| AZ4330 | Merck KGaA | AZ4330 | Photoresist |
| Cr Chromium Etchant | Sigma-Aldrich | 651826 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Life Technologies Corporation | 10437028 | |
| Heidelberg DWL 66+ laserwriter | Heidelberg Instruments | DWL66+ | Writing photomask |
| Hexamethyldisilazane (HMDS) | Sigma-Aldrich | 379212 | For photoresist adhesion enhancement |
| Hollow steel pins | New England Small Tube | NE-1300-01 | .025 OD .017 ID x .500 long / type 304 WD fullhard |
| ibidi Heating System, Multi-Well Plates, K-Frame | ibidi | 10929 | On-stage incubator |
| Luer-Lok 23 G dispensing needle | McMaster-Carr | 75165A684 | To connect syringes and tubings |
| Lumox dish 35 | Sarstedt | 94.6077.331 | Gas-permeable cell culture dish |
| Microposit Remover 1165 | Dow Electronic Materials | Microposit Remover 1165 | Photoresist stripper |
| Microseal B Adhesive Sealer | Bio-Rad Laboratories | MSB1001 | Adhesive sealer |
| O-Ring (for Lumox plate sealing) | McMaster-Carr | 9452K114 | Dash No. 27; 1-5/16" ID x 1-7/16" OD; Duro 70 |
| O-Ring (for bottom glass window sealing) | McMaster-Carr | 9452K74 | Dash No. 20; 7/8" ID x 1" OD; Duro 70 |
| Plasma-Preen Plasma Cleaning/Etching System | Plasmatic Systems, Inc | Plasma-Preen | Oxygen plasma system |
| RPMI 1640 | Life Technologies Corporation | 11875-093 | |
| Samco RIE800iPB DRIE | Samco | RIE800iPB | Deep reactive-ion etching system |
| Suss MA6 mask aligner | SUSS MicroTec | MA6 | Mask aligner |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer | Fisher Scientific | NC9285739 | PDMS elastomer |
| TePla M4L plasma etcher | PVA TePla | M4L | Plasma etcher |
| Trichloro-1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl-silane (PFOTS) | Sigma-Aldrich | 448931 | For silicon wafer silanization |
| Tygon microbore tube (0.020" x 0.060"OD) | Cole-Parmer | EW-06419-01 | Tubings for media delivery |
References
- Meacham, C. E., Morrison, S. J. Tumour heterogeneity and cancer cell plasticity. Nature. 501 (7467), 328-337 (2013).
- Whiteside, T. L. The tumor microenvironment and its role in promoting tumor growth. Oncogene. 27 (45), 5904-5912 (2008).
- Lambert, G., et al. An analogy between the evolution of drug resistance in bacterial communities and malignant tissues. Nature Reviews Cancer. 11 (5), 375-382 (2011).
- Tannock, I. F., Lee, C. M., Tunggal, J. K., Cowan, D. S., Egorin, M. J. Limited penetration of anticancer drugs through tumor tissue: a potential cause of resistance of solid tumors to chemotherapy. Clinical Cancer Research. 8 (3), 878-884 (2002).
- Grantab, R. H., Tannock, I. F. Penetration of anticancer drugs through tumour tissue as a function of cellular packing density and interstitial fluid pressure and its modification by bortezomib. BMC Cancer. 12, 214 (2012).
- Fu, F., Nowak, M. A., Bonhoeffer, S. Spatial Heterogeneity in Drug Concentrations Can Facilitate the Emergence of Resistance to Cancer Therapy. PLoS Computational Biology. 11 (3), e1004142 (2015).
- Bogorad, M. I., et al.
- Caballero, D., et al. Organ-on-chip models of cancer metastasis for future personalized medicine: From chip to the patient. Biomaterials. 149, 98-115 (2017).
- Caballero, D., Blackburn, S. M., De Pablo, M., Samitier, J., Albertazzi, L. Tumour-vessel-on-a-chip models for drug delivery. Lab on a Chip. 17 (22), 3760-3771 (2017).
- Zhang, Q., et al. Acceleration of emergence of bacterial antibiotic resistance in connected microenvironments. Science. 333 (6050), 1764-1767 (2011).
- Wu, A., et al. Ancient hot and cold genes and chemotherapy resistance emergence. Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (33), 10467-10472 (2015).
- Lin, K. C., et al. Epithelial and mesenchymal prostate cancer cell population dynamics on a complex drug landscape. Convergent Science Physical Oncology. 3 (4), 045001 (2017).
- Lin, K. C., et al. The role of heterogeneous environment and docetaxel gradient in the emergence of polyploid, mesenchymal and resistant prostate cancer cells. Clinical & Experimental Metastasis. 36 (2), 97-108 (2019).
- Roca, H., et al. Transcription factors OVOL1 and OVOL2 induce the mesenchymal to epithelial transition in human cancer. PloS One. 8 (10), e76773 (2013).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Tinevez, J. Y., et al. Trackmate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
- Caballero, D., et al. Organ-on-chip models of cancer metastasis for future personalized medicine: From chip to the patient. Biomaterials. 149, 98-115 (2017).
- Akhtar, A. The flaws and human harms of animal experimentation. Cambridge Quarterly of Healthcare Ethics. 24 (4), 407-419 (2015).
- Sontheimer-Phelps, A., Hassell, B. A., Ingber, D. E. Modelling cancer in microfluidic human organs-on-chips. Nature Reviews Cancer. 19 (2), 65-81 (2019).
- Bogorad, M. I., DeStefano, J., Karlsson, J., Wong, A. D., Gerecht, S., Searson, P. C.
- Zañudo, J. G. T., et al. Towards control of cellular decision-making networks in the epithelial-to-mesenchymal transition. Physical Biology. 16 (3), 031002 (2019).
- Morris, R. J., et al. Bacterial population solitary waves can defeat rings of funnels. New Journal of Physics. 19 (3), 035002 (2017).
