Vi præsenterer en mikrofluidisk Cancer-on-chip model, “Evolution Accelerator” teknologi, som giver en kontrollerbar platform for langsigtede real-time kvantitative undersøgelser af Cancer dynamik inden for veldefinerede miljømæssige forhold på enkelt-celle Niveau. Denne teknologi forventes at fungere som en in vitro-model for grundforskning eller præklinisk lægemiddeludvikling.
Konventionel cellekultur er fortsat den hyppigst anvendte prækliniske model, på trods af dens påviste begrænsede evne til at forudsige kliniske resultater i cancer. Microfluidic Cancer-on-chip-modeller er blevet foreslået for at bygge bro mellem de overforenklede konventionelle 2D-kulturer og mere komplicerede dyremodeller, som har begrænset evne til at producere pålidelige og reproducerbare kvantitative resultater. Her præsenterer vi en mikrofluidisk Cancer-on-chip model, der gengiver centrale komponenter i en kompleks tumor mikromiljø på en omfattende måde, men er enkel nok til at give robuste kvantitative beskrivelser af kræft dynamik. Denne mikrofluidisk Cancer-on-chip model, “Evolution Accelerator,” nedbryder en stor population af kræftceller i en sammenkoblet vifte af tumor mikromiljøer samtidig generere en heterogene kemoterapeutiske stress landskab. Progression og evolutionære dynamik kræft som reaktion på narkotika gradient kan overvåges i ugevis i realtid, og talrige downstream eksperimenter kan udføres supplerer de tidsforskudt billeder taget gennemløbet af eksperimenter.
Kræft er i stigende grad blevet anerkendt som et komplekst økosystem, der ikke kun afhænger af den fortsatte dysregulering af muterede cellepopulationer, men også af vitale interaktioner mellem kræftceller og værts mikromiljøet. I denne forstand udvikler kræften sig på et adaptivt landskab, der manifesteres ved en kombination af faktorer, herunder et heterogent tumor mikromiljø og kryds stilk med en række værtsceller, som alle bidrager med selektivt pres for yderligere genetiske eller Epigenetiske ændringer1,2,3. I forbindelse med solide tumorer, ulige fordeling af kemoterapeutika og andre ressource gradienter bidrager til deres molekylære heterogenitet og kan spille en rolle i udviklingen af resistens over for lægemidler, øget angiogenese til særlige tumor subpopulationer, og endda metastase4,5,6. Konventionelle in vitro 2D cellekultur undersøgelser, mens besidder storstilet, praktisk eksperimentel kapacitet, giver middel-felt, ensartede, og faste betingelser, ofte mangler den præcise rumlige og tidsmæssige miljøkontrol nødvendig for virkelig emulere in vivo tumor dynamik. Der er således behov for mere repræsentative ex vivo-modeller til reproduktion af tumor mikromiljøet forud for dyremodeller i narkotika udviklings rørledningen for at opnå en bedre forudsigelse af kræft progression samt reaktioner på lægemidler inden for dynamisk stress Landskaber. Mikrofluidics er blevet foreslået for at bygge bro over kløften mellem 2D cellekultur studier og mere komplekse in vivo dyreforsøg, der muligvis ikke kan understøtte kontrollerbar kvantitativ undersøgelse7,8,9.
En ideel in vitro-system til at karakterisere kræft celle dynamik bør besidde evnen til at generere en heterogen mikromiljø til at efterligne adaptive cellulære reaktioner, der kan finde sted i en tumor, samt give mulighed for observation af disse dynamikker på en enkelt celle opløsning. I denne artikel beskriver vi en mikrofluidic cellekultur platform, en PDMS-baseret enhed kaldet “Evolution Accelerator” (EA), der giver mulighed for parallelle in vitro-undersøgelser af cancer celle dynamik ved cellulær opløsning med realtidsdata indsamling over løbet af uger, mens stabilt fastholde gradienter af stress på tværs af kulturlandskab. Udformningen af denne platform er baseret på vores tidligere arbejde, hvor den evolutionære dynamik af organismer i en Tjurer kan accelereres10,11. Specifikt i en gruppe af rumligt adskilte populationer, der interagerer på et eller andet niveau, når de udsættes for et heterogene stress landskab, de mest fit arter kan dominere i en lokalbefolkning hurtigere sammenlignet med en stor ensartet population. De fordelagtige arter derefter migrere til tilstødende mikrohabitater i søgen efter ressourcer og plads, og i sidste ende dominere hele befolkningen. Som vist i figur 1består mønsteret af den mikrofluidiske EA-chip af (i) et par Serpentine kanaler, der giver frisk medie cirkulation og konstruerer fast Grænsebetingelser for kemisk diffusion, og II) det sekskantede celle dyrkningsområde som består 109 indbyrdes forbundne sekskantede og 24 halvt-sekskantede kamre i midten, der ligner en honeycomb struktur. Chippen er 100 μm i dybden. Mediekanaler og cellekultur region er forbundet med små slidser (ca. 15 μm bred), som forhindrer direkte medieflow og den resulterende forskydningsbelastning på tværs af cellekultur området, men stadig tillader kemikalier at diffus gennem små slidser og udveksle næringsstoffer, metabolisk affald osv. Genereringen af kemiske gradienter er påvist i figur 1B, hvor en mediekanal indeholder 0,1 mm fluorescein, mens den anden kanal er fri for fluorescein. Celler dyrkes på en gasgennemtrængelig membran, indkapslet af mikrostrukturerne gennem det positive tilbage tryk på membranen mod chippen. Komponenterne i anordningen er illustreret i figur 2, og den eksperimentelle opsætning er illustreret i figur 3, hvor kulturen holdes på et inverteret mikroskop ved 37 °c, med over 85% relativ luftfugtighed, og konditioneret under normoxia gas sammensætning.
Dette system giver detaljeret observation af lokaliserede cellulære interaktioner via lysfelt og fluorescerende kanaler og giver mulighed for rumligt løste downstream-assays såsom immunofluorescence, Western blot, eller massespektrometri. Vi har tidligere demonstreret som en proof-of-princip af denne mikrofluidisk Cancer-on-chip model på lang sigt Co-kultur af epitelial og mesenchymal PC3 prostatacancer celler12 samt fremkomsten af Drug-resistens polyploide gigant kræftceller ved hjælp af epitelial PC3 cellelinje13. Mens vi præsenterer anvendelsen af denne platform til at forstå den rumlige dynamik af epitelial PC3 og mesenchymal prostatacancer celler under en stress gradient af Docetaxel, kan det mikrofluidisk system let anvendes til enhver kombination af cellelinjer og ressource (dvs. stoffer, næringsstoffer, ilt) gradienter.
Konventionel cellekultur blev udviklet for næsten et århundrede siden og er fortsat den hyppigst anvendte prækliniske model i biomedicinsk forskning, på trods af dens dokumenterede begrænsede evne til at forudsige kliniske resultater i Cancer17. Dyremodeller tilbyder den højeste fysiologiske relevans og rimelige genetiske lighed for mennesker, men har længe været anerkendt for at have betydelige begrænsninger i forudsigelse af menneskelige resultater18. Blandt alle…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af NSF PHY-1659940.
10 mL BD Luer-Lok tip syringes | BD | 14-823-16E | |
Antibiotic-Antimycotic | Sigma-Aldrich | A5955 | 1x anti-anti |
AZ 300 MIF | Merck KGaA | 18441123163 | Photoresist developer |
AZ1518 | Merck KGaA | AZ1518 | Photoresist |
AZ4330 | Merck KGaA | AZ4330 | Photoresist |
Cr Chromium Etchant | Sigma-Aldrich | 651826 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Life Technologies Corporation | 10437028 | |
Heidelberg DWL 66+ laserwriter | Heidelberg Instruments | DWL66+ | Writing photomask |
Hexamethyldisilazane (HMDS) | Sigma-Aldrich | 379212 | For photoresist adhesion enhancement |
Hollow steel pins | New England Small Tube | NE-1300-01 | .025 OD .017 ID x .500 long / type 304 WD fullhard |
ibidi Heating System, Multi-Well Plates, K-Frame | ibidi | 10929 | On-stage incubator |
Luer-Lok 23 G dispensing needle | McMaster-Carr | 75165A684 | To connect syringes and tubings |
Lumox dish 35 | Sarstedt | 94.6077.331 | Gas-permeable cell culture dish |
Microposit Remover 1165 | Dow Electronic Materials | Microposit Remover 1165 | Photoresist stripper |
Microseal B Adhesive Sealer | Bio-Rad Laboratories | MSB1001 | Adhesive sealer |
O-Ring (for Lumox plate sealing) | McMaster-Carr | 9452K114 | Dash No. 27; 1-5/16" ID x 1-7/16" OD; Duro 70 |
O-Ring (for bottom glass window sealing) | McMaster-Carr | 9452K74 | Dash No. 20; 7/8" ID x 1" OD; Duro 70 |
Plasma-Preen Plasma Cleaning/Etching System | Plasmatic Systems, Inc | Plasma-Preen | Oxygen plasma system |
RPMI 1640 | Life Technologies Corporation | 11875-093 | |
Samco RIE800iPB DRIE | Samco | RIE800iPB | Deep reactive-ion etching system |
Suss MA6 mask aligner | SUSS MicroTec | MA6 | Mask aligner |
Sylgard 184 Silicone Elastomer | Fisher Scientific | NC9285739 | PDMS elastomer |
TePla M4L plasma etcher | PVA TePla | M4L | Plasma etcher |
Trichloro-1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl-silane (PFOTS) | Sigma-Aldrich | 448931 | For silicon wafer silanization |
Tygon microbore tube (0.020" x 0.060"OD) | Cole-Parmer | EW-06419-01 | Tubings for media delivery |