खगोलविज्ञान रूप से जटिल कोशिकाओं, उनके कई प्रक्रियाओं और जंगली क्षेत्रों द्वारा उदाहरण हैं. उनके विस्तृत आकारिकी का विश्लेषण करने के लिए, हम हल्के निश्चित ऊतक में इंट्रासेल्यूलर लूसीफर पीले आयनोफोरोसिस करने के लिए एक विश्वसनीय प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं।
एस्ट्रोसाइट्स तंत्रिका परिपथों के आवश्यक घटक हैं। वे पूरे केंद्रीय तंत्रिका तंत्र टाइल (सीएनएस) और कार्यों की एक किस्म में शामिल हैं, जो न्यूरोट्रांसमीटर निकासी, आयन विनियमन, synaptic मॉडुलन, न्यूरॉन्स के लिए चयापचय समर्थन, और रक्त प्रवाह विनियमन शामिल हैं. Astrocytes जटिल कोशिकाओं है कि एक सोमा है, कई प्रमुख शाखाओं, और कई ठीक प्रक्रियाओं है कि neuropil के भीतर विविध सेलुलर तत्वों से संपर्क कर रहे हैं. एस्ट्रोसाइट्स की आकृति विज्ञान का आकलन करने के लिए, उनकी संरचना की कल्पना करने के लिए एक विश्वसनीय और पुन: उत्पादन योग्य विधि होना आवश्यक है। हम वयस्क चूहों से हल्के निश्चित मस्तिष्क ऊतक में फ्लोरोसेंट Lucifer पीले (LY) डाई का उपयोग कर एस्ट्रोसाइट्स के intracellular iontophoresis प्रदर्शन करने के लिए एक विश्वसनीय प्रोटोकॉल की रिपोर्ट. इस विधि में कई विशेषताएं हैं जो एस्ट्रोसाइट आकारिकी की विशेषता के लिए उपयोगी हैं। यह व्यक्तिगत एस्ट्रोसाइट्स के तीन आयामी पुनर्निर्माण के लिए अनुमति देता है, जो उनकी संरचना के विभिन्न पहलुओं पर आकृतिक विश्लेषण करने के लिए उपयोगी है। एलवाई आयन्टोफोरोसिस के साथ इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री का उपयोग तंत्रिका तंत्र के विभिन्न घटकों के साथ एस्ट्रोसाइट्स की बातचीत को समझने और लेबल किए गए एस्ट्रोसाइट्स के भीतर प्रोटीन की अभिव्यक्ति का मूल्यांकन करने के लिए भी किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल सीएनएस विकारों के माउस मॉडल की एक किस्म में लागू किया जा सकता है कड़ाई से प्रकाश माइक्रोस्कोपी के साथ एस्ट्रोसाइट आकारिकी की जांच. लय आयनोफोरोसिस एस्ट्रोसाइट संरचना का मूल्यांकन करने के लिए एक प्रयोगात्मक दृष्टिकोण प्रदान करता है, विशेष रूप से चोट या बीमारी के संदर्भ में जहां इन कोशिकाओं को महत्वपूर्ण रूपात्मक परिवर्तन से गुजरना प्रस्तावित किया जाता है।
एस्ट्रोसाइट्स केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) में सबसे प्रचुर मात्रा में ग्लिल कोशिकाएं हैं। वे आयन homeostasis, रक्त प्रवाह विनियमन, synapse गठन के रूप में के रूप में अच्छी तरह से उन्मूलन में भूमिका निभाते हैं, और न्यूरोट्रांसमीटर तेज1. एस्ट्रोसाइट प्रकार्यों की विस्तृत श्रृंखला उनके जटिल रूपात्मक संरचना2,3में परिलक्षित होती है . एस्ट्रोसाइट्स में कई प्राथमिक और माध्यमिक शाखाएं होती हैं जो हजारों महीन शाखाओं और पत्रकों में विभाजित होती हैं जो सीधे synapses, dendrites, एक्सॉन, रक्त वाहिकाओं, और अन्य ग्लिल कोशिकाओं के साथ बातचीत करती हैं। एस्ट्रोसाइट आकारिकी विभिन्न मस्तिष्क क्षेत्रों में भिन्न होती है, जो न्यूरोनल सर्किट4में अपने कार्यों को करने की उनकी क्षमता का संकेत दे सकती है। इसके अलावा, एस्ट्रोसाइट्स विकास के दौरान, शारीरिक स्थितियों के दौरान और कई रोग राज्यों3,5,6में अपनी आकृति विज्ञान को बदलने के लिए जाने जाते हैं।
एस्ट्रोसाइट आकारिकी की जटिलता को सही ढंग से हल करने के लिए एक सुसंगत, पुन: उत्पादन योग्य विधि की आवश्यकता है। परंपरागत रूप से, इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री का उपयोग एस्ट्रोसाइट विशिष्ट या एस्ट्रोसाइट समृद्ध प्रोटीन मार्करों के उपयोग के साथ एस्ट्रोसाइट्स की कल्पना करने के लिए किया गया है। हालांकि, इन तरीकों एस्ट्रोसाइट की संरचना के बजाय प्रोटीन अभिव्यक्ति के पैटर्न से पता चलता है. आमतौर पर इस्तेमाल किया मार्करों, जैसे glial फाइब्रिलरी अम्लीय प्रोटीन (GFAP) और S100 कैल्शियम बाध्यकारी प्रोटीन – (S100 $), पूरे सेल मात्रा में व्यक्त नहीं करते हैं और इस तरह पूरी आकृति विज्ञान7हल नहीं है. आनुवंशिक दृष्टिकोण फ्लोरोसेंट प्रोटीन एस्ट्रोसाइट्स में सर्वव्यापी व्यक्त करने के लिए (वायरल इंजेक्शन या ट्रांसजेनिक माउस रिपोर्टर लाइनों) बेहतर शाखाओं और समग्र क्षेत्र की पहचान कर सकते हैं. हालांकि, यह व्यक्तिगत एस्ट्रोसाइट्स अंतर करने के लिए मुश्किल है, और विश्लेषण विशिष्ट प्रमोटर8द्वारा लक्षित एस्ट्रोसाइट आबादी द्वारा पक्षपाती हो सकता है। सीरियल सेक्शन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी synapses के साथ एस्ट्रोसाइट प्रक्रियाओं की बातचीत की एक विस्तृत तस्वीर प्रकट करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. synapses से संपर्क करने के खगोल साइट प्रक्रियाओं के हजारों के कारण, यह वर्तमान में इस तकनीक9के साथ एक पूरे सेल के पुनर्निर्माण के लिए संभव नहीं है, हालांकि यह डेटा विश्लेषण के लिए मशीन सीखने के दृष्टिकोण के उपयोग के साथ बदलने की उम्मीद है.
इस रिपोर्ट में, हम एक प्रक्रिया पर ध्यान केंद्रित करने के लिए एक उदाहरण के रूप में CA1 स्तर radiatum का उपयोग कर, Lucifer पीले (LY) डाई के साथ intracellular iontophoris का उपयोग कर माउस astrocytes की विशेषता है. विधि एरिक Bushong और मार्क एलिसमैन10,11द्वारा अग्रणी पिछले काम पर आधारित है . हल्के से तय मस्तिष्क स्लाइस से Astrocytes उनके विशिष्ट सोमा आकार से पहचाने जाते हैं और LY से भर रहे हैं. कोशिकाओं तो confocal माइक्रोस्कोपी के साथ छवि कर रहे हैं. हम प्रदर्शित करते हैं कि कैसे LY iontophoris व्यक्तिगत astrocytes के पुनर्निर्माण और उनकी प्रक्रियाओं और क्षेत्र के विस्तृत रूपात्मक विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इसके अलावा, इस विधि को इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री के साथ संयोजन के रूप में लागू किया जा सकता है स्थानिक संबंधों और एस्ट्रोसाइट्स और न्यूरॉन्स के बीच बातचीत की पहचान करने के लिए, अन्य ग्लिल कोशिकाओं, और मस्तिष्क vasculature. हम विभिन्न मस्तिष्क क्षेत्रों में आकृति विज्ञान और स्वस्थ या रोग की स्थिति7,12,13के माउस मॉडल का विश्लेषण करने के लिए एक बहुत ही उपयुक्त उपकरण के रूप में LY iontophoresis पर विचार करें .
इस पत्र में उल्लिखित विधि हल्के निश्चित मस्तिष्क स्लाइस में LY डाई के इंट्रासेल्यूलर आयन्टोफोरोसिस का उपयोग करके एस्ट्रोसाइट आकारिकी कल्पना करने के लिए एक तरीका का वर्णन करता है। इस प्रोटोकॉल में कई ?…
The authors have nothing to disclose.
लेखकों सुश्री Soto, डॉ यू, और मार्गदर्शन के लिए डॉ Octeau धन्यवाद के रूप में के रूप में अच्छी तरह से पाठ पर टिप्पणी. यह कार्य NS060677 द्वारा समर्थित है।
10% Buffered Formalin Phosphate | Fisher | SF 100-20 | An identical alternative can be used |
Acrodisc Syringe Filters with Supor Membrane | Pall | 4692 | An identical alternative can be used |
Ag/AgCl ground pellet | WPI | EP2 | A similar alternative can be used |
Alexa Fluor 546 goat anti-chicken IgG (H+L) | Thermo Scientific | A-11040 | A similar alternative can be used |
Alexa Fluor 647 goat anti-rabbit IgG (H+L) | Thermo Scientific | A27040 | A similar alternative can be used |
Anti Aquaporin-4 antibody | Novus Biologicals | NBP1-87679 | A similar alternative can be used |
Anti GFAP antibody | Abcam | ab4674 | A similar alternative can be used |
Borosilicate glass pipettes with filament | World precision instruments | 1B150F-4 | |
C57BL/6NTac mice | Taconic Stock | B6 | A similar alternative can be used |
Calcium Chloride | Sigma | 21108 | An identical alternative can be used |
Confocal laser-scanning microscope | Olympus | FV1000MPE | A similar alternative can be used |
D-glucose | Sigma | G7528 | An identical alternative can be used |
Disodium Phosphate | Sigma | 255793 | An identical alternative can be used |
Electrode puller- Model P-97 | Sutter | P-97 | A similar alternative can be used |
Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | An identical alternative can be used |
Heparin sodium injection (1,000 USP per mL) | Sagent Pharmaceuticals | 400-10 | An identical alternative can be used |
Imaris software (Version 7.6.5) | Bitplane Inc. | A similar alternative can be used | |
Isofluorane | Henry Schein Animal Health | 29404 | An identical alternative can be used |
Lidocaine Hydrochloride Injectable (2%) | Clipper | 1050035 | An identical alternative can be used |
Lucifer Yellow CH dilithium salt | Sigma | L0259 | |
Lucifer Yellow CH dipotassium salt | Sigma | L0144 | |
Magnesium Chloride | Sigma | M8266 | An identical alternative can be used |
Microscope Cover Glass | Thermo Scientific | 24X60-1 | An identical alternative can be used |
Microscope Slides | Fisher | 12-544-2 | An identical alternative can be used |
Normal Goat Serum | Vector Laboratories | S-1000 | An identical alternative can be used |
Objective lens (40x) | Olympus | LUMPLFLN 40XW | A similar alternative can be used |
Objective lens (60x) | Olympus | PlanAPO 60X | A similar alternative can be used |
PBS tablets, 100 mL | VWR | VWRVE404 | An identical alternative can be used |
Pipette micromanipulator- Model ROE-200 | Sutter | MP-285 / ROE-200 / MPC-200 | A similar alternative can be used |
Potassium Chloride | Sigma | P3911 | An identical alternative can be used |
Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | An identical alternative can be used |
Sodium Chloride | Sigma | S5886 | An identical alternative can be used |
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Triton X 100 | Sigma | T8787 | An identical alternative can be used |
Vibratome- Model #3000 | Pelco | 100-S | A similar alternative can be used |