Summary

Visualisierung der Astrozytenmorphologie mit Luzifer gelben Iontophorese

Published: September 14, 2019
doi:

Summary

Astrozyten sind morphologisch komplexe Zellen, die durch ihre vielfältigen Prozesse und buschigen Territorien veranschaulicht werden. Um ihre aufwendige Morphologie zu analysieren, präsentieren wir ein zuverlässiges Protokoll, um intrazelluläre Luzifer gelbe Iontophorese in leicht fixiertem Gewebe durchzuführen.

Abstract

Astrozyten sind wesentliche Bestandteile neuronaler Schaltkreise. Sie kacheln das gesamte zentrale Nervensystem (ZNS) und sind an einer Vielzahl von Funktionen beteiligt, die Neurotransmitter Clearance, Ionenregulierung, synaptische Modulation, metabolische Unterstützung für Neuronen, und Blutflussregulierung gehören. Astrozyten sind komplexe Zellen, die ein Soma, mehrere Hauptzweige und zahlreiche feine Prozesse haben, die verschiedene zelluläre Elemente innerhalb des Neuropils kontaktieren. Um die Morphologie von Astrozyten zu beurteilen, ist es notwendig, eine zuverlässige und reproduzierbare Methode zu haben, um ihre Struktur zu visualisieren. Wir berichten über ein zuverlässiges Protokoll zur intrazellulären Iontophorese von Astrozyten mit fluoreszierendem Luzifergelb (LY) Farbstoff in leicht fixiertem Hirngewebe von erwachsenen Mäusen. Diese Methode hat mehrere Funktionen, die nützlich sind, um Astrozytenmorphologie zu charakterisieren. Es ermöglicht eine dreidimensionale Rekonstruktion einzelner Astrozyten, die nützlich ist, um morphologische Analysen zu verschiedenen Aspekten ihrer Struktur durchzuführen. Die Immunhistochemie kann zusammen mit der LY-Iontophorese auch genutzt werden, um die Wechselwirkung von Astrozyten mit verschiedenen Komponenten des Nervensystems zu verstehen und die Expression von Proteinen innerhalb der markierten Astrozyten zu bewerten. Dieses Protokoll kann in einer Vielzahl von Mausmodellen von ZNS-Störungen implementiert werden, um die Astrozytenmorphologie mit Lichtmikroskopie streng zu untersuchen. Die LY-Iontophorese bietet einen experimentellen Ansatz zur Bewertung der Astrozytenstruktur, insbesondere im Zusammenhang mit Verletzungen oder Krankheiten, bei denen diese Zellen signifikante morphologische Veränderungen erfahren sollen.

Introduction

Astrozyten sind die am häufigsten vorkommenden Gliazellen im Zentralnervensystem (ZNS). Sie spielen Rollen in Ionenhomöostase, Blutflussregulation, Synapse-Bildung sowie Elimination, und Neurotransmitter Aufnahme1. Das breite Spektrum der Astrozytenfunktionen spiegelt sich in ihrer komplexen morphologischen Struktur2,3wider. Astrozyten enthalten mehrere primäre und sekundäre Zweige, die sich in Tausende von feineren Zweigen und Flugblättern teilen, die direkt mit Synapsen, Dendriten, Axonen, Blutgefäßen und anderen Gliazellen interagieren. Astrozytenmorphologie variiert zwischen verschiedenen Hirnregionen, was auf ihre Fähigkeit hindeuten kann, ihre Funktionen differenziell in neuronalen Schaltkreisen auszuführen4. Darüber hinaus sind Astrozyten dafür bekannt, ihre Morphologie während der Entwicklung, während physiologischer Bedingungen und in mehreren Krankheitszuständen3,5,6zu verändern.

Eine konsistente, reproduzierbare Methode ist erforderlich, um die Komplexität der Astrozytenmorphologie genau aufzulösen. Traditionell wurde die Immunhistochemie verwendet, um Astrozyten mit der Verwendung von astrozytenspezifischen oder astrozytenangereicherten Proteinmarkern zu visualisieren. Diese Methoden zeigen jedoch eher das Muster der Proteinexpression als die Struktur der Astrozyten. Die häufig verwendeten Marker, wie z.B. glialfibrilläres saures Protein (GFAP) und S100 Calciumbindungsprotein (S100), drücken nicht im gesamten Zellvolumen aus und lösen somit keine vollständige Morphologie7. Genetische Ansätze zur Expressfluoreszenzproteine in Astrozyten (virale Injektionen oder transgene Mausreporterlinien) können die feineren Zweige und das gesamte Territorium identifizieren. Es ist jedoch schwierig, einzelne Astrozyten zu unterscheiden, und Analysen können durch die Astrozytenpopulation verzerrt werden, die vom spezifischen Promotor angestrebt wird8. Serial section electron microscopy wurde verwendet, um ein detailliertes Bild der Wechselwirkungen von Astrozytenprozessen mit Synapsen zu enthüllen. Aufgrund der Tausenden von Astrozytenprozessen, die synapses kontaktieren, ist es derzeit nicht möglich, eine ganze Zelle mit dieser Technik9zu rekonstruieren, obwohl dies sich mit dem Einsatz von Machine Learning-Ansätzen für die Datenanalyse ändern dürfte.

In diesem Bericht konzentrieren wir uns auf ein Verfahren zur Charakterisierung von Mausastrozyten mit intrazellulärer Iontophorese mit Luzifergelb (LY) Farbstoff, am Beispiel des CA1-Stratum-Radiatums. Die Methode basiert auf bahnbrechenden Arbeiten von Eric Bushong und Mark Ellisman10,11. Astrozyten aus leicht fixierten Hirnscheiben werden durch ihre unverwechselbare Soma-Form identifiziert und mit LY gefüllt. Die Zellen werden dann mit konfokaler Mikroskopie abgebildet. Wir zeigen, wie LY-Iontophorese verwendet werden kann, um einzelne Astrozyten zu rekonstruieren und detaillierte morphologische Analysen ihrer Prozesse und gebiete durchzuführen. Auch kann diese Methode in Verbindung mit der Immunhistochemie angewendet werden, um räumliche Beziehungen und Wechselwirkungen zwischen Astrozyten und Neuronen, anderen Gliazellen und Gehirnvaskulatur zu identifizieren. Wir betrachten LY Iontophorese als ein sehr geeignetes Werkzeug, um Morphologie in verschiedenen Hirnregionen und Mausmodelle von gesunden oder Krankheitszuständen7,12,13zu analysieren.

Protocol

Die Tierversuche in dieser Studie wurden in Übereinstimmung mit dem National Institute of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals durchgeführt und vom Animal Research Committee der Kanzlerin an der University of California, Los Angeles, genehmigt. Erwachsene Mäuse (6-8 Wochen alt) mit gemischtem Geschlecht wurden in allen Experimenten verwendet. 1. Lösungsvorbereitung Künstliche Zerebrospinalflüssigkeit (ACSF) Lösung Bereiten Sie fri…

Representative Results

Die in dieser Studie berichteten Daten stammen aus 7 bis 12 Zellen von 4 Mäusen in jedem Experiment. Die durchschnittlichen Daten werden gegebenenfalls in den Abbildungspanels gemeldet. Um die Astrozytenmorphologie zu bewerten, führten wir eine intrazelluläre Iontophorese mit LY-Farbstoff durch, um Astrozyten im CA1-Stratum-Radiatum zu füllen, die in Abbildung 1zusammengefasst ist. Abbildung 2 zeigt eine repräsentative Astrozyten und ihre aus…

Discussion

Die in diesem Artikel beschriebene Methode beschreibt eine Möglichkeit, die Astrozytenmorphologie mit intrazellulärer Iontophorese von LY-Farbstoff in leicht fixierten Gehirnscheiben zu visualisieren. Es gibt mehrere kritische Faktoren, die in diesem Protokoll hervorgehoben werden, die zu einer erfolgreichen LY-Iontophorese und morphologischen Rekonstruktion der Zellen beitragen. Ein Faktor ist die Qualität und Reproduzierbarkeit der Bilder, die weitgehend durch das Alter der Maus und das Ergebnis der Perfusion bestim…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Autoren danken Frau Soto, Dr. Yu und Dr. Octeau für die Anleitung sowie Kommentare zum Text. Diese Arbeit wird von NS060677 unterstützt.

Materials

10% Buffered Formalin Phosphate Fisher SF 100-20 An identical alternative can be used
Acrodisc Syringe Filters with Supor Membrane Pall 4692 An identical alternative can be used
Ag/AgCl ground pellet WPI EP2 A similar alternative can be used
Alexa Fluor 546 goat anti-chicken IgG (H+L) Thermo Scientific A-11040 A similar alternative can be used
Alexa Fluor 647 goat anti-rabbit IgG (H+L) Thermo Scientific A27040 A similar alternative can be used
Anti Aquaporin-4 antibody Novus Biologicals NBP1-87679 A similar alternative can be used
Anti GFAP antibody Abcam ab4674 A similar alternative can be used
Borosilicate glass pipettes with filament World precision instruments 1B150F-4
C57BL/6NTac mice Taconic Stock B6 A similar alternative can be used
Calcium Chloride Sigma 21108 An identical alternative can be used
Confocal laser-scanning microscope Olympus FV1000MPE A similar alternative can be used
D-glucose Sigma G7528 An identical alternative can be used
Disodium Phosphate Sigma 255793 An identical alternative can be used
Electrode puller- Model P-97 Sutter P-97 A similar alternative can be used
Fluoromount-G Southern Biotech 0100-01 An identical alternative can be used
Heparin sodium injection (1,000 USP per mL) Sagent Pharmaceuticals 400-10 An identical alternative can be used
Imaris software (Version 7.6.5) Bitplane Inc. A similar alternative can be used
Isofluorane Henry Schein Animal Health 29404 An identical alternative can be used
Lidocaine Hydrochloride Injectable (2%) Clipper 1050035 An identical alternative can be used
Lucifer Yellow CH dilithium salt Sigma L0259
Lucifer Yellow CH dipotassium salt Sigma L0144
Magnesium Chloride Sigma M8266 An identical alternative can be used
Microscope Cover Glass Thermo Scientific 24X60-1 An identical alternative can be used
Microscope Slides Fisher 12-544-2 An identical alternative can be used
Normal Goat Serum Vector Laboratories S-1000 An identical alternative can be used
Objective lens (40x) Olympus LUMPLFLN 40XW A similar alternative can be used
Objective lens (60x) Olympus PlanAPO 60X A similar alternative can be used
PBS tablets, 100 mL VWR VWRVE404 An identical alternative can be used
Pipette micromanipulator- Model ROE-200 Sutter MP-285 / ROE-200 / MPC-200 A similar alternative can be used
Potassium Chloride Sigma P3911 An identical alternative can be used
Sodium Bicarbonate Sigma S5761 An identical alternative can be used
Sodium Chloride Sigma S5886 An identical alternative can be used
Stimulator- Model Omnical 2010 World precision instruments Omnical 2010 A similar alternative can be used
Triton X 100 Sigma T8787 An identical alternative can be used
Vibratome- Model #3000 Pelco 100-S A similar alternative can be used

References

  1. Khakh, B. S., Sofroniew, M. V. Diversity of astrocyte functions and phenotypes in neural circuits. Nature Neuroscience. 18 (7), 942-952 (2015).
  2. Ben Haim, L., Rowitch, D. H. Functional diversity of astrocytes in neural circuit regulation. Nature Reviews Neuroscience. 18 (1), 31-41 (2017).
  3. Schiweck, J., Eickholt, B. J., Murk, K. Important Shapeshifter: Mechanisms Allowing Astrocytes to Respond to the Changing Nervous System During Development, Injury and Disease. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 261 (2018).
  4. Chai, H., et al. Neural Circuit-Specialized Astrocytes: Transcriptomic, Proteomic, Morphological, and Functional Evidence. Neuron. 95 (3), 531-549 (2017).
  5. Sun, D., Jakobs, T. C. Structural remodeling of astrocytes in the injured CNS. Neuroscientist. 18 (6), 567-588 (2012).
  6. Naskar, S., Chattarji, S. Stress Elicits Contrasting Effects on the Structure and Number of Astrocytes in the Amygdala versus Hippocampus. eNeuro. 6 (1), (2019).
  7. Sun, D., Lye-Barthel, M., Masland, R. H., Jakobs, T. C. The morphology and spatial arrangement of astrocytes in the optic nerve head of the mouse. Journal of Comparative Neurology. 516 (1), 1-19 (2009).
  8. Grosche, A., et al. Versatile and simple approach to determine astrocyte territories in mouse neocortex and hippocampus. PLoS ONE. 8 (7), 69143 (2013).
  9. Kaynig, V., et al. Large-scale automatic reconstruction of neuronal processes from electron microscopy images. Medical Image Analysis. 22 (1), 77-88 (2015).
  10. Bushong, E. A., Martone, M. E., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. Protoplasmic astrocytes in CA1 stratum radiatum occupy separate anatomical domains. Journal of Neuroscience. 22 (1), 183-192 (2002).
  11. Wilhelmsson, U., et al. Redefining the concept of reactive astrocytes as cells that remain within their unique domains upon reaction to injury. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (46), 17513-17518 (2006).
  12. Williams, M. E., et al. Cadherin-9 regulates synapse-specific differentiation in the developing hippocampus. Neuron. 71 (4), 640-655 (2011).
  13. Ogata, K., Kosaka, T. Structural and quantitative analysis of astrocytes in the mouse hippocampus. Neuroscience. 113 (1), 221-233 (2002).
  14. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
  15. Hubbard, J. A., Hsu, M. S., Seldin, M. M., Binder, D. K. Expression of the Astrocyte Water Channel Aquaporin-4 in the Mouse Brain. ASN Neuro. 7 (5), (2015).
  16. Benediktsson, A. M., et al. Ballistic labeling and dynamic imaging of astrocytes in organotypic hippocampal slice cultures. Journal of Neuroscience Methods. 141 (1), 41-53 (2005).
  17. Fouquet, C., et al. Improving axial resolution in confocal microscopy with new high refractive index mounting media. PLoS ONE. 10 (3), 0121096 (2015).
  18. Luna, G., et al. Astrocyte structural reactivity and plasticity in models of retinal detachment. Experimental Eye Research. 150, 4-21 (2016).
  19. Octeau, J. C., et al. An Optical Neuron-Astrocyte Proximity Assay at Synaptic Distance Scales. Neuron. 98 (1), 49-66 (2018).
  20. Sosunov, A. A., et al. Phenotypic heterogeneity and plasticity of isocortical and hippocampal astrocytes in the human brain. Journal of Neuroscience. 34 (6), 2285-2298 (2014).
  21. Park, Y. M., et al. Astrocyte Specificity and Coverage of hGFAP-CreERT2 [Tg(GFAP-Cre/ERT2)13Kdmc] Mouse Line in Various Brain Regions. Experimental Neurobiology. 27 (6), 508-525 (2018).
  22. Koeppen, J., et al. Functional Consequences of Synapse Remodeling Following Astrocyte-Specific Regulation of Ephrin-B1 in the Adult Hippocampus. Journal of Neuroscience. 38 (25), 5710-5726 (2018).
  23. Jefferis, G. S., Livet, J. Sparse and combinatorial neuron labelling. Current Opinion in Neurobiology. 22 (1), 101-110 (2012).
  24. Lanjakornsiripan, D., et al. Layer-specific morphological and molecular differences in neocortical astrocytes and their dependence on neuronal layers. Nature Communications. 9 (1), 1623 (2018).

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Cite This Article
Moye, S. L., Diaz-Castro, B., Gangwani, M. R., Khakh, B. S. Visualizing Astrocyte Morphology Using Lucifer Yellow Iontophoresis. J. Vis. Exp. (151), e60225, doi:10.3791/60225 (2019).

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