Summary

Lucifer Sarı İontoforez kullanarak Astrosit Morfolojisini Görselleştirme

Published: September 14, 2019
doi:

Summary

Astrositler morfolojik olarak karmaşık hücrelerdir, çoklu süreçleri ve gür bölgeleri ile örneklenirler. Ayrıntılı morfolojilerini analiz etmek için, hafifçe sabit dokuda hücre içi Lucifer sarı iontoforezi gerçekleştirmek için güvenilir bir protokol salıyoruz.

Abstract

Astrositler nöral devrelerin temel bileşenleridir. Onlar tüm merkezi sinir sistemi döşeme (CNS) ve nörotransmitter temizliği, iyon regülasyonu, sinaptik modülasyon, nöronlar için metabolik destek ve kan akımı düzenleme dahil fonksiyonları, çeşitli katılır. Astrositler bir soma olan karmaşık hücrelerdir, birkaç ana dalları, ve nöropil içinde çeşitli hücresel elementlertemas çok sayıda ince süreçler. Astrositlerin morfolojisini değerlendirmek için yapılarını görselleştirmek için güvenilir ve tekrarlanabilir bir yönteme sahip olmak gerekir. Erişkin farelerden hafifçe sabitlenmiş beyin dokusunda floresan Lucifer sarısı (LY) boya kullanarak astrositlerin hücre içi iyontoforezini gerçekleştirmek için güvenilir bir protokol sıyoruz. Bu yöntem, astrosit morfolojisi karakterize etmek için yararlı olan çeşitli özelliklere sahiptir. Bu, yapılarının farklı yönleri üzerinde morfolojik analizler yapmak için yararlı olan bireysel astrositlerin üç boyutlu yeniden yapılandırılmasına olanak sağlar. Ly iyontoforezi ile birlikte immünohistokimya, astrositlerin sinir sisteminin farklı bileşenleriyle etkileşimini anlamak ve etiketli astrositler içindeki proteinlerin ekspresyonunu değerlendirmek için de kullanılabilir. Bu protokol, ışık mikroskobu ile astrosit morfolojisini titizlikle incelemek için CNS bozukluklarının çeşitli fare modellerinde uygulanabilir. LY iontoforezi, astrosit yapısını değerlendirmek için deneysel bir yaklaşım sağlar, özellikle bu hücrelerin önemli morfolojik değişikliklere uğraması önerildiği yaralanma veya hastalık bağlamında.

Introduction

Astrositler merkezi sinir sistemindeki en bol glial hücrelerdir (CNS). Onlar iyon homeostazı rol oynamak, kan akımı düzenleme, sinaps oluşumu yanı sıra eleme, ve nörotransmitter alımı1. Astrosit fonksiyonlarıgeniş bir yelpazede karmaşık morfolojik yapısı2yansıtılır ,3. Astrositler, sinapslar, dendritler, akslar, kan damarları ve diğer glial hücrelerle doğrudan etkileşime giren binlerce ince dal ve broşüre ayrılan birkaç birincil ve ikincil dal içerir. Astrosit morfolojisi farklı beyin bölgeleri arasında değişir, hangi nöronal devrelerde farklı işlevlerini gerçekleştirmek için yeteneklerini ipucu olabilir4. Ayrıca, astrositler gelişim sırasında morfolojisini değiştirmek için bilinen, fizyolojik koşullar sırasında, ve birden fazla hastalık devletlerde 3,5,6.

Astrosit morfolojisinin karmaşıklığını doğru bir şekilde çözmek için tutarlı, tekrarlanabilir bir yöntem gereklidir. Geleneksel olarak, immünohistokimya astrosit spesifik veya astrosit zenginleştirilmiş protein belirteçleri kullanımı ile astrosit görselleştirmek için kullanılmıştır. Ancak bu yöntemler astrositin yapısından çok protein ekspresyonunun paternini ortaya koymaktadır. Glial fibrillary asidik protein (GFAP) ve S100 kalsiyum bağlayıcı protein β (S100β) gibi yaygın olarak kullanılan belirteçler tüm hücre hacminde ifade etmez ve böylece tam morfolojiyi çözemez7. Floresan proteinleri astrositlerde (viral enjeksiyonlar veya transgenik fare muhabiri çizgileri) her yerde ifade etmek için genetik yaklaşımlar ince dalları ve genel bölgeyi belirleyebilir. Ancak, bireysel astrositleri ayırt etmek zordur ve analizler özel organizatör8tarafından hedeflenen astrosit popülasyonu tarafından önyargılı olabilir. Seri kesit elektron mikroskobu sinapslar ile astrosit süreçlerin etkileşimleri ayrıntılı bir resim ortaya çıkarmak için kullanılmıştır. Sinapslarla temas eden binlerce astrosit süreci nedeniyle, şu anda bu teknik9ile tüm hücreyi yeniden yapılandırmak mümkün değildir , ancak bu veri analizi için makine öğrenme yaklaşımlarının kullanımı ile değişmesi beklenmektedir.

Bu raporda, fare astrositlerini Lucifer sarısı (LY) boya ile hücre içi iyontoforez kullanarak, CA1 stratum radiatum’u örnek olarak kullanarak karakterize eden bir prosedüre odaklanıyoruz. Yöntem Eric Bushong ve Mark Ellisman10,11tarafından öncü geçmiş çalışmaları dayanmaktadır. Hafifçe sabitlenmiş beyin dilimlerinden gelen astrositler kendine özgü soma şekilleri ile tanımlanır ve LY ile doldurulur. Hücreler daha sonra konfokal mikroskopi ile görüntülenir. LY iyontoforezinin tek tek astrositleri yeniden yapılandırmak ve süreçlerinin ve bölgelerinin ayrıntılı morfolojik analizlerini yapmak için nasıl kullanılabileceğini gösteriyoruz. Ayrıca, bu yöntem astrositler ve nöronlar, diğer glial hücreler ve beyin vaskülatür arasındaki mekansal ilişkileri ve etkileşimleri belirlemek için immünohistokimya ile birlikte uygulanabilir. LY iyontoforezinin farklı beyin bölgelerinde morfolojiyi ve sağlıklı veya hastalık lı hastalık lı fare modellerini analiz etmek için çok uygun bir araç olduğunu düşünüyoruz7,12,13.

Protocol

Bu çalışmada hayvan deneyleri, Ulusal Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Için Sağlık Enstitüsü Kılavuzu’na uygun olarak gerçekleştirildi ve Los Angeles California Üniversitesi’ndeki Rektör Hayvan Araştırma Komitesi tarafından onaylandı. Tüm deneylerde karışık cinsiyetli yetişkin fareler (6−8 haftalık) kullanılmıştır. 1. Çözüm Hazırlama Yapay beyin omurilik sıvısı (ACSF) çözeltisi Her deneyden önce taz…

Representative Results

Bu çalışmada bildirilen veriler her deneyde 4 fareden 7−12 hücreden elde edilebistir. Ortalama veriler, uygun olduğu durumlarda şekil panellerinde raporlanır. Astrosit morfolojisini değerlendirmek için, Şekil 1’deözetlenen CA1 stratum radyatumdaki astrositleri doldurmak için LY boyası kullanarak hücre içi iyontoforez uyguladık. Şekil 2 temsili bir astrositi ve ayrıntılı morfolojik yapısını betimlemektedir. Hücre 488 nm la…

Discussion

Bu yazıda özetlenen yöntem, hafifçe sabitlenmiş beyin dilimlerinde LY boyasının hücre içi iontoforezini kullanarak astrosit morfolojisini görselleştirmenin bir yolunu açıklamaktadır. Bu protokolde vurgulanan ve başarılı LY iyontoforezine ve hücrelerin morfolojik rekonstrüksiyonuna katkıda bulunan birçok kritik faktör bulunmaktadır. Bir faktör kalitesi ve büyük ölçüde farenin yaşı ve perfüzyon sonucu tarafından belirlenir görüntülerin çoğaltılabilirlik vardır. Bu çalışmada 6−8 …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Yazarlar rehberlik yanı sıra metin üzerinde yorum için Bayan Soto, Dr Yu ve Dr Octeau teşekkür ederiz. Bu çalışma NS060677 tarafından desteklenir.

Materials

10% Buffered Formalin Phosphate Fisher SF 100-20 An identical alternative can be used
Acrodisc Syringe Filters with Supor Membrane Pall 4692 An identical alternative can be used
Ag/AgCl ground pellet WPI EP2 A similar alternative can be used
Alexa Fluor 546 goat anti-chicken IgG (H+L) Thermo Scientific A-11040 A similar alternative can be used
Alexa Fluor 647 goat anti-rabbit IgG (H+L) Thermo Scientific A27040 A similar alternative can be used
Anti Aquaporin-4 antibody Novus Biologicals NBP1-87679 A similar alternative can be used
Anti GFAP antibody Abcam ab4674 A similar alternative can be used
Borosilicate glass pipettes with filament World precision instruments 1B150F-4
C57BL/6NTac mice Taconic Stock B6 A similar alternative can be used
Calcium Chloride Sigma 21108 An identical alternative can be used
Confocal laser-scanning microscope Olympus FV1000MPE A similar alternative can be used
D-glucose Sigma G7528 An identical alternative can be used
Disodium Phosphate Sigma 255793 An identical alternative can be used
Electrode puller- Model P-97 Sutter P-97 A similar alternative can be used
Fluoromount-G Southern Biotech 0100-01 An identical alternative can be used
Heparin sodium injection (1,000 USP per mL) Sagent Pharmaceuticals 400-10 An identical alternative can be used
Imaris software (Version 7.6.5) Bitplane Inc. A similar alternative can be used
Isofluorane Henry Schein Animal Health 29404 An identical alternative can be used
Lidocaine Hydrochloride Injectable (2%) Clipper 1050035 An identical alternative can be used
Lucifer Yellow CH dilithium salt Sigma L0259
Lucifer Yellow CH dipotassium salt Sigma L0144
Magnesium Chloride Sigma M8266 An identical alternative can be used
Microscope Cover Glass Thermo Scientific 24X60-1 An identical alternative can be used
Microscope Slides Fisher 12-544-2 An identical alternative can be used
Normal Goat Serum Vector Laboratories S-1000 An identical alternative can be used
Objective lens (40x) Olympus LUMPLFLN 40XW A similar alternative can be used
Objective lens (60x) Olympus PlanAPO 60X A similar alternative can be used
PBS tablets, 100 mL VWR VWRVE404 An identical alternative can be used
Pipette micromanipulator- Model ROE-200 Sutter MP-285 / ROE-200 / MPC-200 A similar alternative can be used
Potassium Chloride Sigma P3911 An identical alternative can be used
Sodium Bicarbonate Sigma S5761 An identical alternative can be used
Sodium Chloride Sigma S5886 An identical alternative can be used
Stimulator- Model Omnical 2010 World precision instruments Omnical 2010 A similar alternative can be used
Triton X 100 Sigma T8787 An identical alternative can be used
Vibratome- Model #3000 Pelco 100-S A similar alternative can be used

References

  1. Khakh, B. S., Sofroniew, M. V. Diversity of astrocyte functions and phenotypes in neural circuits. Nature Neuroscience. 18 (7), 942-952 (2015).
  2. Ben Haim, L., Rowitch, D. H. Functional diversity of astrocytes in neural circuit regulation. Nature Reviews Neuroscience. 18 (1), 31-41 (2017).
  3. Schiweck, J., Eickholt, B. J., Murk, K. Important Shapeshifter: Mechanisms Allowing Astrocytes to Respond to the Changing Nervous System During Development, Injury and Disease. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 261 (2018).
  4. Chai, H., et al. Neural Circuit-Specialized Astrocytes: Transcriptomic, Proteomic, Morphological, and Functional Evidence. Neuron. 95 (3), 531-549 (2017).
  5. Sun, D., Jakobs, T. C. Structural remodeling of astrocytes in the injured CNS. Neuroscientist. 18 (6), 567-588 (2012).
  6. Naskar, S., Chattarji, S. Stress Elicits Contrasting Effects on the Structure and Number of Astrocytes in the Amygdala versus Hippocampus. eNeuro. 6 (1), (2019).
  7. Sun, D., Lye-Barthel, M., Masland, R. H., Jakobs, T. C. The morphology and spatial arrangement of astrocytes in the optic nerve head of the mouse. Journal of Comparative Neurology. 516 (1), 1-19 (2009).
  8. Grosche, A., et al. Versatile and simple approach to determine astrocyte territories in mouse neocortex and hippocampus. PLoS ONE. 8 (7), 69143 (2013).
  9. Kaynig, V., et al. Large-scale automatic reconstruction of neuronal processes from electron microscopy images. Medical Image Analysis. 22 (1), 77-88 (2015).
  10. Bushong, E. A., Martone, M. E., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. Protoplasmic astrocytes in CA1 stratum radiatum occupy separate anatomical domains. Journal of Neuroscience. 22 (1), 183-192 (2002).
  11. Wilhelmsson, U., et al. Redefining the concept of reactive astrocytes as cells that remain within their unique domains upon reaction to injury. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (46), 17513-17518 (2006).
  12. Williams, M. E., et al. Cadherin-9 regulates synapse-specific differentiation in the developing hippocampus. Neuron. 71 (4), 640-655 (2011).
  13. Ogata, K., Kosaka, T. Structural and quantitative analysis of astrocytes in the mouse hippocampus. Neuroscience. 113 (1), 221-233 (2002).
  14. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
  15. Hubbard, J. A., Hsu, M. S., Seldin, M. M., Binder, D. K. Expression of the Astrocyte Water Channel Aquaporin-4 in the Mouse Brain. ASN Neuro. 7 (5), (2015).
  16. Benediktsson, A. M., et al. Ballistic labeling and dynamic imaging of astrocytes in organotypic hippocampal slice cultures. Journal of Neuroscience Methods. 141 (1), 41-53 (2005).
  17. Fouquet, C., et al. Improving axial resolution in confocal microscopy with new high refractive index mounting media. PLoS ONE. 10 (3), 0121096 (2015).
  18. Luna, G., et al. Astrocyte structural reactivity and plasticity in models of retinal detachment. Experimental Eye Research. 150, 4-21 (2016).
  19. Octeau, J. C., et al. An Optical Neuron-Astrocyte Proximity Assay at Synaptic Distance Scales. Neuron. 98 (1), 49-66 (2018).
  20. Sosunov, A. A., et al. Phenotypic heterogeneity and plasticity of isocortical and hippocampal astrocytes in the human brain. Journal of Neuroscience. 34 (6), 2285-2298 (2014).
  21. Park, Y. M., et al. Astrocyte Specificity and Coverage of hGFAP-CreERT2 [Tg(GFAP-Cre/ERT2)13Kdmc] Mouse Line in Various Brain Regions. Experimental Neurobiology. 27 (6), 508-525 (2018).
  22. Koeppen, J., et al. Functional Consequences of Synapse Remodeling Following Astrocyte-Specific Regulation of Ephrin-B1 in the Adult Hippocampus. Journal of Neuroscience. 38 (25), 5710-5726 (2018).
  23. Jefferis, G. S., Livet, J. Sparse and combinatorial neuron labelling. Current Opinion in Neurobiology. 22 (1), 101-110 (2012).
  24. Lanjakornsiripan, D., et al. Layer-specific morphological and molecular differences in neocortical astrocytes and their dependence on neuronal layers. Nature Communications. 9 (1), 1623 (2018).

Play Video

Cite This Article
Moye, S. L., Diaz-Castro, B., Gangwani, M. R., Khakh, B. S. Visualizing Astrocyte Morphology Using Lucifer Yellow Iontophoresis. J. Vis. Exp. (151), e60225, doi:10.3791/60225 (2019).

View Video