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Neuroscience

루시퍼 황색 이온토포레시스를 사용하여 성상세포 형태 시각화

doi: 10.3791/60225 Published: September 14, 2019

Summary

성상 세포는 형태학적으로 복잡한 세포이며, 여러 과정과 덤불 영토에 의해 예시됩니다. 그들의 정교한 형태를 분석하기 위하여는, 우리는 가볍게 고정한 조직에서 세포내 Lucifer 황색 이온 포레시스를 능력을 발휘하기 위하여 믿을 수 있는 프로토콜을 제시합니다.

Abstract

성상 세포는 신경 회로의 필수 구성 요소입니다. 그(것)들은 전체 중추 신경계 (CNS)를 타일하고 신경 전달 물질 정리, 이온 규칙, 시냅스 변조, 뉴런에 대한 신진 대사 지원 및 혈류 조절을 포함하는 다양한 기능에 관여합니다. 성상 세포는 소마, 여러 가지, 그리고 neuropil 내의 다양한 세포 요소에 접촉하는 수많은 미세 한 과정이 복잡한 세포입니다. 성상 세포의 형태를 평가하기 위해서는 구조를 시각화하는 신뢰할 수 있고 재현 가능한 방법이 필요합니다. 우리는 성인 마우스에서 가볍게 고정 된 뇌 조직에서 형광 루시퍼 노란색 (LY) 염료를 사용하여 성상 세포의 세포 내 이온 토포레스를 수행하는 신뢰할 수있는 프로토콜을보고합니다. 이 방법에는 성상 세포 형태를 특성화하는 데 유용한 몇 가지 기능이 있습니다. 그것은 개별 성상 세포의 3 차원 재건을 허용, 이는 구조의 다른 측면에 형태 학적 분석을 수행하는 데 유용합니다. LY 이온 토포레시스와 함께 면역 조직 화학은 또한 신경계의 다른 구성 요소와 성상 세포의 상호 작용을 이해하고 표지 된 성상 세포 내에서 단백질의 발현을 평가하기 위해 이용될 수 있습니다. 이 프로토콜은 경검사법으로 성상세포 형태를 엄격하게 검사하기 위해 CNS 장애의 다양한 마우스 모델에서 구현될 수 있다. LY 이온 토포레시스는 성상 세포 구조를 평가하기 위한 실험적 접근법을 제공하며, 특히 이러한 세포가 중요한 형태학적 변화를 겪도록 제안된 부상이나 질병의 맥락에서.

Introduction

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성상 세포는 중추 신경계에서 가장 풍부한 신경교 세포입니다 (CNS). 그들은 이온 항상성, 혈류 조절, 시냅스 형성뿐만 아니라 제거 및 신경 전달 물질 섭취 량1. 성상 세포 함수의 넓은 범위는 복잡한 형태 구조2,3에반영됩니다. 성상 세포는 시냅스, 모수석, 축사, 혈관 및 기타 신경교 세포와 직접 상호 작용하는 수천 개의 미세한 가지와 전단지로 나누는 여러 가지 기본 및 이차 가지를 포함합니다. 성상 세포 형태는 신경 회로4에서 그들의 기능을 차별적으로 수행하는 그들의 기능에 암시할 수 있는 다른 두뇌 지구에 걸쳐변화합니다. 더욱이, 성상 세포는 발달 도중, 생리적인 조건 도중, 및 다중 질병 상태3,5,6에서그들의 형태를 바꾸기 위하여 알려지고 있습니다.

성상 세포 형태학의 복잡성을 정확하게 해결하기 위해서는 일관되고 재현 가능한 방법이 필요합니다. 전통적으로, 면역히스토화학은 성상세포 특이적 또는 성상세포 농축 단백질 마커를 사용하여 성상세포를 시각화하는 데 사용되어 왔다. 그러나, 이러한 방법은 성상 세포의 구조보다는 단백질 발현의 패턴을 드러낸다. 신경교 섬유산성 단백질(GFAP) 및 S100 칼슘 결합 단백질 β(S100β)와 같은 일반적으로 사용되는 마커는 전체 세포 부피에서 발현되지 않으며 따라서 완전한 형태론7을해결하지 못한다. 성상 세포 (바이러스 주사 또는 형질 전환 마우스 기자 라인)에서 유비쿼터스형형 단백질을 발현하는 유전 적 접근법은 미세한 가지 및 전체 영역을 식별 할 수 있습니다. 그러나, 개별 성상세포를 구별하기 어렵고, 분석은 특정 프로모터8에의해 표적화된 성상세포 집단에 의해 편향될 수 있다. 직렬 섹션 전자 현미경 검사법은 시냅스와 성상 세포 프로세스의 상호 작용의 상세한 그림을 밝히기 위하여 이용되었습니다. 시냅스와 접촉하는 수천 개의 성상 세포 프로세스로 인해 현재이 기술9로전체 세포를 재구성 할 수는 없지만 데이터 분석을위한 기계 학습 접근 법을 사용하여 변경 될 것으로 예상됩니다.

이 보고서에서는 CA1 지층 라디덤을 예로 사용하여 루시퍼 옐로우(LY) 염료로 세포내 이온포레시스를 사용하여 마우스 성상세포를 특성화하는 절차에 중점을 둡니다. 이 방법은 에릭 부송과 마크 엘리스만10,11의선구적인 과거 작품을 기반으로합니다. 가볍게 고정 된 뇌 조각에서 성상 세포는 그들의 독특한 소마 모양에 의해 확인 되 고 LY로 가득. 세포는 공초점 현미경 검사법으로 그 때 심상됩니다. 우리는 LY 이온 토포레시스가 개별 성상 세포들을 재구성하고 그들의 프로세스 및 영토의 상세한 형태학적 분석을 수행하는 데 어떻게 사용될 수 있는지 보여줍니다. 또한,이 방법은 성상 세포와 뉴런, 다른 신경교 세포, 뇌 혈관 사이의 공간 관계와 상호 작용을 식별하기 위해 면역 조직 화학과 함께 적용 할 수 있습니다. 우리는 LY 이온 토포레시스가 건강 또는 질병 상태의 다른 뇌 영역 및 마우스 모델에서 형태를 분석하는 매우 적합한 도구라고 생각7,12,13.

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Protocol

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이 연구에서 동물 실험은 실험실 동물의 관리 및 사용에 대 한 건강 가이드의 국립 연구소에 따라 수행 하 고 캘리포니아 대학에서 총리의 동물 연구 위원회에 의해 승인 되었다, 로스 앤젤레스. 성인 마우스(6-8주령)의 혼성 성생을 모든 실험에서 사용하였다.

1. 솔루션 준비

  1. 인공 뇌척수액 (ACSF) 용액
    1. 각 실험 전에 신선한 ACSF 용액(135 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2,14.7 mM NaHCO3,11 mM D-glucose, 1.25 mMNa2HPO4,및 2 mM CaCl2)을준비한다. 마지막 단계에서 MgCl2와 CaCl2를 추가합니다. 성분을 고품질 탈이온수에 용해시면 됩니다.
    2. ACSF 용액을 수조및 기포에서 35°C에서 배양하고 실험 전 30분 동안 95%O2/5%CO2를 배양하였다.
    3. ACSF (100 mL)에서 0.02 %의 최종 농도에 도달하기 위해 2 % 리도카인 염산염을 추가하십시오.
  2. 픽서솔루션
    1. 10% 포르말린 완충 인산염을 사용하십시오.
  3. LY 염료 용액
    1. 5 mM KCl. 소용돌이에 LY CH 딜리튬 염 또는 LY CH 디포타슘 염을 용해시켜 1.5% LY 염료 용액을 준비합니다. 1 mL의 부피는 여러 실험에 충분합니다.
    2. 16,800 x g에서10 분 동안 원심 분리기 . 그런 다음 0.2 μm 주사기 필터로 상구체를 새 튜브로 필터링합니다. 알리쿼트는 최대 3개월 동안 4°C에서 보관할 수 있습니다.
      참고: 전극을 막을 수 있는 염료 입자의 응집을 방지하기 위해 염료 용액을 원심분리하고 여과하는 것이 중요합니다.

2. 마우스 심낭 관류 및 뇌 해부

  1. 수페리어 관류용 장비 및 마우스 준비
    참고:
    C57/BL6 마우스중 어느 쪽도 사용할 수 있습니다. 이 방법이 안정적으로 작동하기 위해, 마우스가 3 개월 이상 오래되지 않는 것이 중요하다는 것을 경험적으로 관찰되었습니다 (6-8 주 이상적이다). 관류 프로토콜은 아래에 설명되어 있습니다. 자세한 내용은14.
    1. ACSF 솔루션으로 투명 관류 튜브를 사용하여 라인의 기포를 제거합니다. 사용 순서대로 수술 도구를 설정하십시오 (핀셋, 곡선, 무딘 가위, 홍채 가위).
    2. 이소플루란 유도 챔버에 마우스를 넣고 2−3 mL의 이소플루란을 챔버에 추가한 후 마우스를 깊이 마취시다. 마취가 효력을 발휘할 수 있도록 1-2분 간 두세요. 호흡이 멈추지 않도록 하십시오.
    3. 발가락 핀치 반사를 테스트합니다. 마우스가 통증 자극에 반응하지 않고 반사가 없을 때 진행합니다. 산소에 5 %의 이소플루란을 공급하고 팔다리와 꼬리가 화학 연기 후드 내부에 테이프로 고정된 채로 머리를 호흡 콘에 넣은 채 척추 위치에 동물을 고정시다.
  2. 트랜스카다이얼 관류
    1. 핀셋을 사용하여 흉곽 아래 피부를 들어 올립니다. 복강을 노출하기 위해 피부를 통해 구부러진 무딘 가위로 5-6cm 절개를 합니다. 간과 횡격막이 보일 때까지 복벽을 통해 위쪽으로 자릅니다.
    2. 간을 다이어그램에서 부드럽게 멀리 이동합니다. 홍채 가위로, 다이어프램에 3−4cm 측면 절개를합니다.
    3. 가슴 구멍을 노출하기 위해 몸의 양쪽을 따라 늑골 케이지를 잘라. 심장을 손상시키고 폐를 피하지 않도록주의하십시오. 흉골을 들어 올려 심장을 노출시하십시오.
    4. 심장이 보이면, 0.05 mL의 헤파린 나트륨 용액 (mL 당 1,000 USP)을 항응고제로 좌심실로 주입하십시오. 그런 다음 관류 바늘을 좌심실로 조심스럽게 삽입하십시오. 바늘이 심실에 남아 있고 다른 심장 챔버로 관통하지 않도록하십시오. 홍채 가위로 오른쪽 심방에서 작은 절개를합니다.
    5. ACSF 용액을 기존 체액이 혈액을 지울 때까지 약 10 mL / min의 속도로 주입하십시오 (1-2 분).
    6. 기포를 도입하지 않고 ACSF 솔루션에서 고정 솔루션으로 전환하십시오. 10-20 mL /min에서 10 분 동안 고정 용액으로 퍼퓨즈하십시오.
      주의 사항: 코에서 고정식 이 배수되지 않도록 주의하십시오. 이것은 바늘이 우심실에 도달하고 고정식이 전신 회로를 통해서 보다는 폐로 바디의 나머지 부분에 여행한다는 것을 표시합니다.
  3. 뇌의 해부
    1. 가위로 마우스의 머리를 제거하고 조심스럽게 두개골에서 마우스 뇌를 해부. 짧은 후 고정 기간 동안 실온에서 1.5 시간 동안 고정 용액에 놓습니다.
      참고: 성공적인 LY 이온 토포레아증을 위해서는 좋은 관류가 필요합니다. 뇌는 흰색이어야하며 뇌 혈관 구조에 혈액이 없어야합니다. 몸과 팔다리가 뻣뻣하게 나타납니다.

3. 슬라이스 준비

  1. 해마 조각의 준비
    1. 실온에서 0.1M 인산완충식염수(PBS)로 뇌를 5분 동안 세척합니다. 그런 다음 필터 종이로 뇌를 건조시키고 날카로운 면도날로 후각 전구와 소뇌를 제거하십시오.
    2. 시아노아크릴레이트 접착제를 사용하여 진동 트레이에 뇌를 장착하고 실온에서 PBS로 트레이를 채웁니다. 110 μm 두께의 해마 관상 섹션을 잘라.
      참고: 진동의 설정을 조정하여 슬라이스의 두께와 표면이 균일한지 확인합니다. 이 실험에서는 계측기의 임의 설정인 4.5 의 속도 설정과 8의주파수 설정이 사용되었습니다. 사용자는 다른 장치의 설정을 실험해야 할 수 있습니다.
    3. 트레이에서 섹션을 수집하고 얼음에 PBS의 접시에 배치합니다.

4. 전극 준비

  1. 적절한 저항으로 날카로운 전극을 준비합니다.
    1. 필라멘트 (O.D. 1.0 mm, I.D. 0.58 mm)와 보로 실리 케이트 유리 단일 배럴 전극을 사용합니다. 마이크로파이펫풀러(재료 표)에전극을 당깁니다. 5 mM KCl에서 1.5 % LY로 채워진 이상적인 전극은 PBS의 욕조에 배치 할 때 200 MΩ의 저항을 가져야합니다.
      참고: 풀러 설정은 장치(사용된 기계 유형 및 풀러 필라멘트)에 따라 다릅니다. 더 높은 열 설정은 일반적으로 더 길고 미세한 팁을 제공합니다. 이 실험에 사용된 마이크로파이펫 풀러의 경우, 열: 317, 당기기: 90, 속도: 70, 및 지연: 70이었다. 쓰루형 필라멘트가 사용되었다.
    2. 먼지가 팁에 들어가지 않도록 밀폐 용기에 전극을 보관하십시오. 팁이 끊어지지 않도록 전극을 상자 바닥에서 높이 유지하십시오.
  2. LY 염료 용액으로 전극을 채웁니다.
    1. 전극을 아래쪽을 향하여 수직 위치에 놓습니다. LY 용액의 파이펫 1-2 μL은 전극의 뒤쪽에 넣고 해가 모세관 작용을 통해 팁으로 이동될 때까지 5-10분 동안 기다린다.
    2. 조작기에 연결된 전극 홀더의 충전 된 전극을 부드럽게 고정하십시오.
      참고: 전극 홀더의 실버 와이어는 전극 내부의 LY와 접촉해야 합니다. 와이어 길이에 따라 필요한 경우 LY 솔루션의 볼륨을 조정합니다.

5. 이온 토포레시스로 성상 세포 채우기

  1. 전극을 테스트합니다.
    1. 실온에서 0.1M PBS로 채워진 유리 바닥 접시에 뇌 슬라이스를 부드럽게 놓습니다. 나일론 끈이 있는 플래티넘 하프로 슬라이스를 제자리에 고정합니다.
    2. 전극이 전압 소스에 연결되어 있는지 확인하고 접지 전극을 뇌 슬라이스가 들어있는 욕조에 넣습니다.
    3. 목표를 관심 있는 뇌 영역으로 이동합니다.
    4. 전극을 용액으로 내립니다. 밝은 들판 아래에서 시야의 중심으로 이동한 다음 40x 수지 렌즈로 주의 깊게 검토하여 이물질이나 거품이 없는 것처럼 보이는지 확인합니다. 전극 팁을 막는 것이 있으면 새 것으로 교체하십시오.
      참고: 막히는 것은 200 MΩ 전극의 문제입니다. 모든 실험 전에 염료 용액의 원심 분리 및 여과로, 이것은 빈번한 문제가 되어서는 안됩니다. 그러나 전극의 끝이 작기 때문에 조직이 때때로 개구부에 끼일 수 있습니다. 저자는 이를 방지할 방법을 찾지 못했지만 새로운 전극을 사용하여 쉽게 처리 할 수 있습니다.
    5. 488 nm 레이저로 공초점 레이저 스캐닝 현미경 아래에서 전극의 끝을 관찰하십시오. 그런 다음, 12 V. 12V. 자극기에서 자극자를 켜서 염료 배출을 시험하고 자극자가 켜져 있는 동안 전극 끝 주위에 큰 형광 염료 구름을 주의하십시오. 전압 자극 시 염료가 전혀 배출되지 않거나 적으면 전극을 교체하십시오.
    6. 밝은 필드 아래에서 전극을 천천히 낮추어 표면 바로 위에 멈춥스로 향합니다.
  2. 이온토포레시스로 성상세포를 채웁니다.
    1. 적외선 차동 간섭 콘트라스트(IR-DIC)를 통해 슬라이스 표면 아래 40-50 μm의 성상 세포를 식별합니다. 직경약 10 μm의 길쭉한 타원형 소마타가 있는 세포를 찾아보십시오. 성상 세포가 선택되면 시야의 중심으로 이동합니다.
      참고: 이온 토포레시스에 대한 좋은 세포는 그 주위에 명확하고 정의 된 테두리를 가지고 있습니다. 완전히 채워질 수 없으므로 슬라이스 표면에 너무 가깝게 셀을 선택하지 마십시오. 염료 충진을 위해 성상 세포들을 일상적으로 식별할 수 있도록 며칠 동안 몇 가지 연습이 필요합니다. 실험에 사용되는 뇌 영역에 따라 성상 세포의 수가 다를 수 있습니다. 이것은 충전하기 전에 성상 세포체를 식별하는 데 필요한 시간에 영향을 미칠 수 있습니다.
    2. 전극 팁을 슬라이스로 천천히 내리고 조직을 탐색하여 세포체와 동일한 평면에 있습니다.
      참고: 조직을 손상시키지 않도록 전극을 천천히 움직입니다.
    3. 성상 세포의 세포 체가 명확하게 표시되고 윤곽이 잡히면 천천히 부드럽게 전극을 앞으로 진행합니다. 팁이 세포의 소마를 찔러 줄 때까지 전극을 이동합니다. 전극이 소마 내부에 있는지 주의하기 위해 목표의 초점을 천천히 위아래로 이동합니다.
      참고: 전극 팁은 세포 체 내부에 있어야하며 소마에 대한 작은 들여 쓰기를 관찰해야합니다. 전극을 더 이상 움직이지 말고 전지를 통과하는 팁을 피하십시오.
    4. 전극 팁이 셀 내부에 들어가면 자극기 (~0.5-1 V)를 켜고 지속적으로 전류를 세포로 내보합니다. 공초점 현미경을 사용하여 세포 가 채워지는 것을 지켜보십시오. 디지털 줌을 늘려 셀의 세부 정보를 확인하고 전극의 끝이 셀 내부에 보이는지 확인합니다.
      참고: 염료가 셀 밖으로 새기거나 주변의 다른 셀을 채우는 것으로 나타나면 전압을 낮춥니다. 염료가 여전히 세포밖으로 새는 것처럼 보이는 경우, 천천히 전극을 꺼내 다른 세포를 찾으십시오. 염료가 누출되지 않는 것이 최종 이미지에서 높은 신호/배경 비율을 가지는 것이 중요합니다.
    5. 미세한 가지와 프로세스가 정의 될 때까지 약 15 분 동안 기다렸다가 전압을 끄고 전극 팁을 셀에서 부드럽게 인출하십시오.
  3. 채워진 셀을 이미지화합니다.
    참고 :
    이미징은 면역 성 화학으로 염색을 채우거나 염색 한 직후에 수행 할 수 있습니다. 숫자 조리개(NA)가 높은 목표는 더 나은 해상도를 제공합니다.
    1. 세포가 40배 의 목표치로 이미징(15-20분)하기 전에 원래 형태로 돌아올 때까지 기다립니다. 셀을 이미지화하려면 공초점의 설정을 조정하여 더 미세한 분기와 프로세스가 정의된 것처럼 보이도록 합니다.
    2. 단계 크기가 0.3 μm인 z 스택을 설정합니다. 이미징하는 동안 셀에서 신호가 없을 때까지 목표를 이동하고 이를 맨 위로 설정합니다. 그런 다음 신호가 없을 때까지 목표를 아래로 이동 (셀을 통해 초점)을 아래로 이동하고 바닥으로 설정합니다.
    3. 이미징이 완료된 후 전극에 염료 배출이 있는지 확인합니다. 큰 염료 구름이 나타나면 다음 슬라이스에 사용할 수 있습니다. 그렇지 않으면 새 전극으로 교체하십시오.
      참고: 단일 성상 세포 및 이미징의 염료 충전은 약 45 분에서 1 시간 정도 걸립니다. 이러한 특정 실험을 위해, 마우스당 약 3-6 세포를 얻을 수 있었다. 필요한 경우 동일한 슬라이스에 여러 셀을 레이블을 지정할 수 있습니다. 그러나 개별 성상 세포를 구별하려면 세포 간에 약 200 μm의 거리를 유지해야합니다.

6. 면역 항화학염색 (선택 사항)

  1. 이미징이 완료되면 즉시 10 % 포르말린을 얼음에 놓아 면역 화학을 보존하십시오. 뇌 조각을 어둠 속에서 유지하고 4 °C에서 하룻밤 보관하십시오.
  2. 0.1 M PBS에서 3x를 세척하여 0.5% 난오계면활성제(즉, 트리톤 X 100)를 각각 5분동안 세척한다. 그런 다음 0.5% 난오계면활성제와 10% 정상 염소 혈청(NGS)으로 0.1 M PBS의 차단 용액을 실온에서 1시간 동안 부드러운 교반으로 배양한다.
  3. 0.1 M PBS에서 희석된 1차 항체에서 교반된 부분을 0.5% 난오계면활성제와 5% NGS로 4°C에서 2일간 배양하였다.
    참고: 뇌 슬라이스의 두께 때문에, 1 차 항체의 잠복기는 더 나은 침투를 위해 연장될 필요가 있고 항체 사격량은 증가될 수 있습니다. 본 실험에서, 항 GFAP 항체에 1:500 희석을 사용하고 항 아쿠아포린-4 항체에 1:500 희석을 사용하였다.
  4. 0.1 M PBS에서 3x 섹션을 각각 0.5 % nonionic 계면활성제로 10 분 동안 세척 한 다음 0.1 M PBS로 희석 된 이차 항체로 배양하고 실온에서 0.5 % nonionic 계면 활성제 및 10 % NGS를 실온에서 6 시간 동안 배양합니다.
    참고: 488 nm에 의해 흥분된 이차 항체를 선택하지 마십시오, 이는 LY 염료를 가시화하는 데 사용되는 파장이다. 본 실험에서, 1:1,000 희석은 알렉사 플루어 546 염소 안티-닭 IgG (H+L) 및 알렉사 플루어 647 염소 안티-토끼 IgG (H+L)에 사용되었다.
  5. 섹션 3x를 0.1 M PBS로 각각 10분 동안 헹구어 냅니다. 그런 다음 형광에 적합한 장착 매체에 유리 현미경 슬라이드에 섹션을 장착합니다. 밀봉 슬라이드. 0.3 μm의 단계 크기로 이미지 셀.

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Representative Results

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본 연구에서 보고된 데이터는 각 실험에서 4개의 마우스로부터 7-12개의 세포로부터 의입니다. 평균 데이터는 적절한 경우 그림 패널에 보고됩니다.

성상 세포 형태를 평가하기 위해, 우리는 그림 1에요약된 CA1 지층 라디에움에 성상 세포를 채우기 위해 LY 염료를 사용하여 세포 내 이온 토포레증을 수행했습니다. 그림 2는 대표적인 성상 세포와 정교한 형태학적 구조를 묘사합니다. 셀은 488 nm 레이저 라인 (0.3 μm 및 3.0-3.5 배 디지털 줌의 단계 크기)을 사용하여 공초점 레이저 스캐닝 현미경에 60 x 오일 침지 렌즈로 후 고정을 이미지화했습니다. 공초점 현미경의 광증배관(PMT), 오프셋 및 게인 기능을 조정하여 최종 이미지에서 높은 신호/배경 비율을 생성하였다. 그림 2A에서서로 다른 z-단계의 단일 광학 평면 이미지(1-6에서 순서대로 레이블이 지정된 10μm마다 표시됨)는 중앙 소마와 조밀한 프로세스 네트워크로 분할된 여러 주요 분기를 보여줍니다. 최대 강도 투영(스택 크기 85 μm)을 생성하여 성상 세포체 및 그 도메인의 구조에 대한 상세한 뷰를 관찰했습니다(그림2B). 성상 세포의 구조의 주요 구성 요소도 지적 되었습니다. 그림 2 C는 하나의 주요 분기, 여러 보조 분기 및 주변 분기 및 전단지의 분포를 확대(x4) 최대 강도 투영을 보여줍니다.

성상 세포의 형태 학적 분석 및 재구성은 LY 채워진 성상 세포의 사후 고정 이미지를 사용하여 Imaris 분석 소프트웨어(재료의 표)로수행되었다 (ImageJ와 같은 다른 소프트웨어도 사용할 수 있습니다). 각 성상 세포의 재건이 완료 된 후, 소마의 볼륨, 주요 지점, 프로세스, 영토는 정량화되었다. 소마는 x-y 평면 분해능 한계(0.25 μm)로 설정된 표면 스무딩으로 먼저 작성되었습니다. 최소 개체 직경은 3.0 μm로 설정하여 세포 체와 연관되지 않은 다른 객체를 제거한다. 주요 가지를 만들기 위해 세포의 나머지 부분과 관련된 밝기로 인해 소마의 강도가 가려졌습니다. 주요 가지의 표면 스무딩 및 최소 객체 직경은 0.3 μm(z 평면 스텝 크기)로 설정되었다. 프로세스를 만들기 위해 주요 가지의 강도도 가려졌습니다. 표면 스무딩은 0.18 μm로 설정하고 최소 물체 직경은 0.3 μm로 설정되었다. 성상 세포의 영역은 0.75 μm로 설정된 낮은 강도 임계값 및 표면 스무딩을 사용하여 생성되었습니다. 그림 3A는 CA1 성상 세포의 원래 이미지를 보여줍니다. 세포체, 주요 가지, 프로세스 및 성상 세포로 둘러싸인 영토 부피는 도 3B-E에서재구성된다. 세포의 재구성이 생성 된 후, 소마, 전체 세포 및 영토의 부피를 정량화하고 주요 가지수를 계산했습니다(표 1). 지층 라디에이텀으로부터의 CA1 성상세포는 평균 소마 부피 488.91 μm3,~7차 가지의 평균, 평균 세포 부피 5.58 x 103 μm3,평균 영토 부피 2.94 x 104 μm3을가졌다.

잘 특성화 된 성상 세포 마커, GFAP는 성상 세포의 중간 필라멘트를 라벨화하는 세포골격 단백질8. 성상 세포가 채워진 후, 우리는 개별 성상 세포에서 의 발현을 시각화하기 위해 GFAP에 대한 면역 염색을 수행하였다(그림 4). 우리는 GFAP가 세포 소마, 주요 가지 및 성상 세포의 일부 이차 가지에서 발현되었지만 미세한 가지 및 프로세스에서는 발현되지 않는다는 것을 발견했습니다(그림 4A). GFAP에 의해 레이블이 지정된 기본 분기의 수와 LY로 시각화된 분기수(p = 0.1573)에서 유의한 차이가 발견되지 않았습니다. 그림 4 B).GFAP에 의해 표지된 성상 세포의 세포 면적 및 부피는 LY로 시각화된 면적 및 부피보다 현저히 작았다(p&0.0001; 그림 4 C,D). 이는 GFAP가 주요 분기에 레이블을 지정하기 위한 신뢰할 수 있는 마커이지만 셀의 전체 면적 또는 부피를 결정하는 데는 유용하지 않음을 보여 줍니다.

성상 세포의 중요한 특징은 혈관에 접촉하고 CNS에 있는 혈류량을 통제하는 것을 돕기 위하여 제안되는 그들의 endfeet입니다. 성상 세포와 뇌 혈관 사이의 공간 관계를 더 이해하기 위해, 우리는 다음 염료 충전에 대한 항체로 염색. 아쿠아포린-4는 성상세포 및 형형혈세포에서 발견되는 수채널 단백질이며, 심실 및혈관(15)근처 영역에서 고도로 발현된다. 우리는 아쿠아포린-4가 뇌 혈관구조에 근접한 성상세포 종단에 발현된다는 것을 발견했습니다(그림5A). 이미지는 서로 다른 위치에서 혈관에 접촉하는 세 개의 성상 세포 endfeet을 묘사합니다 (흰색 화살표로 표시). CA1 지층 라디에이터툼에서, 성상세포당 평균 단부 수는 ~2(도5B)였다. 흥미롭게도, 단구를 포함하는 가지는 주요 분기 재구성 (p = 0.0038)을 사용하여 성상 세포의 다른 기본 분기보다 상당히 두껍습니다. 그림 5 C).우리는 또한 소마의 중심에서 혈관에 대한 단피트를 포함하는 가지의 길이를 측정하고 혈관에 가장 짧은 직접 경로에 비교. 혈관에 대한 가지의 실제 길이는 최단 경로(p=0.0333;; 그림 5 D)는이러한 가지가 혈관으로 더 길고 순회적인 경로를 취하는 경향이 있음을 시사한다. 영화 1은 LY로 채워진 성상 세포와 아쿠아포린-4 얼룩의 재건 을 묘사한 영화입니다. 성상 세포 (soma, 주요 지점, 프로세스 및 영토)의 다른 구조 구성 요소는 3 차원으로 표현됩니다. LY 채워진 성상 세포와 아쿠아포린-4 염색은 혈관을 둘러싸는 성상 세포 종말을 묘사합니다. 주요 가지와 혈관의 재건에서, 단구를 포함하는 가지는 소마에서 혈관까지 연장되는 가시화 될 수 있습니다.

p 값이 보고되는 이전 섹션에서는 페어링되지 않은 학생의 t 검정을 사용했으며, 그 중 의지는 p < 0.05입니다.

Figure 1
그림 1: LY 이온 토포레시스의 워크플로우 다이어그램. 중요한 단계를 강조하는 프로토콜의 개략적 표현입니다. 마우스를 고정제로 관착한 후 뇌가 해부되었습니다. 짧은 후 고정 기간 후, 관상 동맥 부분은 진동으로 절단되었다. 전극은 1.5% LY 염료로 백필되었다. 성상 세포는 빛 현미경에 IR-DIC를 사용하여 CA1 지층 라디에이터움에서 확인되었다. 세포의 소마를 전극에 의해 찔려, 미세한 공정이 완전히 채워질 때까지 0.5-1 V를 적용하여 세포내로 염료를 주입하였습니다. 슬라이스는 40x 침지 렌즈를 사용하여 공초점 현미경으로 이미지화한 다음 면역 조직 화학을 위해 처리되었습니다. 추가 이미징은 세포 재건 및 형태학적 분석을 수행하기 위해 60x 오일 침지 렌즈로 완성되었습니다. 도시된 것은 프로세스의 재구성 예이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
그림 2: CA1 지층 라디에이터움의 LY 충전 성상 세포. (A)10 μm마다 표시된 성상 세포에서 단일 광학 평면 이미지 (레이블 1−6). (B)세포 소종, 여러 주요 가지 및 덤불 영토를 구성하는 수많은 과정을 묘사하는 성상 세포의 최대 투영. (C)하나의 주요 분기(노란색으로 설명된 섹션에서) 두 개의 보조 분기, 여러 분기 및 주변 프로세스의 구성의 최대 투영(확대/축소 x4)입니다. 배율 표시줄 = 10 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
그림 3: LY채워진 성상 세포 및 그 구성 요소의 재구성. (A)CA1 성상 세포는 LY로 채워져 있습니다. (B-E) 소마(B),소마 및 주요 가지(C),프로세스(D)및 영토(E)의3 차원 재구성은 0 ° 및 45 ° 방향. 배율 표시줄 = 10 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 4
도 4: LY 채워진 성상 세포에서 GFAP 면역 염색. (A)대표적인 Z-프로젝션LY(그린) 및 GFAP(마젠타) 염색. GFAP는 주로 성상 세포의 기본 및 일부 보조 지점에서 표현되지만 전체 성상 세포 영토 내에서 발견되지 않았습니다. 배율 막대 = 10 μm.(B)LY 및 GFAP에 의해 레이블이 지정된 기본 분기 수의 그래프입니다. (C)LY 및 GFAP 염색으로 표시된 세포 영역. (D)LY 및 GFAP 염색으로 표시된 세포 볼륨. 열린 원은 평균 ±SEM을 나타내는 닫힌 제곱을 가진 원시 데이터입니다. 데이터는 4개의 마우스로부터 12개의 세포로부터 수집되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 5
그림 5: LY 채워진 성상 세포에서 아쿠아포린-4 면역 염색. (A)대표적인 Z-프로젝션LY(그린)와 아쿠아포린-4 염색(마젠타). 아쿠아포린-4는 주로 성상세포의 말단에서 발성된다. 흰색 화살표는 근처의 혈관에 접촉할 때 세 개의 엔드피트를 나타냅니다. 축척 막대 = 10 μm.(B)성상 세포당 끝피트가 있는 가지 수입니다. (C)성상 세포의 다른 기본 지점에 비해 끝발 과 가지의 두께. (D)혈관에 대한 가장 짧은 경로에 비해 단발이있는 가지의 길이. 오픈 서클은 평균 ±SEM을 나타내는 닫힌 제곱을 가진 원시 데이터이며, 데이터는 4개의 마우스로부터 7개의 세포로부터 수집되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Movie 1
영화 1: LY 채워진 성상 세포와 아쿠아 포린-4 얼룩의 재건. 혈관에 근접한 CA1 성상 세포의 대표적인 영화. 소마, 주요 가지, 프로세스 및 영토는 세포의 형태를 분석하기 위해 재구성되었습니다. 아쿠아포린-4와 함께 주요 가지의 재건은 두 개의 성상 세포 종말이 혈관에 직접 접촉하는 것을 묘사합니다. 이 비디오를 보려면 여기를 클릭하십시오. (다운로드하려면 마우스 오른쪽 단추로 클릭합니다.)

형태학적 특성 평균 ± SEM
소마 부피 (μm3) 489 ± 30
기본 분기 수 7.0 ± 0.5
세포 부피 (μm3) 5580 ± 425
영토 부피(μm3) 29391 ± 8150
셀 수 14

표 1: 성상 세포 구조의 형태학적 분석. 성상 세포 소종 부피, 성상 세포 당 기본 분기의 수, 성상 세포 세포 볼륨, 및 성상 세포 영역으로 둘러싸인 부피가 표시됩니다. 데이터는 7개의 마우스로부터 14개의 세포로부터 수집되었다.

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Discussion

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이 백서에 설명된 방법은 가볍게 고정된 두뇌 조각에 있는 LY 염료의 세포내 이온 백공증을 사용하여 성상 세포 형태를 구상하는 쪽을 기술합니다. 세포의 성공적인 LY 이온 토포레시스 및 형태학적 재건에 기여하는 이 프로토콜에서 강조된 몇몇 중요한 요인이 있습니다. 한 가지 요인은 이미지의 품질과 재현성이며, 이는 주로 마우스의 나이와 관류의 결과에 의해 결정됩니다. 이 연구에서는, 우리는 C57/BL6N 마우스 6-8 주 를 사용했습니다. 성공적인 관류 (정중한 바늘의 적절한 배치에 크게 의존하고 백색 색의 뇌와 뇌 혈관에 혈액이 없는 것으로 지적)는 가장 상세하고 명확하게 채워진 세포에 필요합니다. 전극에 의한 탈백 후, 세포막은 전극의 끝 주위에 단단한 밀봉을 유지하고 염료가 새는 것을 방지해야 합니다. 최선의 노력에도 불구하고, 때때로 세포 외부의 다른 구조는 피펫이 뇌 조직을 통해 진행됨에 따라 채워질 것입니다 : 우리는 분석에서이 세포를 제외. 전극의 저항은 추가적인 핵심 요소입니다. 높은 저항은 전압 자극시 전극 팁에서 염료의 꾸준한 배출을 허용합니다. 더 기술적으로, 전극으로 세포의 소마를 찔리면 부드럽고 느린 움직임을 유지하는 것이 중요합니다. 전극이 세포를 관통하면 소마로부터 염료 누출이 발생할 수 있다. 전압 응용 에 이어 성공적인 impalement는 세포 체와 프로세스의 거의 즉각적인 염료 충진 (즉, 몇 초 이내에)을 초래한다. 성상 세포가 완전히 채우는 데 필요한 시간은 성상 이 포함하는 영토와 관련이 있습니다. 그러나 더 미세한 프로세스가 완전히 채워지도록 기다립니다(최소 15분).

우리는 이 프로토콜이 성상 세포 형태를 자세히 연구하는 가장 충실한 방법이라는 것을 발견했지만, 그럼에도 불구하고 이 방법은 한계가 있습니다. 셀을 식별하는 것은 시간이 많이 걸리고 오류가 발생하기 쉽습니다. IR-DIC에서 특정 세포 유형 (소마 모양 및 크기)을 표시하는 독특한 특징을 식별해야합니다. 대안적으로, 성상세포에서 구체적으로 적색 형광 리포터의 발현은, 바이러스 주사 또는 형질전환 마우스 리포터 라인에 의해, 충전하기 전에 이들 세포의 보다 쉽게 식별할 수 있도록한다. 또한, LY는 성상세포막에 라벨을 붙이는 데 사용할 수 없기 때문에, Lck-GFP16과같은 막 테더GFP로 라벨링하는 것에 비해 세포질 염료로 제한된다. Ly 이온토포레시스가 성상세포의 내부 부피를 드러내기 때문에 Lck-GFP는 전체 영토 영역을 보다 정확하게 표현할 수 있습니다. 그러나 실험 설계에 따라 LY 이온 토포레시스는 전체 성상 세포 내부 부피를 해결하고, 3차원 재구성을 개발하고, 성상 세포의 구조를 구성하는 해부학 적 구성 요소를 정량화하는 데 더 적합합니다6 . 마지막으로, 모든 형태의 공초점 현미경 검사법과 마찬가지로, 공간 분해능은 회절에 의해 제한되며, 현미경광학(17)의점 확산 기능으로 지적된다. 핀홀 직경 감소와 같은 이미징 시스템의 구성 요소를 변경하면 이미지를 개선하는 데 도움이 되지만 실제 해상도는 빛의 파장과 대물 렌즈의 수치 조리개에 의해 결정됩니다. 우리의 경우, 우리는 가능한 최선의 해상도는 아마도 z 축에서 더 악화 될 가능성이 약 300 nm입니다 추정한다.

LY 이온 토포레시스는 성상 세포에 라벨을 붙이기 위해 일반적으로 사용되는 다른 방법에 비해 몇 가지 장점을 제공합니다. 프로토콜은 성상 세포 특정 프로모터 또는 형질전환 마우스 라인에 의해 제한되지 않기 때문에 임의의 확립된 마우스 모델, 세포 집단, 또는 뇌 영역18,19,20에 적용될 수 있다. 바이러스 주사 또는 형질전환 마우스 리포터 라인 (즉, td-Tomato)에 의해 성상 세포에서 유비쿼터스형으로 형광 단백질을 발현하는 유전 적 접근법은 성상 세포 프로모터의 사용을 필요로하며, 일부 지역에서는 다른 세포 유형에서 발현 될 수 있거나 그렇지 않습니다. 모든 성상 세포21을포함합니다. LY 이온 토포레시스는 형광 성 단백질의 바이러스 주사가 특정 바이러스를 발현하기 위해 수술과 시간이 필요하고 형질전환 마우스 라인이 번식을 필요로하기 때문에 시간 효율적입니다. 마지막으로, LY 이온 토포레시스는 개별 세포를 구별하는 유용한 방법이며, 다른 전략은 또한 개별 성상 세포22,23의영토를 시각화하기 위해 희소 라벨링 방법과 결합될 필요가있다. 24. 그러나, 하나의 방법은 만병 통치약이며, 사용되는 선택은 해결되는 특정 질문에 맞게 조정 될 필요가있다.

향후 연구는 특정 실험 조작을 채택하고 형태학적 질문에 대답하기 위해 성상 세포 구조 (소마, 지점, 프로세스, 영토 등)의 다른 구성 요소를 검사 할 수 있습니다. 이것은 초고해상도 광 현미경 검사법 또는 전자 현미경 검사법에 의해 추가로 분석될 수 있던 성상 세포 형태학 및 그것의 기능적인 연루에 통찰력 그리고 방향을 제공할 수 있었습니다4. 예를 들어, LY 이온 토포레시스는 수천 개의 시냅스에 접촉하고 시냅스 기능에 관여하는 미세 한 성상 세포 과정을 시각화하는 수단을 제공합니다. 이 프로세스의 구조가 다른 병리학 적 조건에서 어떻게 변화하는지 연구하면 건강과 질병에서 성상 세포의 역할을 해명하는 데 도움이 될 수 있습니다. LY 이온 토포레시스는 상세한 세포 형태를 시각화하고 중추 신경계에서 자신의 기능을 더 잘 이해하기 위해 성상 세포 특성을 특성화하는 중요한 기술입니다.

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Disclosures

저자는 공개 할 것이 없다.

Acknowledgments

저자는 소토 씨, 유 박사, 옥토 박사에게 지도와 텍스트에 대한 의견에 감사드립니다. 이 작업은 NS060677에서 지원됩니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10% Buffered Formalin Phosphate Fisher SF 100-20 An identical alternative can be used
Acrodisc Syringe Filters with Supor Membrane Pall 4692 An identical alternative can be used
Ag/AgCl ground pellet WPI EP2 A similar alternative can be used
Alexa Fluor 546 goat anti-chicken IgG (H+L) Thermo Scientific A-11040 A similar alternative can be used
Alexa Fluor 647 goat anti-rabbit IgG (H+L) Thermo Scientific A27040 A similar alternative can be used
Anti Aquaporin-4 antibody Novus Biologicals NBP1-87679 A similar alternative can be used
Anti GFAP antibody Abcam ab4674 A similar alternative can be used
Borosilicate glass pipettes with filament World precision instruments 1B150F-4
C57BL/6NTac mice Taconic Stock B6 A similar alternative can be used
Calcium Chloride Sigma 21108 An identical alternative can be used
Confocal laser-scanning microscope Olympus FV1000MPE A similar alternative can be used
D-glucose Sigma G7528 An identical alternative can be used
Disodium Phosphate Sigma 255793 An identical alternative can be used
Electrode puller- Model P-97 Sutter P-97 A similar alternative can be used
Fluoromount-G Southern Biotech 0100-01 An identical alternative can be used
Heparin sodium injection (1,000 USP per mL) Sagent Pharmaceuticals 400-10 An identical alternative can be used
Imaris software (Version 7.6.5) Bitplane Inc. A similar alternative can be used
Isofluorane Henry Schein Animal Health 29404 An identical alternative can be used
Lidocaine Hydrochloride Injectable (2%) Clipper 1050035 An identical alternative can be used
Lucifer Yellow CH dilithium salt Sigma L0259
Lucifer Yellow CH dipotassium salt Sigma L0144
Magnesium Chloride Sigma M8266 An identical alternative can be used
Microscope Cover Glass Thermo Scientific 24X60-1 An identical alternative can be used
Microscope Slides Fisher 12-544-2 An identical alternative can be used
Normal Goat Serum Vector Laboratories S-1000 An identical alternative can be used
Objective lens (40x) Olympus LUMPLFLN 40XW A similar alternative can be used
Objective lens (60x) Olympus PlanAPO 60X A similar alternative can be used
PBS tablets, 100 mL VWR VWRVE404 An identical alternative can be used
Pipette micromanipulator- Model ROE-200 Sutter MP-285 / ROE-200 / MPC-200 A similar alternative can be used
Potassium Chloride Sigma P3911 An identical alternative can be used
Sodium Bicarbonate Sigma S5761 An identical alternative can be used
Sodium Chloride Sigma S5886 An identical alternative can be used
Stimulator- Model Omnical 2010 World precision instruments Omnical 2010 A similar alternative can be used
Triton X 100 Sigma T8787 An identical alternative can be used
Vibratome- Model #3000 Pelco 100-S A similar alternative can be used

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References

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루시퍼 황색 이온토포레시스를 사용하여 성상세포 형태 시각화
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Moye, S. L., Diaz-Castro, B., Gangwani, M. R., Khakh, B. S. Visualizing Astrocyte Morphology Using Lucifer Yellow Iontophoresis. J. Vis. Exp. (151), e60225, doi:10.3791/60225 (2019).More

Moye, S. L., Diaz-Castro, B., Gangwani, M. R., Khakh, B. S. Visualizing Astrocyte Morphology Using Lucifer Yellow Iontophoresis. J. Vis. Exp. (151), e60225, doi:10.3791/60225 (2019).

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