Visualiser la morphologie de l'astrocyte à l'aide de lucifer Yellow Iontophoresis
Summary
Les astrocytes sont des cellules morphologiquement complexes, illustrées par leurs multiples processus et territoires touffus. Pour analyser leur morphologie élaborée, nous présentons un protocole fiable pour exécuter l’iontophoresis jaune intracellulaire de Lucifer dans le tissu légèrement fixé.
Abstract
Les astrocytes sont des composants essentiels des circuits neuronaux. Ils carirent l’ensemble du système nerveux central (SNC) et sont impliqués dans une variété de fonctions, qui comprennent le dégagement des neurotransmetteurs, la régulation des ions, la modulation synaptique, le soutien métabolique aux neurones, et la régulation du flux sanguin. Les astrocytes sont des cellules complexes qui ont un soma, plusieurs branches principales, et de nombreux processus fins qui contactent divers éléments cellulaires dans le neuropil. Afin d’évaluer la morphologie des astrocytes, il est nécessaire d’avoir une méthode fiable et reproductible pour visualiser leur structure. Nous rapportons un protocole fiable pour exécuter l’iontophoresis intracellulaire des astrocytes utilisant le colorant jaune fluorescent de Lucifer (LY) dans le tissu de cerveau légèrement fixé des souris adultes. Cette méthode a plusieurs caractéristiques qui sont utiles pour caractériser la morphologie des astrocytes. Il permet la reconstruction tridimensionnelle des astrocytes individuels, ce qui est utile pour effectuer des analyses morphologiques sur différents aspects de leur structure. L’immunohistochimie avec l’iontophoresis de LY peut également être employée pour comprendre l’interaction des astrocytes avec différents composants du système nerveux et pour évaluer l’expression des protéines dans les astrocytes étiquetés. Ce protocole peut être mis en œuvre dans une variété de modèles murins de troubles du SNC pour examiner rigoureusement la morphologie des astrocytes avec microscopie légère. LY iontophoresis fournit une approche expérimentale pour évaluer la structure des astrocytes, en particulier dans le contexte de blessures ou de maladies où ces cellules sont proposées pour subir des changements morphologiques importants.
Introduction
Les astrocytes sont les cellules gliales les plus abondantes du système nerveux central (SNC). Ils jouent des rôles dans l’homéostasie ionique, la régulation du flux sanguin, la formation de synapse ainsi que l’élimination, et l’élimination des neurotransmetteurs1. La large gamme de fonctions d’astrocyte se reflète dans leur structure morphologique complexe2,3. Les astrocytes contiennent plusieurs branches primaires et secondaires qui se divisent en milliers de branches et de folioles plus fines qui interagissent directement avec les synapses, les dendrites, les axones, les vaisseaux sanguins et d’autres cellules gliales. La morphologie des astrocytes varie selon les régions du cerveau, ce qui peut indiquer leur capacité à remplir leurs fonctions de façon différentielle dans les circuits neuronaux4. En outre, les astrocytes sont connus pour modifier leur morphologie au cours du développement, pendant les conditions physiologiques, et dans les états de maladie multiples3,5,6.
Une méthode cohérente et reproductible est nécessaire pour résoudre avec précision la complexité de la morphologie des astrocytes. Traditionnellement, l’immunohistochimie a été utilisée pour visualiser les astrocytes avec l’utilisation de marqueurs de protéines enrichis d’astrocytes ou d’astrocytes. Cependant, ces méthodes révèlent le modèle d’expression des protéines plutôt que la structure de l’astrocyte. Les marqueurs couramment utilisés, tels que la protéine acide fibrillaire gliale (GFAP) et la protéine de liaison du calcium S100 (S100), ne s’expriment pas dans l’ensemble du volume cellulaire et ne résolvent donc pas la morphologie complète7. Les approches génétiques pour exprimer les protéines fluorescentes de façon omniprésente dans les astrocytes (injections virales ou lignes transgéniques de reporter de souris) peuvent identifier les branches plus fines et le territoire global. Cependant, il est difficile de différencier les astrocytes individuels, et les analyses peuvent être biaisées par la population d’astrocytes ciblée par le promoteur spécifique8. La microscopie électronique de section série a été employée pour indiquer une image détaillée des interactions des processus d’astrocyte avec des synapses. En raison des milliers de processus d’astrocyte s’entrelaçant des synapses, il n’est actuellement pas possible de reconstruire une cellule entière avec cette technique9, bien que cela devrait changer avec l’utilisation d’approches d’apprentissage automatique pour l’analyse des données.
Dans ce rapport, nous nous concentrons sur une procédure pour caractériser les astrocytes de souris utilisant l’iontophoresis intracellulaire avec le colorant jaune de Lucifer (LY), utilisant le radiatum de strate de CA1 comme exemple. La méthode est basée sur des travaux passés pionniers par Eric Bushong et Mark Ellisman10,11. Les astrocytes des tranches de cerveau légèrement fixes sont identifiés par leur forme distinctive de soma et remplis de LY. Les cellules sont ensuite représentées avec une microscopie confocale. Nous démontrons comment l’iontophoresis de LY peut être employé pour reconstruire les astrocytes individuels et effectuer des analyses morphologiques détaillées de leurs processus et territoire. En outre, cette méthode peut être appliquée en conjonction avec l’immunohistochimie pour identifier les relations spatiales et les interactions entre les astrocytes et les neurones, d’autres cellules gliales, et la vascularisation du cerveau. Nous considérons l’iontophoresis de LY comme un outil très approprié pour analyser la morphologie dans différentes régions du cerveau et modèles de souris des conditions saines ou de la maladie7,12,13.
Protocol
Representative Results
Discussion
La méthode décrite dans cet article décrit une manière de visualiser la morphologie d’astrocyte utilisant l’iontophoresis intracellulaire du colorant de LY dans les tranches légèrement fixes de cerveau. Il y a plusieurs facteurs critiques mis en évidence dans ce protocole qui contribuent à l’iontophoresis réussi de LY et à la reconstruction morphologique des cellules. Un facteur est la qualité et la reproductibilité des images, qui est déterminée en grande partie par l’âge de la souris et le résultat de l…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs remercient Mme Soto, le Dr Yu et le Dr Octeau pour leurs conseils ainsi que leurs commentaires sur le texte. Ce travail est soutenu par NS060677.
Materials
| 10% Buffered Formalin Phosphate | Fisher | SF 100-20 | An identical alternative can be used |
| Acrodisc Syringe Filters with Supor Membrane | Pall | 4692 | An identical alternative can be used |
| Ag/AgCl ground pellet | WPI | EP2 | A similar alternative can be used |
| Alexa Fluor 546 goat anti-chicken IgG (H+L) | Thermo Scientific | A-11040 | A similar alternative can be used |
| Alexa Fluor 647 goat anti-rabbit IgG (H+L) | Thermo Scientific | A27040 | A similar alternative can be used |
| Anti Aquaporin-4 antibody | Novus Biologicals | NBP1-87679 | A similar alternative can be used |
| Anti GFAP antibody | Abcam | ab4674 | A similar alternative can be used |
| Borosilicate glass pipettes with filament | World precision instruments | 1B150F-4 | |
| C57BL/6NTac mice | Taconic Stock | B6 | A similar alternative can be used |
| Calcium Chloride | Sigma | 21108 | An identical alternative can be used |
| Confocal laser-scanning microscope | Olympus | FV1000MPE | A similar alternative can be used |
| D-glucose | Sigma | G7528 | An identical alternative can be used |
| Disodium Phosphate | Sigma | 255793 | An identical alternative can be used |
| Electrode puller- Model P-97 | Sutter | P-97 | A similar alternative can be used |
| Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | An identical alternative can be used |
| Heparin sodium injection (1,000 USP per mL) | Sagent Pharmaceuticals | 400-10 | An identical alternative can be used |
| Imaris software (Version 7.6.5) | Bitplane Inc. | A similar alternative can be used | |
| Isofluorane | Henry Schein Animal Health | 29404 | An identical alternative can be used |
| Lidocaine Hydrochloride Injectable (2%) | Clipper | 1050035 | An identical alternative can be used |
| Lucifer Yellow CH dilithium salt | Sigma | L0259 | |
| Lucifer Yellow CH dipotassium salt | Sigma | L0144 | |
| Magnesium Chloride | Sigma | M8266 | An identical alternative can be used |
| Microscope Cover Glass | Thermo Scientific | 24X60-1 | An identical alternative can be used |
| Microscope Slides | Fisher | 12-544-2 | An identical alternative can be used |
| Normal Goat Serum | Vector Laboratories | S-1000 | An identical alternative can be used |
| Objective lens (40x) | Olympus | LUMPLFLN 40XW | A similar alternative can be used |
| Objective lens (60x) | Olympus | PlanAPO 60X | A similar alternative can be used |
| PBS tablets, 100 mL | VWR | VWRVE404 | An identical alternative can be used |
| Pipette micromanipulator- Model ROE-200 | Sutter | MP-285 / ROE-200 / MPC-200 | A similar alternative can be used |
| Potassium Chloride | Sigma | P3911 | An identical alternative can be used |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | An identical alternative can be used |
| Sodium Chloride | Sigma | S5886 | An identical alternative can be used |
| Stimulator- Model Omnical 2010 | World precision instruments | Omnical 2010 | A similar alternative can be used |
| Triton X 100 | Sigma | T8787 | An identical alternative can be used |
| Vibratome- Model #3000 | Pelco | 100-S | A similar alternative can be used |
References
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