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Neuroscience

खगोलकोशिका रूपविज्ञान का उपयोग करते हुए ल्यूसिफ़र पीला आयन्टोफोरोसिस का दृश्य

doi: 10.3791/60225 Published: September 14, 2019

Summary

खगोलविज्ञान रूप से जटिल कोशिकाओं, उनके कई प्रक्रियाओं और जंगली क्षेत्रों द्वारा उदाहरण हैं. उनके विस्तृत आकारिकी का विश्लेषण करने के लिए, हम हल्के निश्चित ऊतक में इंट्रासेल्यूलर लूसीफर पीले आयनोफोरोसिस करने के लिए एक विश्वसनीय प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं।

Abstract

एस्ट्रोसाइट्स तंत्रिका परिपथों के आवश्यक घटक हैं। वे पूरे केंद्रीय तंत्रिका तंत्र टाइल (सीएनएस) और कार्यों की एक किस्म में शामिल हैं, जो न्यूरोट्रांसमीटर निकासी, आयन विनियमन, synaptic मॉडुलन, न्यूरॉन्स के लिए चयापचय समर्थन, और रक्त प्रवाह विनियमन शामिल हैं. Astrocytes जटिल कोशिकाओं है कि एक सोमा है, कई प्रमुख शाखाओं, और कई ठीक प्रक्रियाओं है कि neuropil के भीतर विविध सेलुलर तत्वों से संपर्क कर रहे हैं. एस्ट्रोसाइट्स की आकृति विज्ञान का आकलन करने के लिए, उनकी संरचना की कल्पना करने के लिए एक विश्वसनीय और पुन: उत्पादन योग्य विधि होना आवश्यक है। हम वयस्क चूहों से हल्के निश्चित मस्तिष्क ऊतक में फ्लोरोसेंट Lucifer पीले (LY) डाई का उपयोग कर एस्ट्रोसाइट्स के intracellular iontophoresis प्रदर्शन करने के लिए एक विश्वसनीय प्रोटोकॉल की रिपोर्ट. इस विधि में कई विशेषताएं हैं जो एस्ट्रोसाइट आकारिकी की विशेषता के लिए उपयोगी हैं। यह व्यक्तिगत एस्ट्रोसाइट्स के तीन आयामी पुनर्निर्माण के लिए अनुमति देता है, जो उनकी संरचना के विभिन्न पहलुओं पर आकृतिक विश्लेषण करने के लिए उपयोगी है। एलवाई आयन्टोफोरोसिस के साथ इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री का उपयोग तंत्रिका तंत्र के विभिन्न घटकों के साथ एस्ट्रोसाइट्स की बातचीत को समझने और लेबल किए गए एस्ट्रोसाइट्स के भीतर प्रोटीन की अभिव्यक्ति का मूल्यांकन करने के लिए भी किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल सीएनएस विकारों के माउस मॉडल की एक किस्म में लागू किया जा सकता है कड़ाई से प्रकाश माइक्रोस्कोपी के साथ एस्ट्रोसाइट आकारिकी की जांच. लय आयनोफोरोसिस एस्ट्रोसाइट संरचना का मूल्यांकन करने के लिए एक प्रयोगात्मक दृष्टिकोण प्रदान करता है, विशेष रूप से चोट या बीमारी के संदर्भ में जहां इन कोशिकाओं को महत्वपूर्ण रूपात्मक परिवर्तन से गुजरना प्रस्तावित किया जाता है।

Introduction

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एस्ट्रोसाइट्स केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) में सबसे प्रचुर मात्रा में ग्लिल कोशिकाएं हैं। वे आयन homeostasis, रक्त प्रवाह विनियमन, synapse गठन के रूप में के रूप में अच्छी तरह से उन्मूलन में भूमिका निभाते हैं, और न्यूरोट्रांसमीटर तेज1. एस्ट्रोसाइट प्रकार्यों की विस्तृत श्रृंखला उनके जटिल रूपात्मक संरचना2,3में परिलक्षित होती है . एस्ट्रोसाइट्स में कई प्राथमिक और माध्यमिक शाखाएं होती हैं जो हजारों महीन शाखाओं और पत्रकों में विभाजित होती हैं जो सीधे synapses, dendrites, एक्सॉन, रक्त वाहिकाओं, और अन्य ग्लिल कोशिकाओं के साथ बातचीत करती हैं। एस्ट्रोसाइट आकारिकी विभिन्न मस्तिष्क क्षेत्रों में भिन्न होती है, जो न्यूरोनल सर्किट4में अपने कार्यों को करने की उनकी क्षमता का संकेत दे सकती है। इसके अलावा, एस्ट्रोसाइट्स विकास के दौरान, शारीरिक स्थितियों के दौरान और कई रोग राज्यों3,5,6में अपनी आकृति विज्ञान को बदलने के लिए जाने जाते हैं।

एस्ट्रोसाइट आकारिकी की जटिलता को सही ढंग से हल करने के लिए एक सुसंगत, पुन: उत्पादन योग्य विधि की आवश्यकता है। परंपरागत रूप से, इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री का उपयोग एस्ट्रोसाइट विशिष्ट या एस्ट्रोसाइट समृद्ध प्रोटीन मार्करों के उपयोग के साथ एस्ट्रोसाइट्स की कल्पना करने के लिए किया गया है। हालांकि, इन तरीकों एस्ट्रोसाइट की संरचना के बजाय प्रोटीन अभिव्यक्ति के पैटर्न से पता चलता है. आमतौर पर इस्तेमाल किया मार्करों, जैसे glial फाइब्रिलरी अम्लीय प्रोटीन (GFAP) और S100 कैल्शियम बाध्यकारी प्रोटीन - (S100 $), पूरे सेल मात्रा में व्यक्त नहीं करते हैं और इस तरह पूरी आकृति विज्ञान7हल नहीं है. आनुवंशिक दृष्टिकोण फ्लोरोसेंट प्रोटीन एस्ट्रोसाइट्स में सर्वव्यापी व्यक्त करने के लिए (वायरल इंजेक्शन या ट्रांसजेनिक माउस रिपोर्टर लाइनों) बेहतर शाखाओं और समग्र क्षेत्र की पहचान कर सकते हैं. हालांकि, यह व्यक्तिगत एस्ट्रोसाइट्स अंतर करने के लिए मुश्किल है, और विश्लेषण विशिष्ट प्रमोटर8द्वारा लक्षित एस्ट्रोसाइट आबादी द्वारा पक्षपाती हो सकता है। सीरियल सेक्शन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी synapses के साथ एस्ट्रोसाइट प्रक्रियाओं की बातचीत की एक विस्तृत तस्वीर प्रकट करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. synapses से संपर्क करने के खगोल साइट प्रक्रियाओं के हजारों के कारण, यह वर्तमान में इस तकनीक9के साथ एक पूरे सेल के पुनर्निर्माण के लिए संभव नहीं है, हालांकि यह डेटा विश्लेषण के लिए मशीन सीखने के दृष्टिकोण के उपयोग के साथ बदलने की उम्मीद है.

इस रिपोर्ट में, हम एक प्रक्रिया पर ध्यान केंद्रित करने के लिए एक उदाहरण के रूप में CA1 स्तर radiatum का उपयोग कर, Lucifer पीले (LY) डाई के साथ intracellular iontophoris का उपयोग कर माउस astrocytes की विशेषता है. विधि एरिक Bushong और मार्क एलिसमैन10,11द्वारा अग्रणी पिछले काम पर आधारित है . हल्के से तय मस्तिष्क स्लाइस से Astrocytes उनके विशिष्ट सोमा आकार से पहचाने जाते हैं और LY से भर रहे हैं. कोशिकाओं तो confocal माइक्रोस्कोपी के साथ छवि कर रहे हैं. हम प्रदर्शित करते हैं कि कैसे LY iontophoris व्यक्तिगत astrocytes के पुनर्निर्माण और उनकी प्रक्रियाओं और क्षेत्र के विस्तृत रूपात्मक विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इसके अलावा, इस विधि को इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री के साथ संयोजन के रूप में लागू किया जा सकता है स्थानिक संबंधों और एस्ट्रोसाइट्स और न्यूरॉन्स के बीच बातचीत की पहचान करने के लिए, अन्य ग्लिल कोशिकाओं, और मस्तिष्क vasculature. हम विभिन्न मस्तिष्क क्षेत्रों में आकृति विज्ञान और स्वस्थ या रोग की स्थिति7,12,13के माउस मॉडल का विश्लेषण करने के लिए एक बहुत ही उपयुक्त उपकरण के रूप में LY iontophoresis पर विचार करें .

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Protocol

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इस अध्ययन में पशु प्रयोगों की देखभाल और प्रयोगशाला पशुओं के उपयोग के लिए स्वास्थ्य गाइड के राष्ट्रीय संस्थान के अनुसार प्रदर्शन किया गया और कैलिफोर्निया, लॉस एंजिल्स विश्वविद्यालय में कुलपति पशु अनुसंधान समिति द्वारा अनुमोदित किया गया. मिश्रित लिंग के वयस्क चूहों (6 ]8 सप्ताह पुराने) सभी प्रयोगों में इस्तेमाल किया गया.

1. समाधान तैयारी

  1. कृत्रिम मस्तिष्कमेरु द्रव (ACSF) समाधान
    1. प्रत्येक प्रयोग से पहले ताजा एसीएसएफ घोल (135 एमएम नैक्ल, 5 एमएम केसीएल, 1 एमएम एमजीसीएल2,14.7 एमएम नाहको3,11 एमएम डी-ग्लूकोज, 1.25 एमएम नै2एचपीओ4और 2 एमएम केसीएल2) तैयार करें। अंतिम चरण में MgCl2 और CaCl2 जोड़ें। उच्च गुणवत्ता deionized पानी में घटकों को भंग.
    2. एक पानी के स्नान में 35 डिग्री सेल्सियस पर ACSF समाधान इनक्यूबेट और प्रयोग से पहले कम से कम 30 मिनट के लिए 95% O2/ 5% सीओ2 के साथ बुलबुला।
    3. ACSF में 0.02% की अंतिम एकाग्रता तक पहुंचने के लिए 2% लिडेकेन हाइड्रोक्लोराइड जोड़ें (100 एमएल में)।
  2. फिक्सेटिव समाधान
    1. 10% फॉर्मेलिन बफर फॉस्फेट का उपयोग करें।
  3. LY रंजक समाधान
    1. एलवाई सीएच डाइलिथियम नमक या एलवाई सीएच डाइपोटेशियम नमक को 5 एमएम केसीएल भंवर में अच्छी तरह से घोलकर 1.5% एलई डाई घोल तैयार करें। 1 एमएल का एक खंड कई प्रयोगों के लिए पर्याप्त है।
    2. 16,800 x ग्रामपर 10 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज | फिर, एक नई ट्यूब में एक 0.2 डिग्री सिरिंज फिल्टर के साथ supernatant फिल्टर. अलीकोट को 3 महीने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर रखा जा सकता है।
      नोट: यह अपकेंद्रित्र के लिए महत्वपूर्ण है और डाई कणों के एकत्रीकरण को रोकने के लिए डाई समाधान फिल्टर, जो इलेक्ट्रोड रोकना हो सकता है.

2. माउस ट्रांसकार्डियल भ्रम और मस्तिष्क विच्छेदन

  1. ट्रांसकार्डियल भ्रम के लिए उपकरण और माउस की तैयारी
    नोट:
    C57/BL6 या तो सेक्स के चूहों का इस्तेमाल किया जा सकता है. यह अनुभवजन्य रूप से देखा गया है कि विधि के लिए मज़बूती से काम करने के लिए, यह महत्वपूर्ण है कि चूहों से पुराने नहीं हैं 3 महीने (6 "8 सप्ताह पुराने आदर्श है). परफ्यूजन प्रोटोकॉल का वर्णन नीचे किया गया है। अधिक जानकारी के लिए एक अतिरिक्त संदर्भ प्रदान किया गया है14.
    1. लाइन में किसी भी हवा के बुलबुले को दूर करने के लिए ACSF समाधान के साथ साफ भ्रम टयूबिंग। उपयोग के क्रम में सर्जरी उपकरण स्थापित करें (ट्वीज़र्स, घुमावदार, कुंद कैंची, आईरिस कैंची)।
    2. कक्ष में आइसोलुरेन के 2"3 एमएल जोड़ने के बाद, इसे आइसोफ्लुरेन प्रेरण कक्ष में डाल कर माउस को गहराई से एनेस्थेटाइज करें। एनेस्थेटिक को प्रभावी होने के लिए 1 $2 मिनट की अनुमति दें। सुनिश्चित करें कि श्वास बंद नहीं होता है।
    3. टो प्रतिक प्रतिवर्त के लिए परीक्षण करें। आगे बढ़ें जब माउस दर्द उत्तेजना के लिए अप्रतिसादी है और पलटा अनुपस्थित है. ऑक्सीजन में 5% isoflurane की आपूर्ति के साथ श्वास शंकु में रखा सिर के साथ सुपाच्य स्थिति में जानवर को सुरक्षित और अंगों और पूंछ एक रासायनिक धूआं हुड के अंदर नीचे टेप.
  2. ट्रांसकार्डियल भ्रम
    1. छट्न का उपयोग करना, रिब पिंजरे के नीचे त्वचा उठा. पेट की गुहा को उजागर करने के लिए त्वचा के माध्यम से घुमावदार, कुंद कैंची के साथ 5 "6 सेमी चीरा बनाएं। पेट की दीवार के माध्यम से ऊपर की ओर कट जब तक जिगर और डायाफ्राम दिखाई दे रहे हैं.
    2. धीरे से जिगर आरेख से दूर ले जाएँ. आईरिस कैंची के साथ, डायाफ्राम में एक 3 "4 सेमी पार्श्व चीरा बनाते हैं।
    3. छाती गुहा का पर्दाफाश करने के लिए शरीर के दोनों पक्षों के साथ रिब पिंजरे के माध्यम से कट। दिल को नुकसान और फेफड़ों से बचने के लिए नहीं सावधान रहें। दिल को बेनकाब करने के लिए स्टर्नम को ऊपर उठाएं।
    4. एक बार जब दिल दिखाई देता है, एक anticoagulant के रूप में बाएं वेंट्रिकल में heparin सोडियम समाधान (1,000 यूएसपी प्रति एमएल) के 0.05 एमएल इंजेक्ट. फिर, बाएं वेंट्रिकल में ध्यान से भ्रम सुई डालें। सुनिश्चित करें कि सुई वेंट्रिकल में रहता है और अन्य हृदय कक्षों के माध्यम से छेद नहीं करता है। आईरिस कैंची के साथ सही atrium में एक छोटा सा चीरा बनाओ.
    5. लगभग 10 एमएल/मिनट की दर से ACSF समाधान के साथ उपयोग करें जब तक कि शरीर के मौजूदा तरल पदार्थ रक्त (1 डिग्री 2 मिनट) को मंजूरी दे दी है।
    6. किसी भी हवा बुलबुले शुरू करने के बिना fixative समाधान करने के लिए ACSF समाधान से स्विच करें। 10 मिनट के लिए स्थिर समाधान के साथ 10 डिग्री 20 एमएल/
      चेतावनी: ध्यान रखें कि कोई स्थिर समाधान नाक से draining है। यह इंगित करता है कि सुई सही वेंट्रिकल तक पहुँच गया और fixative के बजाय शरीर के आराम करने के लिए प्रणालीगत सर्किट के माध्यम से फेफड़ों के लिए यात्रा कर रहा है.
  3. मस्तिष्क का विच्छेदन
    1. कैंची से माउस के सिर को निकालें और ध्यान से खोपड़ी से माउस मस्तिष्क को अलग करें। एक छोटी पोस्ट-निर्धारण अवधि के लिए कमरे के तापमान पर 1.5 एच के लिए स्थिर समाधान में रखें।
      नोट: सफल LY आयन्टोफोरोसिस के लिए एक अच्छा भ्रम आवश्यक है। मस्तिष्क सफेद रंग का होना चाहिए और मस्तिष्क वाहिकाविन्यास में रक्त का अभाव होना चाहिए। शरीर और अंग कठोर दिखाई देना चाहिए।

3. स्लाइस तैयारी

  1. हिप्पोकैम्पस स्लाइस की तैयारी
    1. 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 0.1 एम फॉस्फेट बफर नमकीन (पीबीएस) के साथ मस्तिष्क धो लें। फिर, फिल्टर कागज के साथ मस्तिष्क से दूर सूखी और एक तेज उस्तरा ब्लेड के साथ घ्राण बल्ब और सेरिबैलम हटा दें।
    2. सियनोऐक्रिलेट गोंद का उपयोग करके वाइब्रामोम ट्रे पर मस्तिष्क को माउंट करें और कमरे के तापमान पर पीबीएस के साथ ट्रे भरें। 110 डिग्री मीटर मोटाई के हिप्पोकैम्पस कोरोनल खंडों को काटें।
      नोट: स्लाइस एक ही मोटाई और यहां तक कि सतह है कि यह सुनिश्चित करने के लिए vibratome की सेटिंग समायोजित करें। इस प्रयोग के लिए 4.5 की गति सेटिंग और 8 की आवृत्ति सेटिंग का उपयोग किया गया, जो यंत्र पर मनमाने ढंग से सेटिंग्स हैं (सामग्री की तालिका)। उपयोगकर्ताओं को अन्य डिवाइस पर सेटिंग के साथ प्रयोग करने की आवश्यकता हो सकती है.
    3. ट्रे से वर्गों लीजिए और बर्फ पर पीबीएस के एक पकवान में जगह है.

4. इलेक्ट्रोड तैयारी

  1. उचित प्रतिरोध के साथ एक तेज इलेक्ट्रोड तैयार करें।
    1. फिलामेंट (O.D. 1.0 मिमी, आईडी 0.58 मिमी) के साथ एक borosilicate ग्लास एकल बैरल इलेक्ट्रोड का प्रयोग करें। माइक्रोपिपेट खींचने वाले(सामग्री की सारणी)पर इलेक्ट्रोड खींचिए। 5 एमएम केसीएल में 1.5% एलई से भरे आदर्श इलेक्ट्रोड ों को पीबीएस के स्नान में रखे जाने पर 200 मप्र का प्रतिरोध करना चाहिए।
      नोट: पुलर सेटिंग उपकरण (मशीन के प्रकार का उपयोग किया और खींचने फिलामेंट) के आधार पर भिन्न होता है। एक उच्च गर्मी सेटिंग आमतौर पर अब और बेहतर सुझाव देता है. इस प्रयोग में इस्तेमाल micropipette खींचने के लिए, सेटिंग्स थे: गर्मी: 317, पुल: 90, वेग: 70, और देरी: 70. एक गर्त प्रकार फिलामेंट का उपयोग किया गया था।
    2. टिप में प्रवेश करने से धूल को रोकने के लिए एक बंद कंटेनर में इलेक्ट्रोड स्टोर. को तोड़ने से टिप को रोकने के लिए बॉक्स के नीचे से ऊंचा इलेक्ट्रोड रखें.
  2. इलेक्ट्रोड को LY डाई विलयन के साथ भरें।
    1. अनुलंब स्थिति में एक इलेक्ट्रोड रखें जिसकी नोक नीचे की ओर है। पिपेट 1 डिग्री 2 डिग्री एल इलेक्ट्रोड के पीछे में और केशिका क्रिया के माध्यम से टिप करने के लिए ले जाने के लिए समाधान के लिए 5 डिग्री 10 मिनट के लिए प्रतीक्षा करें।
    2. हेरफेर करने वाले से जुड़े इलेक्ट्रोड धारक में भरे हुए इलेक्ट्रोड को धीरे से सुरक्षित करें।
      नोट: इलेक्ट्रोड धारक के चांदी के तार इलेक्ट्रोड के अंदर LY के साथ संपर्क में होने की जरूरत है. यदि आवश्यक हो, तो तार की लंबाई के आधार पर LY समाधान की मात्रा समायोजित करें।

5. Iontophoris के साथ एस्ट्रोसाइट्स भरना

  1. इलेक्ट्रोड का परीक्षण करें।
    1. कमरे के तापमान पर 0.1 एम पीबीएस से भरा एक गिलास नीचे पकवान में धीरे से एक मस्तिष्क टुकड़ा रखें। नायलॉन तार के साथ एक प्लैटिनम वीणा के साथ जगह में टुकड़ा पकड़ो.
    2. सुनिश्चित करें कि इलेक्ट्रोड एक वोल्टेज स्रोत से जुड़ा हुआ है और मस्तिष्क टुकड़ा युक्त स्नान में जमीन इलेक्ट्रोड जगह है.
    3. ब्याज के मस्तिष्क क्षेत्र के लिए उद्देश्य ले जाएँ.
    4. समाधान में इलेक्ट्रोड कम. उज्ज्वल क्षेत्र के तहत, यह देखने के क्षेत्र के केंद्र में ले जाएँ और यह सुनिश्चित करने के लिए कि यह स्पष्ट और मलबे या बुलबुले के बिना प्रकट होता है 40x पानी विसर्जन लेंस के साथ ध्यान से जांच. यदि इलेक्ट्रोड टिप को बंद करने वाली कोई भी चीज़ है, तो इसे एक नए से बदलें।
      नोट: Clogging 200 एमजेड इलेक्ट्रोड के लिए एक चिंता का विषय है. प्रत्येक प्रयोग से पहले डाई समाधान के अपकेंद्रण और निस्पंदन के साथ, यह अक्सर समस्या नहीं होनी चाहिए। हालांकि, क्योंकि इलेक्ट्रोड की नोक छोटी है, ऊतक कभी कभी खोलने में फंस सकता है. लेखकों को इस को रोकने के लिए एक रास्ता नहीं मिला है, लेकिन यह आसानी से बस एक नया इलेक्ट्रोड का उपयोग करके के साथ निपटा जा सकता है.
    5. 488 एनएम लेजर के साथ confocal लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप के तहत इलेक्ट्रोड की नोक का निरीक्षण करें। फिर, 12 वी पर stimulator पर मोड़ द्वारा परीक्षण डाई निष्कासन इलेक्ट्रोड की नोक के आसपास एक बड़े फ्लोरोसेंट डाई बादल ध्यान दें, जबकि stimulator पर है. यदि वोल्टेज उत्तेजना पर कोई या कम डाई निकाला जाता है, इलेक्ट्रोड की जगह.
    6. उज्ज्वल क्षेत्र के तहत, धीरे धीरे सतह के ऊपर रोक टुकड़ा की ओर इलेक्ट्रोड कम.
  2. आयन्टोफोरोसिस के साथ एस्ट्रोसाइट भरें।
    1. बुनियादी लाल अंतर हस्तक्षेप विपरीत (आईआर-डीआईसी) के साथ टुकड़ा सतह के नीचे astrocytes 40 डिग्री 50 डिग्री मीटर की पहचान करें। व्यास में 10 डिग्री मीटर के बारे में लम्बी, अंडाकार के आकार का somata के साथ कोशिकाओं के लिए देखो। एक बार एक astrocyte चुना जाता है, यह देखने के क्षेत्र के केंद्र में ले जाएँ.
      नोट: आयन्टोफोरोसिस के लिए एक अच्छी कोशिका के चारों ओर स्पष्ट, परिभाषित सीमाएं हैं। स्लाइस की सतह के बहुत करीब कक्षों को न चुनें क्योंकि वे पूरी तरह से भरे नहीं जा सकते. यह नियमित रूप से डाई भरने के लिए astrocytes की पहचान करने में सक्षम होने के लिए कुछ दिनों में कुछ अभ्यास लेता है. प्रयोग के लिए उपयोग किए जाने वाले मस्तिष्क क्षेत्र के आधार पर एस्ट्रोसाइट्स की संख्या भिन्न हो सकती है। यह भरने से पहले एक एस्ट्रोसाइट की पहचान करने के लिए आवश्यक समय को प्रभावित कर सकता है।
    2. धीरे धीरे टुकड़ा में इलेक्ट्रोड टिप कम, ऊतक के माध्यम से नेविगेट, जब तक यह सेल शरीर के रूप में एक ही विमान पर है.
      नोट: ऊतक को नुकसान पहुंचाने से बचने के लिए धीरे-धीरे इलेक्ट्रोड ले जाएं।
    3. एक बार एस्ट्रोसाइट के कोशिका शरीर स्पष्ट रूप से दिखाई दे रहा है और रेखांकित, धीरे धीरे और धीरे इलेक्ट्रोड आगे अग्रिम. इलेक्ट्रोड ले जाएँ जब तक टिप सेल के सोमा impales. उद्देश्य का ध्यान धीरे-धीरे ऊपर और नीचे ले जाएँ नोट करने के लिए यदि इलेक्ट्रोड सोमा के अंदर है.
      नोट: इलेक्ट्रोड टिप सेल शरीर के अंदर होना चाहिए, और सोमा पर एक छोटा सा इंडेंटेशन देखा जाना चाहिए। कोशिका के माध्यम से जाने वाले सिरे से बचने के लिए इलेक्ट्रोड को आगे न ले जाएं।
    4. एक बार इलेक्ट्रोड टिप कोशिका के अंदर है, पर stimulator चालू $0.5 $1 ट और लगातार सेल में वर्तमान बाहर निकालना. confocal माइक्रोस्कोप का उपयोग करना, सेल भरने देखो. सेल का विवरण देखने के लिए डिजिटल ज़ूम बढ़ाएँ और यह सुनिश्चित करें कि विद्युत मंडल की नोक सेल के अंदर दिखाई दे रही है।
      नोट: वोल्टेज कम अगर ऐसा लगता है कि डाई सेल से बाहर लीक कर रहा है या आसपास के क्षेत्र में अन्य कोशिकाओं को भरने. यदि ऐसा लगता है कि डाई अभी भी सेल से बाहर लीक कर रहा है, धीरे धीरे इलेक्ट्रोड बाहर खींच और एक और सेल लगता है. यह महत्वपूर्ण है कि डाई अंतिम छवि में एक उच्च संकेत / पृष्ठभूमि अनुपात के लिए रिसाव नहीं करता है.
    5. के बारे में 15 मिनट के लिए प्रतीक्षा करें जब तक बेहतर शाखाओं और प्रक्रियाओं को परिभाषित दिखाई देते हैं, वोल्टेज बंद कर देते हैं और धीरे सेल से इलेक्ट्रोड टिप वापस ले लो.
  3. भरे हुए सेल को छवि करें.
    नोट:
    इमेजिंग भरने या इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री के साथ धुंधला करने के तुरंत बाद किया जा सकता है। एक उच्च संख्यात्मक एपर्चर (NA) के साथ एक उद्देश्य बेहतर संकल्प में परिणाम.
    1. 40x उद्देश्य के साथ इमेजिंग (15 डिग्री 20 मिनट) से पहले कक्ष मूल रूप में वापस आने तक प्रतीक्षा करें। कक्ष को छवि बनाने के लिए, यह सुनिश्चित करने के लिए confocal पर सेटिंग समायोजित करें कि बेहतर शाखाएँ और प्रक्रियाएँ निर्धारित दिखाई दें.
    2. 0.3 डिग्री के चरण आकार के साथ एक z-स्टैक सेट करें. जबकि इमेजिंग, उद्देश्य ले जाएँ जब तक वहाँ सेल से कोई संकेत नहीं है और सेट है कि शीर्ष के रूप में. फिर, उद्देश्य नीचे ले जाएँ (सेल के माध्यम से ध्यान केंद्रित) जब तक वहाँ कोई संकेत नहीं है, सेट है कि नीचे के रूप में.
    3. इमेजिंग के पूरा होने के बाद, डाई निष्कासन के लिए इलेक्ट्रोड की जांच करें। एक बड़े डाई बादल प्रकट होता है, यह अगले टुकड़ा के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. अन्यथा, यह एक नया इलेक्ट्रोड के साथ बदलें.
      नोट: एक एकल एस्ट्रोसाइट और इमेजिंग का डाई भरने में लगभग 45 मिनट से 1 एच तक का समय लगता है। इस विशिष्ट प्रयोग के लिए, यह माउस प्रति के बारे में 3 डिग्री 6 कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए संभव था. यदि आवश्यक हो, तो एक ही स्लाइस पर एकाधिक कक्षों को लेबल किया जा सकता है. हालांकि, अलग-अलग एस्ट्रोसाइट्स को अलग करने के लिए, कोशिकाओं के बीच लगभग 200 डिग्री मीटर की दूरी रखना सुनिश्चित करें।

6. इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री के साथ दाग (वैकल्पिक)

  1. एक बार इमेजिंग किया जाता है, तुरंत बर्फ पर 10% formalin में टुकड़ा जगह इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री के लिए संरक्षित करने के लिए. अंधेरे में मस्तिष्क स्लाइस रखें और रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  2. वॉश मस्तिष्क वर्गों 3x में 0.1 M PBS के साथ 0.5% nonionic surfactant (यानी, Triton X 100) के लिए 5 मिनट प्रत्येक. फिर 0.5% nonionic सर्फेक्टेंट और 10% सामान्य बकरी सीरम (NGS) के साथ एक अवरुद्ध समाधान में incubate कोमल आंदोलन के साथ कमरे के तापमान पर 1 एच के लिए.
  3. प्राथमिक एंटीबॉडी में आंदोलन के साथ वर्गों को इनक्यूबेट करें 0.1 एम पीबीएस में पतला 0.5% nonionic सर्फैक्टेंट और 5% एनजीएस के साथ 2 दिनों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर।
    नोट: मस्तिष्क स्लाइस की मोटाई के कारण, प्राथमिक एंटीबॉडी की ऊष्मायन अवधि को बेहतर प्रवेश के लिए बढ़ाया जाना चाहिए और एंटीबॉडी एकाग्रता में वृद्धि की जा सकती है। इस प्रयोग में, एक 1:500 कमजोर पड़ने विरोधी GFAP एंटीबॉडी के लिए इस्तेमाल किया गया था और एक 1:500 कमजोर पड़ने विरोधी एक्वापोरिन-4 एंटीबॉडी के लिए इस्तेमाल किया गया था.
  4. 0.1 एम पीबीएस में वर्गों 3x को 10 मिनट प्रत्येक के लिए 0.5% nonionic सर्फेक्टेंट के साथ धोएं और फिर 0.1 एम पीबीएस में पतला माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेट करें 0.5% nonionic सर्फैक्टेंट और कमरे के तापमान पर 6 एच के लिए 10% एनजीएस के साथ।
    नोट: एक माध्यमिक एंटीबॉडी 488 एनएम द्वारा उत्साहित का चयन न करें, जो तरंगदैर्ध्य LY डाई कल्पना करने के लिए प्रयोग किया जाता है. इस प्रयोग में, एक 1:1,000 कमजोर पड़ने Alexa Fluor 546 बकरी विरोधी चिकन IgG (एच + एल) और एलेक्सा फ्लोर 647 बकरी विरोधी rabbit IgG (एच + एल) के लिए इस्तेमाल किया गया था.
  5. 10 मिनट प्रत्येक के लिए 0.1 एम पीबीएस में वर्गों 3x कुल्ला. फिर फ्लोरोसेंट के लिए उपयुक्त बढ़ते मीडिया में कांच माइक्रोस्कोप स्लाइड पर वर्गों माउंट. स्लाइड सील करें. 0.3 डिग्री उ के चरण आकार में छवि कक्ष.

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Representative Results

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इस अध्ययन में रिपोर्ट किए गए आंकड़े प्रत्येक प्रयोग में 4 चूहों से 7 डिग्री 12 कोशिकाओं से हैं। औसत डेटा आंकड़ा पैनल में रिपोर्ट कर रहे हैं जहां उपयुक्त.

एस्ट्रोसाइट आकारिकी का आकलन करने के लिए, हमने सीए 1 स्तर रेडिएटम में एस्ट्रोसाइट्स को भरने के लिए एलवाई डाई का उपयोग करके इंट्रासेल्यूलर आयन्टोफोरोसिस का प्रदर्शन किया, जिसे चित्र 1में संक्षेप किया गया है। चित्र 2 में एक प्रतिनिधि एस्ट्रोसाइट और इसकी विस्तृत आकृतिक संरचना को दर्शाया गया है। सेल एक confocal लेजर-स्कैनिंग माइक्रोस्कोप पर 60x तेल विसर्जन लेंस के साथ पोस्ट-निर्धारण 488 एनएम लेजर लाइन का उपयोग कर छवि थी (0.3 डिग्री और 3.0 डिग्री 3.5x डिजिटल ज़ूम के कदम आकार). अंतिम छवि में एक उच्च संकेत / पृष्ठभूमि अनुपात बनाने के लिए confocal माइक्रोस्कोप के photoबहुपीय ट्यूब (पीएमटी), ऑफसेट, और लाभ कार्यों को समायोजित किया गया। चित्र 2 में,विभिन्न z-चरणोंसे एकल ऑप्टिकल समतल चित्र (प्रत्येक 10 डिग्री उ, जिसे 1$6) से क्रम में लेबल किया गया है, केंद्रीय सोमा और कई प्रमुख शाखाओं को प्रकट करता है जो प्रक्रियाओं के सघन नेटवर्क में विभाजित होती हैं। अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण (85 डिग्री उ का स्टैक आकार) उत्पन्न करके हमने एस्ट्रोसाइट की संरचना और इसके डोमेन (चित्र 2) का विस्तृत दृश्य देखा। एस्ट्रोसाइट की संरचना के मुख्य घटकों को भी नोट किया गया है। चित्र 2 सी में एक ज़ूम से पता चलता है (x4) एक प्रमुख शाखा की अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण, कई माध्यमिक शाखाओं, और आसपास के branchlets और पत्रक के वितरण.

Morphological विश्लेषण और astrocytes के पुनर्निर्माण Imaris विश्लेषण सॉफ्टवेयर के साथ प्रदर्शन किया गया (सामग्री की तालिका) LY से भरे एस्ट्रोसाइट्स के बाद निर्धारण छवियों का उपयोग (इस तरह के ImageJ के रूप में अन्य सॉफ्टवेयर भी इस्तेमाल किया जा सकता है). प्रत्येक एस्ट्रोसाइट के पुनर्निर्माण के बाद पूरा हो गया था, सोमा, प्रमुख शाखाओं, प्रक्रियाओं, और क्षेत्र की मात्रा निर्धारित किया गया. सोमा पहले एक सतह smoothing x-y विमान संकल्प सीमा (0.25 डिग्री मी) के लिए सेट के साथ बनाया गया था। कक्ष निकाय से संबद्ध नहीं अन्य ऑब्जेक्ट्स को निकालने के लिए न्यूनतम ऑब्जेक्ट व्यास 3.0 m पर सेट किया गया था. प्रमुख शाखाओं को बनाने के लिए, सोमा की तीव्रता को सेल के बाकी हिस्सों के सापेक्ष इसकी चमक के कारण नकाबपोश किया गया था। प्रमुख शाखाओं की सतह मसृणालता और न्यूनतम वस्तु व्यास 0ण्3 उ (ज तल चरण आकार) पर सेट किया गया था। प्रक्रियाओं को बनाने के लिए, प्रमुख शाखाओं की तीव्रता भी नकाबपोश थी। सतह मसृणीकरण 0ण्18 उ पर सेट किया गया था तथा न्यूनतम वस्तु व्यास 0ण्3 उ पर सेट किया गया था। एस्ट्रोसाइट का क्षेत्र एक कम तीव्रता सीमा और सतह चिकनी का उपयोग करके बनाया गया था जो 0ण्75 उ. चित्र 3 एक CA1 एस्ट्रोसाइट की मूल छवि को दर्शाता है। कोशिका निकाय, प्रमुख शाखाओं, प्रक्रियाओं, और एस्ट्रोसाइट द्वारा संलग्न क्षेत्र खंड का निर्माण चित्र 3इ- में किया गयाहै। कोशिकाओं के पुनर्निर्माण के बाद, सोमा, पूरे सेल और क्षेत्र की मात्रा का परिमाण निर्धारित किया गया था और प्रमुख शाखाओं की संख्या(तालिका 1)की गणना की गई थी। स्तर रेडिम से सीए 1 एस्ट्रोसाइट्स की औसत सोमा मात्रा 488.91 डिग्री मी3थी , औसत $7 प्राथमिक शाखाओं का औसत , 5.58 x 103 $m3की औसत कोशिका मात्रा , और 2.94 x 104 $m3की औसत क्षेत्र आयतन थी .

अच्छी तरह से विशेषता एस्ट्रोसाइट मार्कर, GFAP, एक साइटोस्केलेटल प्रोटीन है कि एक एस्ट्रोसाइट8के मध्यवर्ती फिलामेंट लेबल है। के बाद astrocytes डाई भर रहे थे, हम GFAP के लिए इम्यूनोस्टेनिंग प्रदर्शन करने के लिए व्यक्तिगत एस्ट्रोसाइट्स में अभिव्यक्ति कल्पना (चित्र 4) . हमने पाया कि जीएफएपी को सेल सोमा, प्रमुख शाखाओं, और एस्ट्रोसाइट्स की कुछ द्वितीयक शाखाओं में व्यक्त किया गया था, लेकिन महीन शाखाओं और प्रक्रियाओं में नहीं (चित्र 4)। GFAP द्वारा लेबल प्राथमिक शाखाओं की संख्या में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं पाया गया और उन LY द्वारा कल्पना की गई (च ] 0.1573; चित्र 4 बी) कक्ष क्षेत्र और GFAP द्वारा लेबल एस्ट्रोसाइट की मात्रा काफी क्षेत्र और मात्रा LY के साथ कल्पना की तुलना में काफी छोटे थे (पी और lt; 0.0001; चित्र 4 सी, डी). यह दर्शाता है कि GFAP प्रमुख शाखाओं लेबलिंग के लिए एक विश्वसनीय मार्कर है, लेकिन समग्र क्षेत्र या सेल की मात्रा का निर्धारण करने के लिए उपयोगी नहीं है.

एस्ट्रोसाइट्स की एक महत्वपूर्ण विशेषता उनके एंडफीट है, जो रक्त वाहिकाओं से संपर्क करते हैं और सीएनएस में रक्त प्रवाह को विनियमित करने में मदद करने के लिए प्रस्तावित हैं। एस्ट्रोसाइट्स और मस्तिष्क वाहिकाविन्यास के बीच स्थानिक संबंधों को और अधिक समझने के लिए, हम डाई भरने के बाद एक्वापोरिन-4 के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ दाग। एक्वापोरिन-4 एस्ट्रोसाइट्स और एपेन्डीमल कोशिकाओं पर पाया जाने वाला एक जल चैनल प्रोटीन है, और इसे निलय और रक्त वाहिकाओं15के पास के क्षेत्रों में अत्यधिक व्यक्त किया जाता है। हमने पाया कि एक्वापोरिन-4 मस्तिष्क वाहिकाविन्यास के निकट एस्ट्रोसाइट एंडफीट पर व्यक्त किया जाता है (चित्र 5) । छवि तीन एस्ट्रोसाइट endfeet विभिन्न स्थानों पर एक रक्त वाहिका से संपर्क (सफेद तीर द्वारा संकेत) को दर्शाया गया है. सीए 1 स्तर विकिरणमेंत में प्रति एस्ट्रोसाइट एंडफीट की औसत संख्या थी(चित्र 5ठ)। दिलचस्प बात यह है कि प्रमुख शाखा पुनर्निर्माणों का उपयोग करते हुए, एंडफीट वाली शाखाएं एस्ट्रोसाइट की अन्य प्राथमिक शाखाओं की तुलना में काफी अधिक मोटी थीं( च 0.0038; चित्र 5 सी. हमने सोमा के केंद्र से रक्त वाहिका तक एंडफीट वाली शाखाओं की लंबाई को भी मापा और इसकी तुलना रक्त वाहिका के लिए सबसे कम, प्रत्यक्ष पथ से की। रक्त वाहिका के लिए शाखाओं की वास्तविक लंबाई काफी कम से कम पथ से अधिक था (च ] 0.0333; चित्र 5 डी), जो पता चलता है कि इन शाखाओं रक्त वाहिका के लिए एक लंबा, घुमावदार मार्ग ले जाते हैं. मूवी 1 एक LY से भरे एस्ट्रोसाइट और एक्वापोरिन-4 धुंधला के पुनर्निर्माण की एक फिल्म को दर्शाया गया है. एस्ट्रोसाइट (सोमा, प्रमुख शाखाओं, प्रक्रियाओं, और क्षेत्र) के विभिन्न संरचनात्मक घटकों को तीन आयामों में प्रतिनिधित्व किया जाता है। एक्वापोरिन-4 धुंधला के साथ LY से भरे एस्ट्रोसाइट में रक्त वाहिका के चारों ओर एस्ट्रोसाइट एंडफीट को दर्शाया गया है। प्रमुख शाखाओं और रक्त वाहिका के पुनर्निर्माण से, शाखाओं कि endfeet होते हैं सोमा से पोत को विस्तार कल्पना की जा सकती है.

पिछले अनुभागों में, जहाँ p मान रिपोर्ट किए जाते हैं, हमने एक अयुग्मित छात्र की t परीक्षा का उपयोग किया, जिसका महत्व p.lt; 0.05 पर होता है.

Figure 1
चित्र 1: LY आयनोफोरोसिस में कार्यप्रवाह का आरेख| महत्वपूर्ण चरणों को हाइलाइट करने वाले प्रोटोकॉल का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व. माउस के बाद fixative के साथ perfused किया गया था, मस्तिष्क विच्छेदन किया गया था. एक छोटी पोस्ट-निर्धारण अवधि के बाद, कोरोनल वर्गों एक vibratome के साथ काट रहे थे. इलेक्ट्रोड 1.5% LY डाई के साथ backfilled था. एस्ट्रोसाइट्स की पहचान सीए 1 स्तर रेडिएटम रेडिएटम में एक प्रकाश माइक्रोस्कोप पर आईआर-डीआईसी का उपयोग करके की गई थी। सेल का कायमा इलेक्ट्रोड द्वारा impaled था, और डाई सेल में लागू करने के द्वारा इंजेक्शन किया गया था 0.5 डिग्री 1 V जब तक बेहतर प्रक्रियाओं पूरी तरह से भर रहे थे. टुकड़ा एक 40x पानी विसर्जन लेंस का उपयोग confocal माइक्रोस्कोपी के साथ छवि बनाई गई थी और फिर इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री के लिए संसाधित. इसके अलावा इमेजिंग सेल पुनर्निर्माण और आकृतिक विश्लेषण करने के लिए एक 60x तेल विसर्जन लेंस के साथ पूरा किया गया था. दिखाया प्रक्रियाओं का एक उदाहरण पुनर्निर्माण है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: सीए 1 स्तर radiatum के LY से भरे एस्ट्रोसाइट. (ए) एक एस्ट्रोसाइट से एकल ऑप्टिकल विमान छवियों को हर 10 डिग्री उ दिखाया गया है (लेबल 1 $6)। (ख)एस्ट्रोसाइट का अधिकतम प्रक्षेपण, जिसमें कोशिका सोमा, कई प्रमुख शाखाओं और अनेक प्रक्रियाओं का चित्रण किया गया है जो इसकी झाड़ीदार क्षेत्र बनाती हैं। (ग) एक प्रमुख शाखा का अधिकतम प्रक्षेपण (ज़ूम x4) (पीले भाग में उल्लिखित अनुभाग से), दो द्वितीयक शाखाएं, कई शाखाएं, और आस-पास की प्रक्रियाओं का संगठन। स्केल बार ] 10 डिग्री मी. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: एक LY से भरे एस्ट्रोसाइट और उसके घटकों का पुनर्निर्माण। (ए) सीए 1 एस्ट्रोसाइट LY से भरा हुआ है। (बी-ई) सोमा (बी), सोमा और प्रमुख शाखाओं (सी), प्रक्रियाओं (डी) और क्षेत्र () के तीन आयामी पुनर्निर्माण 0 डिग्री और 45 डिग्री अभिविन्यास पर। स्केल बार ] 10 डिग्री मी. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: जीएफएपी इम्युनोस्टेनिंग एलवाई-फिल्ड एस्ट्रोसाइट्स में। (ए) प्रतिनिधि z-ल (हरा) और GFAP (magenta) धुंधला का अनुमान. GFAP एस्ट्रोसाइट के प्राथमिक और कुछ माध्यमिक शाखाओं में मुख्य रूप से व्यक्त किया जाता है, लेकिन पूरे एस्ट्रोसाइट क्षेत्र के भीतर नहीं मिला था। स्केल बार - 10 डिग्री उ. () प्राथमिक शाखाओं की संख्या का ग्राफ, जिस्हें LY और GFAP द्वारा लेबल किया गया है। () सेल क्षेत्र का उल्लेख ली और जीएफएपी अभिरंजन द्वारा किया जाता है। (घ)सेल आयतन को लया और जीएफएपी अभिरंजन द्वारा निरूपित किया गया है। ओपन सर्कल कच्चे डेटा होते हैं, जिनमें बंद वर्गों का अर्थ होता है- SEM. डेटा 4 चूहों से 12 कोशिकाओं से एकत्र किया गया था. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: एक्वापोरिन-4 एलवाई से भरे एस्ट्रोसाइट्स में इम्यूनोस्टेनिंग। (ए) लि (हरी) और एक्वापोरिन-4 धुंधला (मैजेंटा) का प्रतिनिधि z-प्रक्षेप। एक्वापोरिन-4 मुख्य रूप से एस्ट्रोसाइट के एंडफीट में व्यक्त किया जाता है। सफेद तीर तीन एंडफीट को दर्शाते हैं क्योंकि वे पास के रक्त वाहिका से संपर्क करते हैं। स्केल बार - 10 डिग्री मी. (बी) एस्ट्रोसाइट प्रति एंडफीट वाली शाखाओं की संख्या। (सी)एस्ट्रोसाइट्स की अन्य प्राथमिक शाखाओं की तुलना में एंडफीट वाली शाखाओं की मोटाई। (घ)रक्त वाहिका के लिए सबसे कम पथ की तुलना में एंडफीट वाली शाखाओं की लंबाई। ओपन सर्कल कच्चे डेटा होते हैं, जिनमें बंद वर्गों का अर्थ होता है- SEM. डेटा 4 चूहों से 7 कोशिकाओं से एकत्र किया गया था। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Movie 1
मूवी 1: एक LY से भरे एस्ट्रोसाइट और एक्वापोरिन-4 धुंधला का पुनर्निर्माण। एक रक्त वाहिका के निकटता में एक CA1 एस्ट्रोसाइट के प्रतिनिधि फिल्म. सेल की आकृति विज्ञान का विश्लेषण करने के लिए कायमा, प्रमुख शाखाओं, प्रक्रियाओं और क्षेत्र का पुनर्निर्माण किया गया। एक्वापोरिन-4 के साथ प्रमुख शाखाओं के पुनर्निर्माण में दो एस्ट्रोसाइट एंडफीट को सीधे रक्त वाहिका से संपर्क करने को दर्शाया गया है। कृपया यहाँ क्लिक करें इस वीडियो को देखने के लिए. (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें.)

Morphological विशेषताओं मतलब ] SEM
सोमा मात्रा ($m3) 489 ] 30
प्राथमिक शाखाओं की संख्या 7.0 $ 0.5
कोशिका मात्रा ($m3) 5580 ] 425
क्षेत्र मात्रा ($m3) 29391 ] 8150
कक्षों की संख्या 14

तालिका 1: एस्ट्रोसाइट संरचना का रूपात्मक विश्लेषण। एस्ट्रोसाइट सोमा वॉल्यूम, एस्ट्रोसाइट प्रति प्राथमिक शाखाओं की संख्या, एस्ट्रोसाइट सेल वॉल्यूम, और एस्ट्रोसाइट क्षेत्र से संलग्न मात्रा दिखाई जाती है। डेटा 7 चूहों से 14 कोशिकाओं से एकत्र किया गया था.

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Discussion

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इस पत्र में उल्लिखित विधि हल्के निश्चित मस्तिष्क स्लाइस में LY डाई के इंट्रासेल्यूलर आयन्टोफोरोसिस का उपयोग करके एस्ट्रोसाइट आकारिकी कल्पना करने के लिए एक तरीका का वर्णन करता है। इस प्रोटोकॉल में कई महत्वपूर्ण कारक हाइलाइट किए गए हैं जो कोशिकाओं के सफल LY आयन्टोफोरिस और आकृतिक पुनर्निर्माण में योगदान देते हैं। एक कारक है गुणवत्ता और छवियों की reproducibility, जो काफी हद तक माउस की उम्र और भ्रम के परिणाम से निर्धारित किया जाता है. इस अध्ययन में, हम C57/BL6N चूहों 6 "8 सप्ताह पुराने इस्तेमाल किया. एक सफल भ्रम (उच्च perfusing सुई की उचित नियुक्ति पर निर्भर है और एक सफेद रंग का मस्तिष्क और मस्तिष्क vasculature में रक्त की अनुपस्थिति द्वारा नोट) सबसे विस्तृत और स्पष्ट रूप से भरा कोशिकाओं के लिए आवश्यक है. एक इलेक्ट्रोड द्वारा impalement के बाद, कोशिका झिल्ली इलेक्ट्रोड की नोक के आसपास एक तंग सील बनाए रखने और बाहर लीक से डाई को रोकने चाहिए. सबसे अच्छा प्रयासके बावजूद, कभी कभी सेल के बाहर अन्य संरचनाओं के रूप में pippette मस्तिष्क के ऊतकों के माध्यम से उन्नत है भर जाएगा: हम विश्लेषण से इन कोशिकाओं को बाहर रखा. इलेक्ट्रोड के प्रतिरोध एक अतिरिक्त महत्वपूर्ण कारक है. उच्च प्रतिरोध केवल वोल्टेज उत्तेजना पर इलेक्ट्रोड टिप से डाई की एक स्थिर निष्कासन की अनुमति देता है. अधिक तकनीकी रूप से, यह कोमल बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है, धीमी गति से आंदोलनों जब इलेक्ट्रोड के साथ सेल की सोमा impaling. कोशिका के माध्यम से इलेक्ट्रोड प्रवेश सोमा से रिसाव डाई करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. वोल्टेज आवेदन के बाद एक सफल impalement सेल शरीर और प्रक्रियाओं के लगभग तत्काल डाई भरने में परिणाम चाहिए (यानी, कुछ सेकंड के भीतर). पूरी तरह से एक एस्ट्रोसाइट को भरने के लिए आवश्यक समय यह शामिल क्षेत्र से संबंधित है; हालांकि, बेहतर प्रक्रियाओं को पूरी तरह से भर रहे हैं सुनिश्चित करने के लिए प्रतीक्षा करें (कम से कम 15 मिनट).

हम इस प्रोटोकॉल को विस्तार से एस्ट्रोसाइट आकृति विज्ञान का अध्ययन करने के लिए एक सबसे वफादार तरीका हो पाया, फिर भी, विधि अपनी सीमाएं हैं. एक सेल की पहचान समय लेने वाली और त्रुटि प्रवण हो सकता है. IR-DIC के अंतर्गत, किसी विशिष्ट सुविधाओं की पहचान करनी चाहिए जो विशिष्ट कक्ष प्रकार (सोमा आकृति और आकार) को चिह्नित करती हैं. वैकल्पिक रूप से, वायरल इंजेक्शन या एक ट्रांसजेनिक माउस रिपोर्टर लाइन द्वारा एस्ट्रोसाइट्स में विशेष रूप से लाल फ्लोरोसेंट पत्रकारों की अभिव्यक्ति, भरने से पहले इन कोशिकाओं की आसान पहचान के लिए अनुमति देताहै। इसके अलावा, LY एक साइटोसोलिक डाई के रूप में सीमित है क्योंकि इसका उपयोग एस्ट्रोसाइट झिल्ली को लेबल करने के लिए नहीं किया जा सकता है, एक झिल्ली-टेदर ्ड GFP के साथ लेबलिंग की तुलना में, जैसे Lck-GFP16। Lck-GFP पूरे क्षेत्र के क्षेत्र का एक अधिक सटीक प्रतिनिधित्व देना होगा, के रूप में LY iontophoris एक astrocyte की आंतरिक मात्रा का पता चलता है. हालांकि, प्रयोगात्मक डिजाइन के आधार पर, एलवाई आयन्टोफोरोसिस पूरे एस्ट्रोसाइट आंतरिक मात्रा को हल करने, तीन पुनर्निर्माण आयामी विकसित करने, और शारीरिक घटकों को परिमाणित करने के लिए बेहतर है जो एस्ट्रोसाइट की संरचना 6 बनाते हैं . अंत में, के रूप में confocal माइक्रोस्कोपी के सभी रूपों के साथ, स्थानिक संकल्प विवर्तन द्वारा सीमित है, माइक्रोस्कोप प्रकाशिकी के बिंदु प्रसार समारोह के रूप में उल्लेख किया17. इमेजिंग प्रणाली के घटकों को बदलने, इस तरह के कम pinhole व्यास के रूप में, छवियों को बेहतर बनाने में मदद मिलेगी, लेकिन सही संकल्प प्रकाश की तरंगदैर्ध्य और उद्देश्य लेंस के संख्यात्मक एपर्चर द्वारा निर्धारित किया जाता है. हमारे मामले में, हम सबसे अच्छा संभव संकल्प का अनुमान शायद लगभग 300 एनएम है, जो z-अक्ष में बदतर होने की संभावना है.

एलवाई आयन्टोफोरोसिस एस्ट्रोसाइट्स को लेबल करने के लिए अन्य सामान्य रूप से इस्तेमाल किए जाने वाले तरीकों पर कई फायदे प्रदान करता है। प्रोटोकॉल किसी भी स्थापित माउस मॉडल, सेल आबादी, या मस्तिष्क क्षेत्र18,19,20 में लागू किया जा सकता है के रूप में यह एक astrocyte विशिष्ट प्रमोटर या एक transgenic माउस लाइन द्वारा सीमित नहीं है. वायरल इंजेक्शन या ट्रांसजेनिक माउस रिपोर्टर लाइनों (यानी, टीडी-टमाटर) द्वारा एस्ट्रोसाइट्स में सर्वव्यापक रूप से फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त करने के लिए आनुवंशिक दृष्टिकोण एक एस्ट्रोसाइट प्रमोटर के उपयोग की आवश्यकता होती है, जो, कुछ क्षेत्रों में, अन्य सेल प्रकारों में व्यक्त किया जा सकता है या नहीं सभी astrocytes21शामिल हैं. एलई आयन्टोफोरोसिस भी समय कुशल है, फ्लोरोसेंट प्रोटीन के वायरल इंजेक्शन के रूप में विशिष्ट वायरस व्यक्त करने के लिए सर्जरी और समय की आवश्यकता होती है, और ट्रांसजेनिक माउस लाइनों प्रजनन की आवश्यकता होती है। अंत में, LY आयन्टोफोरोसिस अलग-अलग कोशिकाओं को अलग करने के लिए एक उपयोगी तरीका है, जबकि अन्य रणनीतियों को भी विरल लेबलिंग के लिए एक विधि के साथ जोड़ा जाना चाहिए ताकि अलग-अलग एस्ट्रोसाइट्स22,23के क्षेत्रों की कल्पना की जा सके, 24. हालांकि, कोई भी तरीका एक रामबाण है और जिसका चयन किया जाता है, उसे संबोधित किए जाने वाले विशिष्ट प्रश्न के अनुरूप होने की आवश्यकता है।

भविष्य के अध्ययन विशिष्ट प्रयोगात्मक जोड़तोड़ को रोजगार और खगोल कोशिका संरचना के विभिन्न घटकों की जांच कर सकते हैं (सोमा, शाखाओं, प्रक्रियाओं, क्षेत्र, आदि) रूपात्मक सवालों के जवाब देने के लिए. यह एस्ट्रोसाइट आकारिकी और इसके कार्यात्मक प्रभावों में अंतर्दृष्टि और दिशा प्रदान कर सकता है, जिसका सुपर रेजोल्यूशन लाइट माइक्रोस्कोपी या इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी4द्वारा आगे विश्लेषण किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, LY iontophoris ठीक एस्ट्रोसाइट प्रक्रियाओं, जो synapses के हजारों संपर्क और synaptic कार्यों में शामिल हैं कल्पना करने के लिए एक साधन प्रदान करता है. अध्ययन कैसे इन प्रक्रियाओं की संरचना विभिन्न रोग स्थितियों में परिवर्तन स्वास्थ्य और रोग में astrocytes की भूमिका स्पष्ट करने में मदद कर सकता है. लय आयनफोरोसिस विस्तृत कोशिका आकारिकी की कल्पना करने और केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में उनके कार्यों को बेहतर ढंग से समझने के लिए एस्ट्रोसाइट गुणों की विशेषता करने के लिए एक महत्वपूर्ण तकनीक है।

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Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

लेखकों सुश्री Soto, डॉ यू, और मार्गदर्शन के लिए डॉ Octeau धन्यवाद के रूप में के रूप में अच्छी तरह से पाठ पर टिप्पणी. यह कार्य NS060677 द्वारा समर्थित है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10% Buffered Formalin Phosphate Fisher SF 100-20 An identical alternative can be used
Acrodisc Syringe Filters with Supor Membrane Pall 4692 An identical alternative can be used
Ag/AgCl ground pellet WPI EP2 A similar alternative can be used
Alexa Fluor 546 goat anti-chicken IgG (H+L) Thermo Scientific A-11040 A similar alternative can be used
Alexa Fluor 647 goat anti-rabbit IgG (H+L) Thermo Scientific A27040 A similar alternative can be used
Anti Aquaporin-4 antibody Novus Biologicals NBP1-87679 A similar alternative can be used
Anti GFAP antibody Abcam ab4674 A similar alternative can be used
Borosilicate glass pipettes with filament World precision instruments 1B150F-4
C57BL/6NTac mice Taconic Stock B6 A similar alternative can be used
Calcium Chloride Sigma 21108 An identical alternative can be used
Confocal laser-scanning microscope Olympus FV1000MPE A similar alternative can be used
D-glucose Sigma G7528 An identical alternative can be used
Disodium Phosphate Sigma 255793 An identical alternative can be used
Electrode puller- Model P-97 Sutter P-97 A similar alternative can be used
Fluoromount-G Southern Biotech 0100-01 An identical alternative can be used
Heparin sodium injection (1,000 USP per mL) Sagent Pharmaceuticals 400-10 An identical alternative can be used
Imaris software (Version 7.6.5) Bitplane Inc. A similar alternative can be used
Isofluorane Henry Schein Animal Health 29404 An identical alternative can be used
Lidocaine Hydrochloride Injectable (2%) Clipper 1050035 An identical alternative can be used
Lucifer Yellow CH dilithium salt Sigma L0259
Lucifer Yellow CH dipotassium salt Sigma L0144
Magnesium Chloride Sigma M8266 An identical alternative can be used
Microscope Cover Glass Thermo Scientific 24X60-1 An identical alternative can be used
Microscope Slides Fisher 12-544-2 An identical alternative can be used
Normal Goat Serum Vector Laboratories S-1000 An identical alternative can be used
Objective lens (40x) Olympus LUMPLFLN 40XW A similar alternative can be used
Objective lens (60x) Olympus PlanAPO 60X A similar alternative can be used
PBS tablets, 100 mL VWR VWRVE404 An identical alternative can be used
Pipette micromanipulator- Model ROE-200 Sutter MP-285 / ROE-200 / MPC-200 A similar alternative can be used
Potassium Chloride Sigma P3911 An identical alternative can be used
Sodium Bicarbonate Sigma S5761 An identical alternative can be used
Sodium Chloride Sigma S5886 An identical alternative can be used
Stimulator- Model Omnical 2010 World precision instruments Omnical 2010 A similar alternative can be used
Triton X 100 Sigma T8787 An identical alternative can be used
Vibratome- Model #3000 Pelco 100-S A similar alternative can be used

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खगोलकोशिका रूपविज्ञान का उपयोग करते हुए ल्यूसिफ़र पीला आयन्टोफोरोसिस का दृश्य
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Moye, S. L., Diaz-Castro, B., Gangwani, M. R., Khakh, B. S. Visualizing Astrocyte Morphology Using Lucifer Yellow Iontophoresis. J. Vis. Exp. (151), e60225, doi:10.3791/60225 (2019).More

Moye, S. L., Diaz-Castro, B., Gangwani, M. R., Khakh, B. S. Visualizing Astrocyte Morphology Using Lucifer Yellow Iontophoresis. J. Vis. Exp. (151), e60225, doi:10.3791/60225 (2019).

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