Summary

Visualizzazione della morfologia degli astrociti utilizzando Lucifero Giallo Iontoresis

Published: September 14, 2019
doi:

Summary

Gli astrociti sono cellule morfologicamente complesse, esemplificate dai loro molteplici processi e territori cespugliosi. Per analizzare la loro morfologia elaborata, presentiamo un protocollo affidabile per eseguire iontoforesi gialla di Lucifero intracellulare in tessuto leggermente fissato.

Abstract

Gli astrociti sono componenti essenziali dei circuiti neurali. Tile tutto il sistema nervoso centrale (CNS) e sono coinvolti in una varietà di funzioni, che includono l’autorizzazione del neurotrasmettitore, regolazione iosse, modulazione sinaptica, supporto metabolico ai neuroni, e regolazione del flusso sanguigno. Gli astrociti sono cellule complesse che hanno un soma, diversi rami principali e numerosi processi fini che contattano diversi elementi cellulari all’interno del neuropil. Per valutare la morfologia degli astrociti, è necessario disporre di un metodo affidabile e riproducibile per visualizzare la loro struttura. Riportiamo un protocollo affidabile per eseguire iontoresi intracellulare di astrociti utilizzando colorante giallo Lucifero fluorescente (LY) nel tessuto cerebrale leggermente fissato da topi adulti. Questo metodo ha diverse caratteristiche che sono utili per caratterizzare la morfologia degli astrociti. Permette la ricostruzione tridimensionale dei singoli astrociti, utile per eseguire analisi morfologiche su diversi aspetti della loro struttura. L’immunohistochimica insieme alla iontoforesi LY può anche essere utilizzata per comprendere l’interazione degli astrociti con diversi componenti del sistema nervoso e per valutare l’espressione delle proteine all’interno degli astrociti etichettati. Questo protocollo può essere implementato in una varietà di modelli murini di disturbi del SNC per esaminare rigorosamente la morfologia degli astrociti con microscopia leggera. LY iontohoresis fornisce un approccio sperimentale per valutare la struttura degli astrociti, soprattutto nel contesto di lesioni o malattie in cui queste cellule sono proposte per subire cambiamenti morfologici significativi.

Introduction

Gli astrociti sono le cellule gliali più abbondanti nel sistema nervoso centrale (SNC). Essi svolgono ruoli in omeostasi iogeno, regolazione del flusso sanguigno, formazione di sinapsi così come l’eliminazione, e l’assorbimento del neurotrasmettitore1. L’ampia gamma di funzioni astrocite si riflette nella loro complessa struttura morfologica2,3. Gli astrociti contengono diversi rami primari e secondari che si dividono in migliaia di ramifici e volantini più sottili che interagiscono direttamente con sinapsi, dendriti, assoni, vasi sanguigni e altre cellule gliali. La morfologia degli astrociti varia tra diverse regioni del cervello, che possono suggerire la loro capacità di svolgere le loro funzioni in modo differenziale nei circuiti neuronali4. Inoltre, gli astrociti sono noti per alterare la loro morfologia durante lo sviluppo, durante le condizioni fisiologiche, e in più stati di malattia3,5,6.

È necessario un metodo coerente e riproducibile per risolvere con precisione la complessità della morfologia degli astrociti. Tradizionalmente, l’immunohistochimica è stata utilizzata per visualizzare gli astrociti con l’uso di marcatori proteici specifici o arricchiti di astrociti. Tuttavia, questi metodi rivelano il modello di espressione proteica piuttosto che la struttura dell’astrocito. I marcatori comunemente usati, come la proteina acida fibrillare gliale (GFAP) e la proteina legante del calcio S100 , non esprimono nell’intero volume cellulare e quindi non risolvono la morfologia completa7. Gli approcci genetici per esprimere onnipresenti proteine fluorescenti negli astrociti (iniezioni virali o linee di segnalazione di topi transgenici) possono identificare i rami più fini e il territorio generale. Tuttavia, è difficile distinguere gli astrociti individuali e le analisi possono essere di parte dalla popolazione di astrociti presa di mira dal promotore specifico8. La microscopia elettronica della sezione seriale è stata utilizzata per rivelare un quadro dettagliato delle interazioni dei processi astrociti con le sinapsi. A causa delle migliaia di processi astrociti che contattano le sinapsi, attualmente non è possibile ricostruire un’intera cella con questa tecnica9, anche se questo dovrebbe cambiare con l’uso di approcci di apprendimento automatico per l’analisi dei dati.

In questo rapporto, ci concentriamo su una procedura per caratterizzare gli astrociti del topo utilizzando la iontoresi intracellulare con colorante giallo Lucifero (LY), usando il radiato strato CA1 come esempio. Il metodo si basa sul lavoro passato pionieristico di Eric Bushong e Mark Ellisman10,11. Gli astrociti da fette di cervello leggermente fissate sono identificati dalla loro caratteristica forma di soma e riempiti con LY. Le cellule vengono poi immagini con microscopia confocale. Dimostriamo come la iontoresi LY possa essere usata per ricostruire singoli astrociti ed eseguire analisi morfologiche dettagliate dei loro processi e territori. Inoltre, questo metodo può essere applicato in combinazione con l’immunostochimica per identificare le relazioni spaziali e le interazioni tra astrociti e neuroni, altre cellule gliali e vascolatura cerebrale. Consideriamo LY iontoresis uno strumento molto adatto per analizzare la morfologia in diverse regioni del cervello e modelli murini di condizioni sane o malattie7,12,13.

Protocol

Gli esperimenti sugli animali in questo studio sono stati eseguiti in conformità con il National Institute of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals e sono stati approvati dal Chancellor’s Animal Research Committee presso l’Università della California, Los Angeles. In tutti gli esperimenti sono stati usati topi adulti (6-8 settimane) di genere misto. 1. Preparazione della soluzione Soluzione di liquido cerebrospinale artificiale (ACSF) P…

Representative Results

I dati riportati in questo studio provengono da cellule 7/12 da 4 topi in ogni esperimento. I dati medi sono riportati nei pannelli figura, se del caso. Per valutare la morfologia degli astrociti, abbiamo eseguito la iontoresi intracellulare usando il tinrito LY per riempire gli astrociti nel radiato dello strato CA1, che è riassunto nella Figura 1. Figura 2 raffigura un astrocito rappresentativo e la sua struttura morfologica elaborata. La cella…

Discussion

Il metodo descritto in questo documento descrive un modo per visualizzare la morfologia degli astrociti utilizzando l’iontoresi intracellulare di LY dye in fette cerebrali leggermente fissate. Ci sono diversi fattori critici evidenziati in questo protocollo che contribuiscono al successo della iontoforesi LY e alla ricostruzione morfologica delle cellule. Un fattore è la qualità e la riproducibilità delle immagini, che è determinata in gran parte dall’età del topo e dal risultato della perfusione. In questo studio, …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gli autori ringraziano la signora Soto, il dottor Yu e il dottor Octeau per la guida e i commenti sul testo. Questo lavoro è supportato da NS060677.

Materials

10% Buffered Formalin Phosphate Fisher SF 100-20 An identical alternative can be used
Acrodisc Syringe Filters with Supor Membrane Pall 4692 An identical alternative can be used
Ag/AgCl ground pellet WPI EP2 A similar alternative can be used
Alexa Fluor 546 goat anti-chicken IgG (H+L) Thermo Scientific A-11040 A similar alternative can be used
Alexa Fluor 647 goat anti-rabbit IgG (H+L) Thermo Scientific A27040 A similar alternative can be used
Anti Aquaporin-4 antibody Novus Biologicals NBP1-87679 A similar alternative can be used
Anti GFAP antibody Abcam ab4674 A similar alternative can be used
Borosilicate glass pipettes with filament World precision instruments 1B150F-4
C57BL/6NTac mice Taconic Stock B6 A similar alternative can be used
Calcium Chloride Sigma 21108 An identical alternative can be used
Confocal laser-scanning microscope Olympus FV1000MPE A similar alternative can be used
D-glucose Sigma G7528 An identical alternative can be used
Disodium Phosphate Sigma 255793 An identical alternative can be used
Electrode puller- Model P-97 Sutter P-97 A similar alternative can be used
Fluoromount-G Southern Biotech 0100-01 An identical alternative can be used
Heparin sodium injection (1,000 USP per mL) Sagent Pharmaceuticals 400-10 An identical alternative can be used
Imaris software (Version 7.6.5) Bitplane Inc. A similar alternative can be used
Isofluorane Henry Schein Animal Health 29404 An identical alternative can be used
Lidocaine Hydrochloride Injectable (2%) Clipper 1050035 An identical alternative can be used
Lucifer Yellow CH dilithium salt Sigma L0259
Lucifer Yellow CH dipotassium salt Sigma L0144
Magnesium Chloride Sigma M8266 An identical alternative can be used
Microscope Cover Glass Thermo Scientific 24X60-1 An identical alternative can be used
Microscope Slides Fisher 12-544-2 An identical alternative can be used
Normal Goat Serum Vector Laboratories S-1000 An identical alternative can be used
Objective lens (40x) Olympus LUMPLFLN 40XW A similar alternative can be used
Objective lens (60x) Olympus PlanAPO 60X A similar alternative can be used
PBS tablets, 100 mL VWR VWRVE404 An identical alternative can be used
Pipette micromanipulator- Model ROE-200 Sutter MP-285 / ROE-200 / MPC-200 A similar alternative can be used
Potassium Chloride Sigma P3911 An identical alternative can be used
Sodium Bicarbonate Sigma S5761 An identical alternative can be used
Sodium Chloride Sigma S5886 An identical alternative can be used
Stimulator- Model Omnical 2010 World precision instruments Omnical 2010 A similar alternative can be used
Triton X 100 Sigma T8787 An identical alternative can be used
Vibratome- Model #3000 Pelco 100-S A similar alternative can be used

References

  1. Khakh, B. S., Sofroniew, M. V. Diversity of astrocyte functions and phenotypes in neural circuits. Nature Neuroscience. 18 (7), 942-952 (2015).
  2. Ben Haim, L., Rowitch, D. H. Functional diversity of astrocytes in neural circuit regulation. Nature Reviews Neuroscience. 18 (1), 31-41 (2017).
  3. Schiweck, J., Eickholt, B. J., Murk, K. Important Shapeshifter: Mechanisms Allowing Astrocytes to Respond to the Changing Nervous System During Development, Injury and Disease. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 261 (2018).
  4. Chai, H., et al. Neural Circuit-Specialized Astrocytes: Transcriptomic, Proteomic, Morphological, and Functional Evidence. Neuron. 95 (3), 531-549 (2017).
  5. Sun, D., Jakobs, T. C. Structural remodeling of astrocytes in the injured CNS. Neuroscientist. 18 (6), 567-588 (2012).
  6. Naskar, S., Chattarji, S. Stress Elicits Contrasting Effects on the Structure and Number of Astrocytes in the Amygdala versus Hippocampus. eNeuro. 6 (1), (2019).
  7. Sun, D., Lye-Barthel, M., Masland, R. H., Jakobs, T. C. The morphology and spatial arrangement of astrocytes in the optic nerve head of the mouse. Journal of Comparative Neurology. 516 (1), 1-19 (2009).
  8. Grosche, A., et al. Versatile and simple approach to determine astrocyte territories in mouse neocortex and hippocampus. PLoS ONE. 8 (7), 69143 (2013).
  9. Kaynig, V., et al. Large-scale automatic reconstruction of neuronal processes from electron microscopy images. Medical Image Analysis. 22 (1), 77-88 (2015).
  10. Bushong, E. A., Martone, M. E., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. Protoplasmic astrocytes in CA1 stratum radiatum occupy separate anatomical domains. Journal of Neuroscience. 22 (1), 183-192 (2002).
  11. Wilhelmsson, U., et al. Redefining the concept of reactive astrocytes as cells that remain within their unique domains upon reaction to injury. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (46), 17513-17518 (2006).
  12. Williams, M. E., et al. Cadherin-9 regulates synapse-specific differentiation in the developing hippocampus. Neuron. 71 (4), 640-655 (2011).
  13. Ogata, K., Kosaka, T. Structural and quantitative analysis of astrocytes in the mouse hippocampus. Neuroscience. 113 (1), 221-233 (2002).
  14. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
  15. Hubbard, J. A., Hsu, M. S., Seldin, M. M., Binder, D. K. Expression of the Astrocyte Water Channel Aquaporin-4 in the Mouse Brain. ASN Neuro. 7 (5), (2015).
  16. Benediktsson, A. M., et al. Ballistic labeling and dynamic imaging of astrocytes in organotypic hippocampal slice cultures. Journal of Neuroscience Methods. 141 (1), 41-53 (2005).
  17. Fouquet, C., et al. Improving axial resolution in confocal microscopy with new high refractive index mounting media. PLoS ONE. 10 (3), 0121096 (2015).
  18. Luna, G., et al. Astrocyte structural reactivity and plasticity in models of retinal detachment. Experimental Eye Research. 150, 4-21 (2016).
  19. Octeau, J. C., et al. An Optical Neuron-Astrocyte Proximity Assay at Synaptic Distance Scales. Neuron. 98 (1), 49-66 (2018).
  20. Sosunov, A. A., et al. Phenotypic heterogeneity and plasticity of isocortical and hippocampal astrocytes in the human brain. Journal of Neuroscience. 34 (6), 2285-2298 (2014).
  21. Park, Y. M., et al. Astrocyte Specificity and Coverage of hGFAP-CreERT2 [Tg(GFAP-Cre/ERT2)13Kdmc] Mouse Line in Various Brain Regions. Experimental Neurobiology. 27 (6), 508-525 (2018).
  22. Koeppen, J., et al. Functional Consequences of Synapse Remodeling Following Astrocyte-Specific Regulation of Ephrin-B1 in the Adult Hippocampus. Journal of Neuroscience. 38 (25), 5710-5726 (2018).
  23. Jefferis, G. S., Livet, J. Sparse and combinatorial neuron labelling. Current Opinion in Neurobiology. 22 (1), 101-110 (2012).
  24. Lanjakornsiripan, D., et al. Layer-specific morphological and molecular differences in neocortical astrocytes and their dependence on neuronal layers. Nature Communications. 9 (1), 1623 (2018).

Play Video

Cite This Article
Moye, S. L., Diaz-Castro, B., Gangwani, M. R., Khakh, B. S. Visualizing Astrocyte Morphology Using Lucifer Yellow Iontophoresis. J. Vis. Exp. (151), e60225, doi:10.3791/60225 (2019).

View Video