Summary

Visualización de la morfología de los astrocitos usando la iontoforesis amarilla de Lucifer

Published: September 14, 2019
doi:

Summary

Los astrocitos son células morfológicamente complejas, ejemplificadas por sus múltiples procesos y territorios tupidos. Para analizar su elaborada morfología, presentamos un protocolo fiable para realizar la iontoforesis amarilla de Lucifer intracelular en tejido ligeramente fijo.

Abstract

Los astrocitos son componentes esenciales de los circuitos neuronales. Azulejon todo el sistema nervioso central (SNC) y están involucrados en una variedad de funciones, que incluyen aclaramiento de neurotransmisores, regulación iónica, modulación sináptica, apoyo metabólico a las neuronas, y regulación del flujo sanguíneo. Los astrocitos son células complejas que tienen un soma, varias ramas principales y numerosos procesos finos que contactan diversos elementos celulares dentro del neuropil. Para evaluar la morfología de los astrocitos, es necesario disponer de un método fiable y reproducible para visualizar su estructura. Reportamos un protocolo confiable para realizar la iontoforesis intracelular de astrocitos usando el tinte fluorescente amarillo Lucifer (LY) en tejido cerebral ligeramente fijo de ratones adultos. Este método tiene varias características que son útiles para caracterizar la morfología de los astrocitos. Permite la reconstrucción tridimensional de astrocitos individuales, lo que es útil para realizar análisis morfológicos sobre diferentes aspectos de su estructura. La inmunohistoquímica junto con la iontoforesis LY también se puede utilizar para entender la interacción de los astrocitos con diferentes componentes del sistema nervioso y para evaluar la expresión de proteínas dentro de los astrocitos etiquetados. Este protocolo se puede implementar en una variedad de modelos de ratón de trastornos del SNC para examinar rigurosamente la morfología de los astrocitos con microscopía ligera. La iontoforesis LY proporciona un enfoque experimental para evaluar la estructura de los astrocitos, especialmente en el contexto de lesiones o enfermedades en las que se propone que estas células se sometan a cambios morfológicos significativos.

Introduction

Los astrocitos son las células gliales más abundantes en el sistema nervioso central (SNC). Juegan papeles en la homeostasis iónial, regulación del flujo sanguíneo, formación de sinapsis, así como la eliminación, y la aceptación de neurotransmisores1. La amplia gama de funciones astrocitos se refleja en su compleja estructura morfológica2,3. Los astrocitos contienen varias ramas primarias y secundarias que se dividen en miles de ramitas y foliolos más finos que interactúan directamente con sinapsis, dendritas, axones, vasos sanguíneos y otras células gliales. La morfología de los astrocitos varía según las diferentes regiones cerebrales, lo que puede insinuar su capacidad para realizar sus funciones diferencialmente en los circuitos neuronales4. Además, se sabe que los astrocitos alteran su morfología durante el desarrollo, durante las condiciones fisiológicas, y en múltiples estados de enfermedad3,5,6.

Se necesita un método consistente y reproducible para resolver con precisión la complejidad de la morfología de los astrocitos. Tradicionalmente, la inmunohistoquímica se ha utilizado para visualizar astrocitos con el uso de marcadores de proteínas específicas de astrocitos o enriquecidos con astrocitos. Sin embargo, estos métodos revelan el patrón de expresión de proteínas en lugar de la estructura del astrocito. Los marcadores de uso común, como la proteína ácida fibrilar glial (GFAP) y la proteína de unión al calcio S100 (S100), no se expresan en todo el volumen celular y, por lo tanto, no resuelven la morfología completa7. Los enfoques genéticos para expresar las proteínas fluorescentes de forma omnipresente en los astrocitos (inyecciones virales o líneas de reporteros de ratones transgénicos) pueden identificar las ramas más finas y el territorio en general. Sin embargo, es difícil diferenciar los astrocitos individuales, y los análisis pueden ser sesgados por la población de astrocitos a los que apunta el promotor específico8. La microscopía electrónica de sección serial se ha utilizado para revelar una imagen detallada de las interacciones de los procesos de astrocitos con sinapsis. Debido a los miles de procesos de astrocitos que contactan con sinapsis, actualmente no es posible reconstruir una célula entera con esta técnica9,aunque se espera que esto cambie con el uso de enfoques de aprendizaje automático para el análisis de datos.

En este informe, nos centramos en un procedimiento para caracterizar los astrocitos de ratón utilizando la iontoforesis intracelular con el tinte amarillo Lucifer (LY), utilizando como ejemplo el radiatum de estrato CA1. El método se basa en trabajos pasados pioneros de Eric Bushong y Mark Ellisman10,11. Los astrocitos de las rebanadas cerebrales ligeramente fijas se identifican por su forma distintiva de soma y se llenan de LY. A continuación, las células se imagee con microscopía confocal. Demostramos cómo la iontoforesis LY se puede utilizar para reconstruir astrocitos individuales y realizar análisis morfológicos detallados de sus procesos y territorio. Además, este método se puede aplicar junto con la inmunohistoquímica para identificar las relaciones espaciales y las interacciones entre astrocitos y neuronas, otras células gliales y vasculatura cerebral. Consideramos QUE LA iontoforesis LY es una herramienta muy adecuada para analizar la morfología en diferentes regiones cerebrales y modelos de ratón de condiciones saludables o de enfermedad7,12,13.

Protocol

Los experimentos con animales en este estudio se realizaron de acuerdo con la Guía del Instituto Nacional de Salud para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio y fueron aprobados por el Comité de Investigación Animal del Canciller en la Universidad de California, Los Angeles. En todos los experimentos se utilizaron ratones adultos (6 a 8 semanas de edad) de género mixto. 1. Preparación de la solución Solución de líquido cefalorraquídeo artificial (ACSF)…

Representative Results

Los datos reportados en este estudio provienen de 7 a 12 células de 4 ratones en cada experimento. Los datos medios se indican en los paneles de figuras cuando proceda. Para evaluar la morfología de los astrocitos, realizamos iontoforesis intracelular utilizando el tinte LY para rellenar los astrocitos en el estrato radiatón CA1, que se resume en la Figura 1. La Figura 2 representa un astrocito representativo y su elaborada estructura morfológ…

Discussion

El método descrito en este artículo describe una manera de visualizar la morfología de los astrocitos utilizando la iontoforesis intracelular del tinte LY en rebanadas cerebrales ligeramente fijas. Hay varios factores críticos destacados en este protocolo que contribuyen al éxito de la iontoforesis LY y la reconstrucción morfológica de las células. Un factor es la calidad y reproducibilidad de las imágenes, que se determina en gran medida por la edad del ratón y el resultado de la perfusión. En este estudio, u…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Los autores agradecen a la Sra. Soto, al Dr. Yu y al Dr. Octeau por su orientación, así como por sus comentarios sobre el texto. Este trabajo es compatible con NS060677.

Materials

10% Buffered Formalin Phosphate Fisher SF 100-20 An identical alternative can be used
Acrodisc Syringe Filters with Supor Membrane Pall 4692 An identical alternative can be used
Ag/AgCl ground pellet WPI EP2 A similar alternative can be used
Alexa Fluor 546 goat anti-chicken IgG (H+L) Thermo Scientific A-11040 A similar alternative can be used
Alexa Fluor 647 goat anti-rabbit IgG (H+L) Thermo Scientific A27040 A similar alternative can be used
Anti Aquaporin-4 antibody Novus Biologicals NBP1-87679 A similar alternative can be used
Anti GFAP antibody Abcam ab4674 A similar alternative can be used
Borosilicate glass pipettes with filament World precision instruments 1B150F-4
C57BL/6NTac mice Taconic Stock B6 A similar alternative can be used
Calcium Chloride Sigma 21108 An identical alternative can be used
Confocal laser-scanning microscope Olympus FV1000MPE A similar alternative can be used
D-glucose Sigma G7528 An identical alternative can be used
Disodium Phosphate Sigma 255793 An identical alternative can be used
Electrode puller- Model P-97 Sutter P-97 A similar alternative can be used
Fluoromount-G Southern Biotech 0100-01 An identical alternative can be used
Heparin sodium injection (1,000 USP per mL) Sagent Pharmaceuticals 400-10 An identical alternative can be used
Imaris software (Version 7.6.5) Bitplane Inc. A similar alternative can be used
Isofluorane Henry Schein Animal Health 29404 An identical alternative can be used
Lidocaine Hydrochloride Injectable (2%) Clipper 1050035 An identical alternative can be used
Lucifer Yellow CH dilithium salt Sigma L0259
Lucifer Yellow CH dipotassium salt Sigma L0144
Magnesium Chloride Sigma M8266 An identical alternative can be used
Microscope Cover Glass Thermo Scientific 24X60-1 An identical alternative can be used
Microscope Slides Fisher 12-544-2 An identical alternative can be used
Normal Goat Serum Vector Laboratories S-1000 An identical alternative can be used
Objective lens (40x) Olympus LUMPLFLN 40XW A similar alternative can be used
Objective lens (60x) Olympus PlanAPO 60X A similar alternative can be used
PBS tablets, 100 mL VWR VWRVE404 An identical alternative can be used
Pipette micromanipulator- Model ROE-200 Sutter MP-285 / ROE-200 / MPC-200 A similar alternative can be used
Potassium Chloride Sigma P3911 An identical alternative can be used
Sodium Bicarbonate Sigma S5761 An identical alternative can be used
Sodium Chloride Sigma S5886 An identical alternative can be used
Stimulator- Model Omnical 2010 World precision instruments Omnical 2010 A similar alternative can be used
Triton X 100 Sigma T8787 An identical alternative can be used
Vibratome- Model #3000 Pelco 100-S A similar alternative can be used

References

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Cite This Article
Moye, S. L., Diaz-Castro, B., Gangwani, M. R., Khakh, B. S. Visualizing Astrocyte Morphology Using Lucifer Yellow Iontophoresis. J. Vis. Exp. (151), e60225, doi:10.3791/60225 (2019).

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