Solid fase ¹¹C-methylering, oprensning og formulering til fremstilling af PET-Tracers

Summary

Vi rapporterer en effektiv Carbon-11 radiolabeling teknik til at producere klinisk relevante røbestoffer til Positron emission Tomography (PET) ved hjælp af solid Phase ekstraktions patroner. ¹¹ C-methylerende middel passerer gennem en cylinderampul, der er forudindlæst med forløber, og efterfølgende eluering med vandig ethanol giver kemisk og radiokemisk ren PET-røbestoffer i høje radiokemiske udbytter.

Abstract

Rutinemæssig produktion af aktive, der anvendes i Positron emission tomografi (PET) meste bygger på våd kemi, hvor den radioaktive synthon reagerer med en ikke-radioaktiv forløber i opløsning. Denne fremgangsmåde nødvendiggør rensning af sporstoffet ved højtryksvæskekromatografi (HPLC) efterfulgt af omformulering i et biokompatibelt opløsningsmiddel til human administration. Vi har for nylig udviklet en roman ¹¹C-methylering tilgang til den meget effektive syntese af Carbon-11 mærket Pet radioaktive lægemidler, drage fordel af solid Phase patroner som engangs "3-i-1" enheder til syntese, rensning og omformulering af røbestoffer. Denne fremgangsmåde overflødigt brugen af præparativ HPLC og reducerer tabene af Tracer i overførselslinjer og på grund af radioaktivt forfald. Desuden forbedrer den patron baserede teknik syntese sikkerheden, forenkler automatiseringsprocessen og letter overholdelsen af kravene til god fremstillingspraksis (GMP). Her viser vi denne teknik på eksemplet med produktion af en PET Tracer Pittsburgh sammensatte B ([¹¹C] PIB), en guld standard in vivo Imaging agent for amyloid plaques i den menneskelige hjerner.

Introduction

Positron emission tomografi (PET) er en molekylær Imaging modalitet, som er afhængig af påvisning af den radioaktive henfald af en isotop fastgjort til et biologisk aktivt molekyle for at muliggøre in vivo visualisering af biokemiske processer, signaler og transformationer . Carbon-11 (t_1/2 = 20,3 min) er en af de mest almindeligt anvendte radioisotoper i pet på grund af sin overflod i organiske molekyler og kort halveringstid, som giver mulighed for flere spor er administrationer på samme dag til samme menneskelige eller animalske emne og reducerer strålings byrden for patienterne. Mange røbestoffer mærket med denne isotop anvendes i kliniske undersøgelser og i grundlæggende sundhedsforskning for in vivo PET-billeddannelse af klassiske og spirende biologisk relevante mål-[¹¹c] Racloprid for D₂/D₃ -receptorer, [¹¹c] PiB for amyloid plaques, [¹¹C] PBR28 for translokat protein-for blot at nævne nogle få.

Carbon-11 mærket PET-røbestoffer fremstilles fortrinsvis via ¹¹C-methylering af ikke-radioaktive prækursorer, der indeholder-Oh (alkohol, phenol og CARBOXYLSYRE),-NH (Amin og AMID) eller-sh (thiol) grupper. Kort sagt er isotop genereret i gasmålet for en Cyclotron via en ¹⁴N (p, α)¹¹c nuklear reaktion i den kemiske form af [¹¹c] co₂. Sidstnævnte omdannes derefter til [¹¹c] methyliodid ([¹¹c] ch₃I) via enten våd kemi (reduktion til [¹¹c] LM₃Oh med lialh₄ efterfulgt af brat slukning med hi)¹ eller tør Kemi (katalytisk reduktion til [¹¹C] ch₄ efterfulgt af radikal iodering med molekyl-I₂)². [¹¹C] Kap₃jeg kan derefter yderligere omdannes til den mere reaktive ¹¹c-methyl triflate ([¹¹c] ch₃OTF) ved at passere den over en sølv triflate kolonne³. Den ¹¹C-methylering udføres derefter ved enten at boblende den radioaktive gas i en opløsning af ikke-radioaktiv forløber i organisk opløsningsmiddel eller via den mere elegante bundne opløsningsmiddel "loop" metode^4,5. Den ¹¹C-Tracer renses derefter ved hjælp af HPLC, omformuleret i et biokompatibelt opløsningsmiddel, og passerer gennem et sterilt filter, inden det gives til forsøgspersoner. Alle disse manipulationer skal være hurtige og pålidelige i betragtning af den korte Half-Life af Carbon-11. Brugen af et HPLC-system øger imidlertid markant tabet af sporstof og produktionstid, kræver ofte brug af giftige opløsningsmidler, komplicerer automatisering og lejlighedsvis fører til mislykkede synteser. Desuden forlænger den påkrævede rensning af reaktorerne og HPLC-søjlen forsinkelser mellem synteser af efterfølgende spor batcher og øger personalets eksponering for stråling.

Radio kemien af fluor-18 (t_1/2 = 109,7 min), den anden udbredte Pet-isotop, er for nylig blevet fremskreden via udviklingen af kassette baserede kits, der forebygger behovet for HPLC-rensning. Ved at anvende faste fase ekstraktions patroner (SPE) giver disse fuldt engangs kits mulighed for en pålidelig rutinemæssig produktion af ¹⁸f-Tracers, herunder [¹⁸f] FDG, [¹⁸f] FMISO, [¹⁸f] FMC og andre, med kortere syntese gange, reduceret personale involvering og minimal vedligeholdelse af udstyret. En af grundene til Carbon-11 er stadig en mindre populær isotop i PET Imaging er en mangel på lignende kits til rutinemæssig produktion af ¹¹C-Tracers. Deres udvikling vil i høj grad forbedre syntetisk pålidelighed, øge radiokemiske udbytter og forenkle automatisering og forebyggende vedligeholdelse af produktions modulerne.

I øjeblikket er tilgængelige produktionssæt drage fordel af billige, engangs, SPE patroner i stedet for HPLC kolonner til adskillelse af radiotracer fra ureagerede radioaktive isotop, forløber og andre radioaktive og ikke-radioaktive biprodukter. Ideelt set fortsætter radioaktiv reaktionen også på den samme cylinderampul; for eksempel, [¹⁸f] fluoromethylering af dimethylaminoethanol med gasformigt [¹⁸f] ch₂BRF i produktionen af prostatacancer Imaging Pet Tracer [¹⁸F] fluoromethylcholin opstår på en kation-udveksling harpiks patron ⁶. selv om lignende procedurer for radioaktiv mærkning af flere ¹¹c-Tracers på cylinderampuller er blevet rapporteret^7,8 og blev særligt stærk for radio syntesen af [¹¹c] cholin⁹ og [¹¹C] methionin¹⁰, er disse eksempler fortsat begrænset til onkologiske Pet-røbestoffer, hvor adskillelsen fra forstadiet ofte ikke er påkrævet. Vi har for nylig rapporteret om udviklingen af "[¹¹c] kits" til fremstilling af [¹¹c] ch₃I¹¹ og efterfølgende ¹¹c-methylering, samt solid fase-støttede syntese¹² i vores bestræbelser på at at forenkle rutine produktionen af ¹¹C-trackere. Her ønsker vi at demonstrere vores fremskridt ved hjælp af eksemplet med solid fase støttet radio syntese af [¹¹C] PIB, et radiotracer til Aβ Imaging, som revolutionerede området for Alzheimers sygdom (ad) Imaging, da det blev først udviklet i 2003 ( Figur 1) ^13,14. I denne metode, flygtige [¹¹C] ch₃otf (BP 100 °c) er PASSERET over 6-Oh-BTA-0 forløber deponeret på harpiks af en engangs patron. PET Tracer [¹¹C] PIB er derefter adskilt fra forstadiet og radioaktive urenheder ved eluering fra cylinderampullen med biokompatibel vandig ethanol. Yderligere, vi automatiseret denne metode til [¹¹C] PIB radio syntese ved hjælp af en fjernbetjent radiokemi syntese modul og engangs kassette kits. Konkret implementerede vi denne røntgen syntese på et radiokemi modul med 20 ventiler, udstyret med sprøjte drev (Dispenser), som passer til standard 20 mL engangsplast sprøjte, gasflow regulator, vakuumpumpe og måler. På grund af enkelheden i denne metode, vi er overbeviste om, at det kan ændres til de fleste kommercielt tilgængelige automatiserede synthesizere, enten kassette-baserede eller dem udstyret med stationære ventiler. Denne solid fase understøttet teknik letter [¹¹C] PIB produktion i overensstemmelse med god fremstillingspraksis (GMP) regler og forbedrer syntese pålidelighed. Den teknik, der beskrives her, reducerer også mængden af prækursorer, som kræves til radio syntese, bruger kun "grønne" biokompatible opløsningsmidler og nedsætter tiden mellem på hinanden følgende produktionsbatcher.

Protocol

1. klargøring af buffere og eluenter

1. 2,72 g natriumacetattrihydrat opløses i 100 mL vand for at tilberede 0,2 M natriumacetat opløsning (opløsning A).
2. 11,4 mL iseddike opløses i 1 L vand for at tilberede 0,2 M eddikesyre opløsning (opløsning B).
3. Der kombineres 50 mL opløsning A med 450 mL opløsning B til klargøring af acetat bufferen ved pH 3,7 (buffer 1) i henhold til buffer referencecenter¹⁵. Kontroller pH-værdien af bufferen med pH-striber eller en pH-måler.
4. Der kombineres 12,5 mL absolut ethanol med 87,5 mL buffer 1 for at gøre 12,5% vandig EtOH-opløsning (vask 1) i en 100 mL flaske.
5. 15 mL absolut ethanol kombineres med 85 mL buffer 1 for at lave 15% vandig EtOH-opløsning (vask 2) i en 100 mL flaske.
6. 5 ml absolut ethanol kombineres med 5 mL buffer 1 for at fremstille 50% vandig EtOH-opløsning (endelig eluent) og trække 2,5 mL af denne opløsning til en 10 mL sprøjte.

2. anvendelse af forstadiet til cylinderampullen

1. 10 mL vand efterfulgt af 5 mL acetone gennem tC18-patronen for at gøre det til en forudsætning.
2. Tør cylinderampullen med en nitrogenstrøm på 50 mL/min i 1 min.
3. 2 mg af prækursoren 6-OH-BTA-0 opløses i 1 mL vandfri acetone.
4. Holder en luer-tip 250 μL præcisions glassprøjte nedad, trækkes 100 μL af forstadiet opløsning og 50 μL luftpude oven på væsken. Fjern nålen og Anvend forløberen opløsning på tC18 cylinderampullen fra den kvindelige ende ved langsomt at skubbe stemplet hele vejen ned. Du må ikke skubbe opløsningen yderligere!

3. opsætning af manifold til automatiseret syntese

1. Fastgør standard 5-Ports engangs manifold på syntese modulet og saml det i henhold til figur 2 og trin 3,2-3,5 nedenfor.
   Bemærk: Vi anbefaler at bruge acetone-resistente manifolder (Se tabel over materialer).
2. Port 1 har to positioner. Tilslut den vandrette indgang til den automatiserede dispenser, der er udstyret med en 20 mL sprøjte. Tilslut den lodrette indgang til flasken med vask 1.
3. Tilslut udgangen af modulet, der producerer [¹¹C] ch₃OHF til port 2 af manifolden.
4. Installer tC18-patronen, som er lastet med forløber 6-OH-BTA-0 mellem port 3 og 4.
5. Port 5 har to positioner. Tilslut den vandrette udgang til affaldsflasken, som skal indeholde mindst 200 mL. Tilslut den lodrette udgang til det sterile hætteglas til Tracer-samlingen via det sterile filter.

4. radio syntese af [¹¹C] PIB

Forsigtig: alle manipulationer, der involverer radioaktive isotoper, skal udføres i en blyafskærmet varm celle af personale med tilstrækkelig træning til at arbejde med radioaktive materialer.
Bemærk: denne protokol dækker ikke detaljerne i produktionen af [¹¹c] co₂ i Cyclotron og omdannelse heraf til [¹¹c] ch₃OHF ved hjælp af radiokemi modulet. Disse procedurer vil afhænge af det enkelte udstyr i radiokemi Lab og er uden for rammerne af denne protokol. Vores kæledyrscenter er udstyret med en IBA Cyclotron, som producerer Carbon-11 i den kemiske form af [¹¹c] co₂via den ¹⁴n (p, α)¹¹c nukleare reaktion med en N₂/o₂ gasblanding (99,5:0,5) i gassen og et kommercielt tilgængeligt modul til produktion af [¹¹c] ch₃I via den "tørre metode" (katalytisk reduktion til [¹¹c] ch₄ efterfulgt af radikal iodination). [¹¹C] CH₃OTF produceres ved at passere [¹¹C] ch₃I over en sølv triflat kolonne opvarmet til 175 °c ved 20 ml/min.

1. Levér [¹¹c] LM₃OTF ind i manifolden gennem port 2, og Send den gennem den belastede tC18 cylinderampul ved 20 ml/min udgangsstrøm reguleret af [¹¹c] ch₃OTF-modulet, via portene 3 og 4 og ind i affaldsflasken som vist på Figur 2A.
2. Når al radioaktivitet er blevet overført og fanget på tC18 cylinderampullen som overvåget af radioaktivitets detektoren bag patronholderen, skal du standse gasstrømmen ved at lukke port 2. Lad patronen sidde i 2 min for at fuldføre reaktionen.
3. Der trækkes 19 mL vaske 1 opløsning (Se trin 1,4) fra 100 mL flasken ind i doseringssprøjten gennem port 1 ved 100 mL/min som vist på figur 2B.
4. Der dispenserer 18,5 mL vaske 1-opløsning fra dispenseren gennem tC18-patronen via port 3 og 4 og ind i affaldsbeholderen på 50 ml/min som vist på figur 2C. Sørg for, at der ikke er luftbobler i manifold, da de kan mindske separations effektiviteten.
5. Gentag trin 4,3 og 4,4 fire gange, og tilbagetrækning og udlevering af 18,5 mL vaske 1 opløsning hver gang. Den totale volumen af vask 1 opløsning passeret gennem tC18 er 92,5 mL; Men, det kan variere inden for 90-100 mL rækkevidde afhængigt af den særlige syntese modul anvendes.
6. Indstil indgangs ledningen på port 1 fra vask 1 til vask 2 opløsning (Se trin 1,5).
7. Gentag trin 4,3 og 4,4 tre gange, og tilbagetrækning og udlevering af 18,5 mL vask 2 opløsning hver gang. Den totale volumen af vask 2 opløsning passeret gennem tC18 er 55,5 mL. Men, det kan variere inden for 50-60 mL rækkevidde afhængigt af den særlige syntese modul anvendes.
8. Skift ventil 5 mod det sidste hætteglas som vist på figur 2D. Frakobl linjen fra dispenseren og Tilslut den til 10 mL sprøjten, der indeholder 2,5 mL af den endelige eluerings opløsning (50% vandig EtOH, se trin 1,6) og 7,5 mL luft.
9. Hold sprøjten nedad, skub den endelige eluerings opløsning (2,5 mL) manuelt efterfulgt af luft (7,5 mL) gennem tC18-patronen via port 3 og 4 og ind i det sterile hætteglas til Tracer-samlingen via det sterile filter, som vist på figuren 2D.
10. Frakobl den tomme sprøjte, Tilslut 10 mL sprøjten indeholdende 10 mL steril fosfatbuffer (opskrift medfølger ikke, da den kan variere), og skub hele volumenet gennem tC18 cylinderampullen ind i det sterile hætteglas som beskrevet ovenfor (figur 2D ). Frakobl sprøjten og skyl linjen med 10 mL luft med den samme sprøjte.
11. Udtag 0,7 mL af den endelige røbestof formulering og Indsaml prøver til kvalitetskontrolprocedurer (0,1 mL), bakteriel endotoksin test (0,1 mL) og sterilitet (0,5 mL).

5. kvalitetskontrolprocedurer

Forsigtig: hvert parti af radio Tracer skal underkastes de relevante kvalitetskontrolprocedurer (QC) før frigivelse til PET Imaging site for indgivelse til mennesker eller dyr. Forfatterne af dette manuskript er ikke ansvarlige for overholdelse af radiotracer produceret på andre centre med lokale sundhedsmyndigheder regler.

1. Udføre præ-Release QC procedurer, som skal omfatte tests for radiokemisk identitet (RCI), radiokemisk renhed (RCP), kemisk renhed og molær aktivitet af Tracer samt resterende opløsningsmiddel indhold og pH af formuleringen.
2. Afgøre RCI, RCP, kemisk renhed og molær aktivitet ved hjælp af analytisk HPLC system udstyret med UV (overvågning ved 350 nm) og radioaktivitet detektorer, og en omvendt fase kolonne. Bestem opbevaringstiderne for 6-OH-BTA-0 og 6-OH-BTA-1 og Kalibrer instrumentet for at kvantificere indholdet af hver forbindelse.
3. Det restindhold af opløsningsmidlet bestemmes ved hjælp af et analytisk gaskromatografi system, der er udstyret med en kapillarkolonne. Bestem Opbevaringstiden for acetone og ethanol, og Kalibrer instrumentet for at kvantificere indholdet af hvert opløsningsmiddel.
4. Udfør bakterien endotoksiner test ved hjælp af en patron læser udstyret med egnede patroner.
5. Foretag sterilitets analysen af prøven mindst 14 dage efter syntesen for at sikre, at der ikke forekommer bakterievækst, eller sende sterilitets prøven til et laboratorium, der er akkrediteret af den lokale sundhedsmyndighed.

Representative Results

For at opsummere en typisk radio syntese af [¹¹c] PIB, er gasformigt [¹¹c] ch₃OTF først passeret gennem en tC18 cylinderampul forudindlæst med en opløsning af forløber (figur 1). Adskillelse af reaktionsblandingen opnås derefter ved successiv eluering med vandige ethanolopløsninger som følger. For det første, 12,5% EtOH PS størstedelen af ureageret [¹¹c] ch₃OTF og 6-Oh-BTA-0, derefter 15% EtOH skyller ud de resterende urenheder, og endelig en 50% ethanol opløsning elutter den ønskede [¹¹C] PIB i et sterilt hætteglas. Tracer fortyndes derefter med steril fosfatbuffer og gennemgår strenge QC procedurer før frigivelse til PET Imaging site. Typiske analytiske HPLC-UV-og radioaktivitets kromatogrammer af [¹¹C] PIB-batchen, der er egnet til administration, er gengivet i figur 3.

Den totale radio syntese tid er 10 min startende fra leveringen af [¹¹c] ch₃OTF, rcy af [¹¹c] PIB ved hjælp af 0,2 mg forløber er 22% (begyndende fra [¹¹c] ch₃OHF, ikke korrigeret for forfald) og molær aktivitet er 190 GBq/μmol. Tracer skal overholde alle QC specifikationer af multicenter dominantly nedarvede Alzheimers netværks forsøg enhed (DIAN-TU) for kliniske forsøg: den radiokemiske renhed skal være over 95%; det ikke-radioaktive indhold af urenheder skal være under 1,3 μg pr. 10 mL dosis. pH-værdien skal være inden for 4-8-intervallet. og indholdet af ethanol og acetone skal være under henholdsvis 10% og 3000 ppm. Prøverne skal også være sterile og endotoksin frie. Resultaterne af fire typiske radio syntese kørsler er opsummeret i tabel 1.

For at den rapporterede teknik kan fungere korrekt, skal der udvises forsigtighed under flere kritiske trin beskrevet ovenfor. For at anvende forløberen på tC18-patronen (trin 2,4) må opløsningen ikke skubbes mod udgangen, så den effektive vej til adskillelse af [¹¹C] PIB fra de ureagerede udgangsmaterialer og mulige side produkter ikke forkortes. Strømmen af [¹¹C] LM₃OHF gennem en cylinderampul under overførslen må ikke overstige 20 ml/min (trin 4,1). Når Elueringen begynder (trin 4,4), er det meget vigtigt at holde patronen våd og ikke lade luft igennem for at undgå kanalisering af effekter, som kan resultere i lavere renhed af sporstoffet eller lavere RCY på grund af tab af [¹¹C] PIB i affaldet. Hvis den 5-portmanifold, der anvendes i radio syntesen (trin 3,1), ikke er modstandsdygtig over for acetone, såsom en standardpolycarbonat-manifold som ACC-101, må mængden af acetone ikke overstige 100 μL, da større volumener kan beskadige manifold under aktivitets overførslen og resultere i mislykket syntese. Hvis pH-værdien ikke opfylder specifikationerne, kan tC18 cylinderampullen eventuelt skylles med 10 mL sterilt vand mellem trin 4,7 og 4,8 i affaldsflasken.

Figur 1: radio syntese af [¹¹c] PIB ved ¹¹c-methylering af 6-Oh-BTA-0 forløber med [¹¹c] ch₃OTF. [¹¹c] PIB er en af de mest udbredte aktive til billeddannelse af amyloid-plaques, der er associeret med AD og andre neurodegenerative tilstande af PET. Denne Tracer er almindeligvis syntetiseret via ¹¹c-methylering af anilin forløber kaldet 6-Oh-BTA-0 ved hjælp af [¹¹c] METHYLTRIFLAT ([¹¹c] ch₃OTF) enten i opløsning eller i tør HPLC injektion loop (solvens bundne teknik). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2: trin-for-trin syntese og rensning af [¹¹C] PIB på en tC18 cylinderampul. A) gasformigt [¹¹C] ch₃OTF ledes gennem patronen lastet med 6-Oh-BTA-0. Som beskrevet i trin 4,1 og 4,2 er [¹¹C] ch₃OTF fanget på cylinderampullen, der indeholder forløberen, og reagerer med forløberen ved stuetemperatur i 2 min.B) vask 1 eller vask 2 opløsningen trækkes ind i doseringssprøjten. Som beskrevet i trin 4,3, trækker sprøjtepumpen på modulet stemplet på den klippede sprøjte opad og trækker en opløsning af enten elueringsvæske ud gennem en linje, der er forbundet til manifoldens port 1. C) urenhederne vaskes ud i en affalds flaske. Som beskrevet i trin 4,4 flytter sprøjtens sprøjtepumpe stemplet på den klippede sprøjte nedad og skubber den udtagne vaskeopløsning gennem tC18-patronen via port 1, 3 og 4 af manifolden ind i en affalds flaske. Trin, der er repræsenteret i diagram B og C, gentages i en cyklus flere gange for at udvaske alle ureagerede materialer fra patronen, som beskrevet i trin 4,5-4,7. D) [¹¹C] PIB eluppes med det endelige elueringsvæske til et sterilt hætteglas gennem et sterilt filter. Som beskrevet i trin 4,8 og 4,9 frakobles sprøjten i en sprøjtepumpe fra linjen og udskiftes først med en 10 mL sprøjte, der indeholder 2,5 mL 50% vandig ethanol. 5 af manifolden skiftes derefter til det sterile hætteglas, og [¹¹C] PIB eluppes fra tC18 manuelt. Den tomme sprøjte udskiftes derefter med en anden sprøjte, der indeholder 10 mL steril fosfatbuffer, og hele indholdet skubbes gennem tC18 for at skylle linjerne som beskrevet i trin 4,10. Det sterile hætteglas indeholder nu [¹¹C] PIB i en 12,5 ml 10% bufferet vandig ethanol opløsning. Dette tal er blevet modificeret fra Boudjemeline et al.¹². Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3: analytisk kvalitetskontrol af HPLC [¹¹C] PIB. A) opbevaringstiderne for [¹¹c] ch₃Oh (fra hydrolyse af [¹¹c] ch₃OTF), ureageret [¹¹c] ch₃OTF og Tracer [¹¹c] pib på radio-og tv-kromatogrammet er 2,1, 4,0 og 6,6 min Henholdsvis. Analysen af sporingen af radioaktiviteten viser, at RCP på [¹¹C] PIB er 98,0%. B) opbevaringstiderne for 6-Oh-BTA-0 (forløber) og 6-Oh-BTA-1 (Tracer peak) på UV-kromatogrammet er henholdsvis 3,6 og 5,9 min. Analysen af UV-sporingen viser restkoncentrationen af prækursorer under den acceptable grænse (1,3 μg) og fraværet af andre ikke-radioaktive urenheder. Tracer's radiokemiske og kemiske renhed er således acceptabel for kliniske PET-undersøgelser. HPLC-betingelser-kolonne (tabel over materialer): 5 μm, 100 x 4,0 mm; Mobil fase: 40:60 acetonitril/vand gennemstrømningshastighed: 0,7 mL/min. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4: optimering af 6-Oh-BTA-0 forløber beløb. Det laveste beløb (0,1 mg) giver [¹¹C] PIB i et moderat radiokemisk udbytte (rcy) på 18,1 ± 3,8%. Radio syntese startende fra 0,2 mg giver [¹¹C] PIB en rcy på 22,0 ± 3,1%, mens øge mængden til 0,3 mg yderligere forbedrer rcy til 32.1 ± 3,7%, på bekostning af en lidt højere mængde af forløberen i det endelige produkt. Alle RCY'S er ikke korrigeret for forfald (Radio syntese tid på 10 min) startende fra radioaktiviteten af [¹¹C] ch₃OTF fanget på tC18 cylinderampul. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5: analytisk kvalitetskontrol af HPLC [¹¹C] ABP688. A) radioaktivitet kromatogrammet viser RCP af kombineret (E)-og (Z)-[¹¹C] ABP688 af 98,1%. B) UV-kromatogrammet viser restkoncentrationen af prækursorer på over 10 μg. Selv om den kemiske renhed kan være acceptabel for kliniske PET-undersøgelser, kræver relativt lav effektiv molær aktivitet (A_m ≪ 37 GBq/μmol) yderligere rensning optimering. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Batch	Run 1	Run 2	Køre 3	Køre 4
[11C] CH3OTF, GBq	9,21	11,25	7,84	6,44
[11C] PiB, GBq	2,26	2,37	2,11	1,41
RCY,% *	24,5	21,1	26,9	21,8
RCP,%	98	97,2	97,8	99,2
Molær aktivitet, GBq/μmol	154,6	322,6	121,1	162,1
Rest forløber, μg	0,32	0,55	0,58	0,87
Ph	5	5	5	5
EtOH-indhold,%	9,4	8,8	7,7	8,1
Acetone indhold, ppm	33	38	46	33
BET test	Nielsen	< 10 EU/mL	< 10 EU/mL	< 10 EU/mL
Sterilitets test	Nielsen	Ingen vækst	Ingen vækst	Ingen vækst
* Fodnote: fra [11C] ch3OTF, ikke korrigeret for forfald

Tabel 1. Repræsentative resultater af [¹¹C] PIB-produktionen kører under optimerede forhold. Alle batcher er i overensstemmelse med kravene til røbestoffer beregnet til kliniske PET-undersøgelser.

Discussion

På trods af den nylige fremkomsten og FDA godkendelse af flere ¹⁸F-mærkede Pet Tracers, såsom florbetapir, florbetaben og flutemetamol, [¹¹C] PIB er fortsat en guld standard Tracer til amyloid Imaging på grund af den hurtige hjerne optagelse og lav ikke-specifik Bindende. I øjeblikket er denne Tracer syntetiseres via enten våd kemi¹⁶ eller ved hjælp af en "Dry loop" tilgang^4,17. Begge metoder kræver HPLC rensning efterfulgt af omformulering i vandig ethanol, som tager ca. 20-30 min startende fra [¹¹C] ch₃OTF. Inspireret af nogle af de tidligere rapporter om solid fase støttet ¹¹c-methylering teknikker og den kliniske betydning af [¹¹c] PIB, vi har til formål at udvikle en radio syntese af denne Tracer ved hjælp af billig engangs fastfaseekstraktion ( SPE) patroner som en "3-i-1" enhed til reaktion, rensning og formulering.

De mest kritiske trin for en vellykket produktion af PET-røbestoffer til in vivo-billeddannelse hos forsøgspersoner er: 1) inkorporering af den radioaktive isotop i et Tracer-molekyle; 2) adskillelse af sporstof fra ikke-reagerede radioaktive og ikke-radioaktive arter; 3) omformulering af Tracer i et biologisk kompatibelt opløsningsmiddel; 4) overholdelse af kvalitetskontrolprocedurer. Baseret på den tidligere rapporterede solvent bundne metode forventede vi, at den SPE-støttede teknik ville kræve en lavere mængde forløber sammenlignet med ¹¹C-methylering i opløsning. Især, tidligere rapporterede opløsningsmiddel bundne procedurer for radio syntesen af [¹¹C] PIB kræver 0,5-1,0 mg af prækursor^4,17. Derfor undersøgte vi ikke korrigeret for henfald radiokemiske udbytter af [¹¹c] PIB startende fra [¹¹c] ch₃OHF på tre forskellige mængder af 6-Oh-bta-0:0,1, 0,2, og 0,3 mg. Selv det laveste beløb (0,1 mg) giver et moderat beløb på [¹¹C] PIB, omend ved relativt lav og mindre pålidelig rcy (18,1 ± 3,8%). Røntgen syntese startende fra 0,2 mg giver en RCY af [¹¹C] PIB (22,0 ± 3,1%), samtidig øge mængden til 0,3 mg yderligere forbedrer rcy (32.1 ± 3,7%), på bekostning af en lidt højere mængde af forløberen i det endelige produkt. I alle tilfælde blev radiosyntesen afsluttet i 10 min. Således, den optimale forløber beløb afhænger af den ønskede RCY og renhed af [¹¹C] PIB på særlige Pet Centers. Resultaterne af den radiokemiske udbytte optimering eksperimenter baseret på forløber beløb er opsummeret i figur 4. Radio syntese forsøg med [¹¹c] ch₃I som methylerende middel eller ethanol som reaktions solvent gav ikke den ønskede [¹¹c] PIB (data ikke vist).

Den kvantitative adskillelse af den radio syntese reaktionsblanding på en kort SPE-patron var den mest udfordrende del af den beskrevne teknik. Vi hypotese, at aromatiske aminer 6-OH-BTA-0 og 6-OH-BTA-1 overvejende findes i deres protonerede former i sure medier og derfor ville have skarpere elueringsprofiler fra den omvendte fase fast fase. Derfor blev alle vandige ethanolopløsninger fremstillet ved hjælp af 0,2 M acetatbuffer ved pH 3,7. Dernæst besluttede vi, at vandige ethanolopløsninger med EtOH-koncentration op til 15% gradvist elueres ureageret forløber 6-Oh-BTA-0 og [¹¹c] ch₃OHF, mens radioaktivt mærkede [¹¹c] PIB forbliver fanget på tC18-patronen. For at forhindre, at disse urenheder bliver til en endelig røbestof-formulering, blev ethanolkoncentrationen forhøjet fra 12,5% til 15% i en gradient eluering. Efter at alle urenheder var blevet skyllet ud af cylinderampullen, blev Tracer eluering opnået ved hjælp af en minimal mængde (2,5 mL) af den koncentrerede ethanolopløsning (50%). For at holde ethanolindholdet under 10%-grænsen og for at bringe pH-værdien af det formulerede sporstof inden for det acceptable interval for menneskelig injektion (4-8) blev traceren fortyndet med steril fosfatbuffer.

Følgende betingelser optimering, radio syntesen af [¹¹C] PIB blev automatiseret ved hjælp af en kommercielt tilgængelig automatiseret syntese enhed (ASU), udstyret med dispenser sprøjte og engangs Manifold. Manifold opsætningen for denne særlige ASU er ligetil som beskrevet i trin 3,1-3,5. Især denne metode kan let gennemføres på de fleste af de andre tilgængelige ASU efter de opskrifter, der er beskrevet ovenfor. Under optimerede betingelser syntetiseres partier på [¹¹C] PIB, der egner sig til klinisk anvendelse, med afsluttende aktiviteter fra 1,4 til 2,4 GBq (38-61 mCi).

For nylig, vi anvendte "3-i-1" teknik til radioaktiv mærkning af [¹¹C] ABP688, en pet Tracer til billeddannelse af metabotropic glutamat receptorer type 5 (mGlu5)^18,19. Radio syntese af denne Tracer er afhængig af den ¹¹C-methylering af-Oh-gruppen i oxim; Derfor er tilsætning af base nødvendig for at deprotonere desmethylprækursorer. Tetrabutylammonium hydroxid (som en 1 M opløsning i MeOH) blev valgt som base, fordi det er opløseligt i de fleste polære organiske opløsningsmidler. I et foreløbigt radioaktivt abeling-eksperiment blev en opløsning af prækursorer (0,5 mg) i DMSO (100 μL) blandet med 1 M TBAOH i MeOH (20 μL), og blandingen blev omhyggeligt påført på tC18-patronen som beskrevet ovenfor (Se trin 2,4). Gasformigt [¹¹C] ch₃jeg blev passeret gennem cylinderampullen som beskrevet i trin 4,1-4,2, og reaktionen fik lov til at fortsætte ved stuetemperatur i 5 min. sekventiel eluering med fortyndede Ethanolopløsninger i 0,2 M natriumbicarbonatbuffer (pH 8,5- 9,0)-92 mL af 15% EtOH efterfulgt af 92 mL 20% EtOH-vasket ud af ureageret [¹¹C] ch₃I og rest forløber. Radiokemisk ren [¹¹C] ABP688 (rcy = 18,2%, rcp > 98.0%) blev derefter elueret med 50% EtOH opløsning i samme buffer gennem et sterilt filter som beskrevet i trin 4,9-4,11. På trods af at over 98% af forstadiet fjernes med fortyndet ethanol skyller, kræver tilstedeværelsen af nogle ureagerede forløber i den endelige Tracer (op til 20 μg) yderligere optimering af den radio syntese procedure. Denne optimering er i gang, og resultaterne af dette projekt vil blive offentliggjort i rette kurs. Der er vist repræsentative analytiske HPLC-UV-og radioaktivitets kromatogrammer af partiet [¹¹C] ABP688 på figur 5.

Afslutningsvis har vi udviklet en effektiv solid fase støttet Carbon-11 radioaktiv mærkning procedure ved hjælp af let tilgængelige billige spe patroner som "3-i-1" enheder til radio syntese, rensning, og formulering af PET røbestoffer anvendes til kliniske Imaging. Røbestoffer egnet til menneskelig injektion er produceret inden for 10 min startende fra tilsætning af ¹¹c-methylerende middel ([¹¹c] ch₃OTF eller [¹¹c] ch₃i) i høj rcy og molær aktivitet. Vi fuldt automatiseret denne teknik til at gøre det i overensstemmelse med god fremstillingspraksis (GMP) regler pålagt af sundhed og stråling sikkerhedsmyndigheder. Solid fase understøttet radio syntese kræver en lav mængde af forløber, undgår brugen af giftige opløsningsmidler, nedsætter syntesen tid og strålingsdosis opretholdes af personalet. Desuden, undgå HPLC-relaterede fejl forbedrer radio syntese pålidelighed og giver mulighed for udvikling af engangs kits til rutinemæssig Tracer produktion.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-OH-BTA-0	ABX advanced biochemical compounds	5101	Non-radioactive precursor of [11C]PiB
6-OH-BTA-1	ABX advanced biochemical compounds	5140	Non-radioactive standard of [11C]PiB
Agilent 1200 HPLC system	Agilent	Agilent 1200	Analytical HPLC system
Ethanol absolute	Commercial alcohols	432526
Hamilton syringe (luer-tip, 250 µL)	Hamilton	HAM80701
MZ Analytical PerfectSil 120	MZ-Analysentechik GmbH	MZ1440-100040	Analytical HPLC column
Perkin Elmer Clarus 480 GC system	Perkin Elmer	Clarus 480	Gas chromotograph
polycarbonate manifold	Scintomics	ACC-101	Synthesis manifold
Restek MTX-Wax column (30 m, 0.53 mm)	Restek	70625-273	Analytical GC column
Scintomics GRP module	Scintomics	Scintomics GRP	Automated synthesis unit
Sep-Pak tC18 Plus	Waters	WAT020515	Solid phase extraction cartridge
solvent-resistant manifold	Scintomics	ACC-201	Synthesis manifold
Spinal needle	BD	405181
Sterile extension line	B. Braun	8255059
Sterile filter	Millipore	SLLG013SL
Sterile vial (20mL)	Huayi	SVV-20A
Sterile water	Baxter	JF7623
Synthra MeIplus Research	Synthra	MeIplus Research	[11C]CH3I/[11C]CH3OTf module
Syringe (10 mL)	BD	309604
Syringe (1mL)	BD	309659
Syringe (20 mL)	B. Braun	4617207V	Dispenser syringe
Vent filter	Millipore	TEFG02525