Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Pet İzleyicilerin Üretimi için Katı Faz 11C-Metilasyon, Arıtma ve Formülasyon

Published: October 24, 2019 doi: 10.3791/60237
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1,2
1McConnell Brain Imaging Centre, Montreal Neurological Institute, McGill University, 2Department of Neurology and Neurosurgery, McGill University
* These authors contributed equally

Summary

Pozitron Emisyon Tomografisi (PET) için katı faz ekstraksiyon kartuşları kullanarak klinik olarak alakalı izleyiciler üretmek için etkili bir karbon-11 radyoetiketleme tekniği rapor ediyoruz. 11.11.20 C-metilasyon maddesi, yüksek radyokimyasal verimlerde kimyasal ve radyokimyasal olarak saf PET izleyicileri sağlar, öncül ve art arda elüsyon ile önceden yüklenmiş bir kartuştan geçirilir.

Abstract

Pozitron emisyon tomografisinde (PET) kullanılan radyotracerlerin rutin üretimi çoğunlukla radyoaktif synthonun çözeltide radyoaktif olmayan bir öncülle reaksiyona girebildiği ıslak kimyaya dayanır. Bu yaklaşım, izleyicinin yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) ile saflaştırılmasını ve ardından insan yönetimi için biyouyumlu bir çözücüde yeniden formülasyonu gerektirir. Yakın zamanda karbon-11etiketli PET radyofarmasötiklerin yüksek verimli sentezi için 11 C-metilasyon yaklaşımı geliştirdik, katı faz kartuşlarından sentez, arıtma ve arıtma için tek kullanımlık "3'ü 1 arada" üniteler olarak yararlandık. izleyicilerin yeniden formülasyonu. Bu yaklaşım preparatif HPLC kullanımını ortadan uzatır ve transfer hatlarında ve radyoaktif bozunma nedeniyle izleyicinin kayıplarını azaltır. Ayrıca, kartuş tabanlı teknik sentez güvenilirliğini artırır, otomasyon sürecini kolaylaştırır ve İyi Üretim Uygulaması (GMP) gereksinimlerine uygunluğu kolaylaştırır. Burada, bu tekniği insan beynindeki amiloid plaklar için vivo görüntüleme ajanı olarak altın standart olan PET izleyicisi Pittsburgh bileşiği B 'nin([11C]PiB) üretimi örneğinde gösteriyoruz.

Introduction

Pozitron emisyon tomografisi (PET), biyokimyasal proseslerin, sinyallerin ve dönüşümlerin in vivo görselleştirilmesini sağlamak için biyolojik olarak aktif bir moleküle bağlı bir izotopun radyoaktif bozunmasını tespit etmeye dayanan moleküler görüntüleme yöntemidir. . Karbon-11 (t1/2 = 20,3 dk) pet'te en sık kullanılan radyoizotoplardan biridir, çünkü organik moleküllerdeki bolluğu ve kısa yarı ömrü aynı insan veya hayvan konusuna aynı gün birden fazla izleyici yönetimine izin verir ve hastalar üzerindeki radyasyon yükünü azaltır. Bu izotop ile etiketlenmiş birçok izotop klinik çalışmalarda ve klasik ve ortaya çıkan biyolojik olarak alakalı hedeflerin in vivo PET görüntüleme için temel sağlık araştırmalarında kullanılır - [11C]D2/ D3 reseptörleri için raclopride, [11C] Amiloid plaklar için PiB, [11C]Translocator protein için PBR28 - sadece birkaç isim.

Karbon-11 etiketli PET izleyiciler ağırlıklı olarak -OH (alkol, fenol ve karboksilik asit), -NH (amin ve amid) veya -SH (tiyol) grupları içeren radyoaktif olmayan öncüllerin 11C-metilasyon yoluyla üretilmektedir. Kısaca, izotop bir siklotonun gaz hedefinde 14N(p,α)11C nükleer reaksiyon yoluyla [11C]CO2kimyasal formunda üretilir. Daha sonra [11C]metil iyodüre([11C]CH3I) ıslak kimya yoluyla dönüştürülür (LiAlH4 ile [11C]CH3OH'a indirilir)1 veya kuru kimya (katalitik redüksiyon [11C]CH4 moleküler I2)2ile radikal iyot takip . [11C] CH3Daha sonra daha reaktif dönüştürülebilir 11C-metil triflate ([11C]CH3OTf) gümüş bir triflate sütun üzerinden geçirerek3. 11C-metilasyon sonra ya organik çözücü radyoaktif olmayan öncül bir çözüm içine radyoaktif gaz köpüren veya daha zarif tutsak çözücü "döngü" yöntemi 4 ile gerçekleştirilir4,5. 11C-tracer sonra HPLC yoluyla saflaştırılmış, biyouyumlu bir çözücü yeniden formüle, ve insan deneklere uygulanmadan önce steril bir filtre geçti. Tüm bu manipülasyonlar karbon-11 kısa yarı ömrü göz önüne alındığında hızlı ve güvenilir olmalıdır. Ancak, bir HPLC sisteminin kullanımı tracer ve üretim süresi kayıplarını önemli ölçüde artırır, genellikle toksik çözücülerin kullanımını gerektirir, otomasyonu zorlaştırır ve bazen başarısız sentezlere yol açar. Ayrıca, reaktörlerin ve HPLC kolonlarının gerekli temizliği, sonraki izleme serilerinin sentezleri arasındaki gecikmeleri uzatır ve personelin radyasyona maruz kalmasını artırır.

Flor-18 radyokimyası (t1/2 = 109.7 dk), diğer yaygın olarak kullanılan PET izotop, son zamanlarda HPLC arıtma ihtiyacını ortadan kalktıran kaset bazlı kitlerin geliştirilmesi yoluyla gelişmiştir. Katı faz ekstraksiyon (SPE) kartuşları ile bu tamamen tek kullanımlık kitler,[18F]FDG, [18F]FMISO, [18F]FMC ve diğerleri de dahil olmak üzere 18F-tracer'ın güvenilir rutin üretimine olanak sağlar ve daha kısa sentezle süreleri, personel katılımının azalması ve ekipmanın minimum bakımı. Pet görüntülemede karbon-11'in daha az popüler bir izotop olarak kalmasının nedenlerinden biri de 11C-tracer'ın rutin üretimi için benzer kitlerin olmamasıdır. Bunların geliştirilmesi sentetik güvenilirliği önemli ölçüde artıracak, radyokimyasal verimi artıracak ve üretim modüllerinin otomasyon ve önleyici bakımını basitleştirecektir.

Şu anda mevcut üretim kitleri, radiotracer'In reaksiyona yanakılmamış radyoaktif izotop, öncül ve diğer radyoaktif ve radyoaktif olmayan yan ürünlerden ayrılması için HPLC kolonları yerine ucuz, tek kullanımlık SPE kartuşlarından yararlanır. İdeal olarak, radyoetiketleme reaksiyonu da aynı kartuş üzerinde devam eder; örneğin,[18F] dietilaminoetanolün gaz içeren floretilasyonu [18F]CH2BrF prostat kanseri görüntüleme PET tracer üretiminde [18F]fluoromethylcholine bir katyon değişimi reçine kartuş oluşur 6. Kartuşlarda birkaç 11C-tracers radyoetiketleme için benzer prosedürler7bildirilmiştir rağmen,8 ve radyosentez için özellikle güçlü oldu [11C]kolin9 [11C]metiyonin10, bu örnekler öncülden ayrılmanın genellikle gerekli olmadığı onkolojik PET izleyicileri ile sınırlı kalır. Yakın zamanda [11C]CH3I11 ve sonraki 11C-metilasyon üretimi için "[11C]kitleri" gelişimini rapor, yanı sıra katı faz destekli sentez12 bizim çabaları 11C-tracers rutin üretimini basitleştirmek. Burada, 2003 yılında ilk geliştirildiğinde Alzheimer hastalığı (AD) görüntüleme alanında devrim yaratan Aβ görüntülemeiçin bir radyotracer olan [11C] PiB'in solid faz destekli radyosentezörneğini kullanarak ilerlememizi göstermek istiyoruz ( Şekil 1) 13,14. Bu yöntemde uçucu [11C]CH3OTf (bp 100 °C) tek kullanımlık bir kartuşun reçiyonuna yatırılan 6-OH-BTA-0 öncülü üzerinden geçirilir. PET izleyici [11C]PiB daha sonra öncül ve radyoaktif kirleri biyouyumlu sulu etanol ile kartuştan elüsyonu ile ayrılır. Ayrıca uzaktan kumandalı radyokimya sentez modülü ve tek kullanımlık kaset kitleri kullanarak [11C]PiB radyosentez yöntemini otomatik hale aldık. Özellikle, standart 20 mL tek kullanımlık plastik şırınga, gaz akış denetleyicisi, vakum pompası ve göstergesi uygun şırınga sürücü (dispenser) ile donatılmış 20-valf radyokimya modülü, bu radyosentez icra. Bu yöntemin basitliği nedeniyle, kaset bazlı veya sabit vanalarla donatılmış en ticari olarak kullanılabilen otomatik synthesizer'lara değiştirilebileceğinden eminiz. Bu katı faz destekli teknik [11C]PiB üretim Iyi Üretim Uygulama (GMP) düzenlemeleri ile uyumlu kolaylaştırır ve sentez güvenilirliğini artırır. Burada açıklanan teknik aynı zamanda radyosentez için gerekli öncül miktarını azaltır, sadece "yeşil" biyouyumlu çözücüler kullanır ve ardışık üretim toplu iş arasındaki süreyi azaltır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Tampon ve eluentlerin hazırlanması

  1. 0,2 M sodyum asetat çözeltisi (Çözelti A) hazırlamak için 100 mL suda 2,72 g sodyum asetat trihidrat çözün.
  2. 0,2 M asetik asit çözeltisi (çözelti B) hazırlamak için 1 L suda 11,4 mL buzul asetik asit çözün.
  3. 50 mL çözeltisi A çözeltisini 450 mL b çözeltisi ile birleştirerek pH 3.7'deki asetat tamponu (tampon 1) tampon referans merkezine göre15. Arabelleğe ait pH'ı pH şeritleri veya pH ölçer ile doğrulayın.
  4. 12,5 mL mutlak etanol ile 87,5 mL tampon 1'i birleştirerek 100 mL'lik bir şişede %12,5 sulu EtOH çözeltisi (yıkama 1) yapın.
  5. 100 mL'lik bir şişede %15 sulu EtOH çözeltisi (yıkama 2) yapmak için 15 mL mutlak etanol ile 85 mL tampon 1'i birleştirin.
  6. 5 mL mutlak etanol ile 5 mL tampon 1'i birleştirerek %50 sulu EtOH çözeltisi (son eluent) yapın ve bu çözeltinin 2,5 mL'ini 10 mL şırıngaya çekin.

2. Kartuşa öncül uygulaması

  1. 10 mL su ve ardından 5 mL aseton ile tC18 kartuşu ile ön koşullandırmayı geçirin.
  2. Kartuşu 50 mL/dk azot akışı ile 1 dk kurulayın.
  3. Susuz asetonun 1 mL'sinde 6-OH-BTA-0 öncülünden 2 mg çözün.
  4. Luer uçlu 250 μL hassas cam şırıngAyı aşağı doğru tutarak, öncül çözeltinin 100 μL'sini ve sıvının üzerine 50°L hava yastığı çekin. İğneyi çıkarın ve tC18 kartuşu üzerindeki öncül çözeltiyi yavaşça aşağı doğru iterek dişi uçtan uygulayın. Çözümü daha fazla zorlamayın!

3. Otomatik sentez için manifoldun ayarlanması

  1. Sentez modülündeki standart 5 portlu tek kullanımlık manifoldu sabitleyin ve aşağıdaki Şekil 2 ve 3.2 - 3.5 adımlarına göre monte edin.
    NOT: Aseton dirençli manifoldu kullanmanızı öneririz (bkz. Malzeme Tablosu).
  2. Port 1'in iki pozisyonu vardır. Yatay girişi 20 mL şırınga ile donatılmış otomatik dağıtıcıya bağlayın. Dikey girişi yıkama 1 ile şişeye bağlayın.
  3. [11C]CH3OTf üreten modülün çıkışını manifoldun 2 noktasına bağlayın.
  4. Öncül 6-OH-BTA-0 ile yüklenen tC18 kartuşunu 3 ve 4 bağlantı noktaları arasına tC18 kartuşu takın.
  5. Port 5'in iki pozisyonu var. Yatay prizi en az 200 mL tutması gereken atık şişesine bağlayın. Dikey çıkışı steril filtre aracılığıyla izleyici koleksiyonu için steril şişeye bağlayın.

4. Radyosentez [11C]PiB

DİkKAT: Radyoaktif izotopları içeren tüm manipülasyonlar, radyoaktif maddelerle çalışmak için yeterli eğitime sahip personel tarafından kurşun korumalı sıcak hücrede yapılmalıdır.
NOT: Bu protokol siklotrondaki [11C]CO2'nin üretim detaylarını ve radyokimya modülünü kullanarak [11C]CH3OTf'ye dönüştürülmesini kapsamaz. Bu prosedürler radyokimya laboratuvarının bireysel donanımına bağlıdır ve bu protokolün kapsamı dışındadır. PET merkezimiz, gazda N2/O2 gaz karışımı (99.5:0.5) ile 14N(p,α)11C nükleer reaksiyonyoluyla [11C]CO2kimyasal formunda karbon-11 üreten bir IBA siklotron ile donatılmıştır. [11C]CH3I'nin "kuru yöntem" (katalitik redüksiyon [11C]CH4'e indirgenmesi ve ardından radikal iyot) üretimi için ticari olarak kullanılabilen bir modüldür. [11C] CH3OTf, [11C]CH3I'in 20 mL/dk'da 175 °C'ye ısıtılan gümüş bir triflate sütun üzerinde geçirilmesiyle üretilir.

  1. [11C]CH3OTf'yi bağlantı noktası 2'den manifolda teslim edin ve[11C]CH3OTf modülü tarafından düzenlenen 20 mL/dk çıkış akışında yüklü tC18 kartuşu ile 3 ve 4 bağlantı noktaları üzerinden ve atık şişesine Şekil 2A.
  2. Tüm radyoaktivite aktarıldıktan ve tC18 kartuşu üzerinde, kartuş tutucunun arkasındaki radyoaktivite dedektörü tarafından izlendiği şekilde sıkıştıktan sonra, 2 numaralı bağlantı noktasını kapatarak gaz akışını durdurun. Kartuş reaksiyonu tamamlamak için 2 dakika oturalım.
  3. Şekil 2B'degösterildiği gibi 100 mL'lik şişeden 100 mL'lik dispenser şırıngasından 100 mL/dk'lık bağlantı noktasından 19 mL yıkama 1 çözeltisini (bkz. adım 1.4) çekin.
  4. 18,5 mL yıkama 1 çözeltisini dispenserden tC18 kartuşu ile 3 ve 4 bağlantı noktaları üzerinden ve 50mL/dk'da şekil 2C'degösterildiği gibi atık şişesine dağıtın. Ayırma verimliliğini azaltabileceğinden manifoldda hava kabarcıklarının olmamasını sağlayın.
  5. Her seferinde 18,5 mL yıkama 1 çözeltisini geri çekerek ve dağıtarak 4,3 ve 4,4 adımlarını dört kez tekrarlayın. TC18'den geçen yıkama 1 çözeltisinin toplam hacmi 92,5 mL'dir; ancak kullanılan sentez modülüne bağlı olarak 90 - 100 mL aralığında değişiklik gösterebilir.
  6. 1. bağlantı noktasındaki giriş çizgisini yıkama 1'den 2 çözeltisini yıkamaya çevirin (bkz. adım 1.5).
  7. Her seferinde 4,3 ve 4,4 adımlarını üç kez tekrarlayın, 18,5 mL yıkama 2 çözeltisini geri çekin ve dağıtın. TC18'den geçen yıkama 2 çözeltisinin toplam hacmi 55,5 mL'dir. Ancak, kullanılan sentez modülüne bağlı olarak 50 - 60 mL aralığında değişiklik gösterebilir.
  8. Şekil 2D'degösterildiği gibi valf 5'i son şişeye doğru titretin. Hattı dispenserden kesinolarak kesinlenin ve son elüent çözeltisinin 2,5 mL'ini içeren 10 mL şırıngaya bağlayın (%50 sulu EtOH, bkz. adım 1.6) ve 7.5 mL hava.
  9. Şırıngayı aşağı doğru tutarak, son elüent çözeltisini (2,5 mL) ve ardından havayı (7,5 mL) tC18 kartuşu üzerinden 3 ve 4 bağlantı noktaları üzerinden ve Şekil'de gösterildiği gibi steril filtre ile izleme için steril şişeye doğru manuel olarak itin 2D.
  10. Boş şırıngayı kesin, steril fosfat tamponunun 10 mL'ini içeren 10 mL şırınga (tarif değişebilir) bağlayın ve tC18 kartuşunun tamamını yukarıda açıklandığı gibi steril şişeye doğru itin (Şekil 2D ). Şırıngayı kesin ve aynı şırıngayı kullanarak hattı 10 mL hava ile temizle.
  11. Son izleme formülasyonunun 0,7 mL'sini çekin ve kalite kontrol prosedürleri (0,1 mL), bakteriyel endotoksin testi (0,1 mL) ve sterilite (0,5 mL) için numune toplayın.

5. Kalite kontrol prosedürleri

DİkKAT: Radyotracer'ın her bir grubu, insan veya hayvan deneklere uygulanması için PET görüntüleme alanına sverilmeden önce uygun kalite kontrol prosedürlerine (QC) tabi tutulmalıdır. Bu makalenin yazarları, diğer merkezlerde üretilen radyotracer'in yerel sağlık otoritesi yönetmeliklerine uygunluğundan sorumlu değildir.

  1. Radyokimyasal kimlik (RCI), radyokimyasal saflık (RCP), izleyicinin kimyasal saflık ve azı aktivitesi ile formülasyonun artık çözücü içeriği ve pH'ı için testler içermesi gereken ön sürüm QC prosedürlerini gerçekleştirin.
  2. UV (350 nm izleme) ve radyoaktivite dedektörleri ile ters fazlı kolon ile donatılmış analitik HPLC sistemi ile RCI, RCP, kimyasal saflık ve azı dakika aktivitesini belirleyin. 6-OH-BTA-0 ve 6-OH-BTA-1'in bekletme sürelerini belirleyin ve cihazı her bileşiğin içeriğini ölçmek için kalibre edin.
  3. Kapiller kolon ile donatılmış analitik gaz kromatografi sistemi ile artık çözücü içeriğini belirleyin. Aseton ve etanoltutma sürelerini belirleyin ve her çözücünün içeriğini ölçmek için cihazı kalibre edin.
  4. Uygun kartuşlarla donatılmış bir kartuş okuyucu kullanarak bakteriyel endotoksinler testini gerçekleştirin.
  5. Bakteri üremesinin olmamasını sağlamak veya sterilite örneğini yerel sağlık otoritesi tarafından akredite edilmiş bir laboratuvara göndermek için sentezden en az 14 gün sonra numunenin sterilite analizini yapın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

[11C]PiB'nin tipik bir radyosentezini özetlemek gerekirse, gaz [11C]CH3OTf ilk olarak öncül çözeltisi ile önceden yüklenmiş bir tC18 kartuşu ile geçirilir (Şekil 1). Reaksiyon karışımının ayrılması, sulu etanol çözeltileri ile art arda elüsasyon ile aşağıdaki gibi elde edilir. İlk olarak, %12.5 EtOH tepkiverilmemiş[11C]CH3OTf ve 6-OH-BTA-0'ın çoğunluğunu temizler, sonra %15 EtOH artık kirleri yıkar ve son olarak %50 etanol çözeltisi istenileni[11C] PiB'yi steril bir şişeye dönüştürür. Daha sonra izleyici steril fosfat tamponu ile seyreltilir ve PET görüntüleme sitesine salmadan önce sıkı QC prosedürlerinden geçer. [11C]PiB toplu işleme uygun tipik analitik HPLC UV ve radyoaktivite kromatogramları Şekil 3'tetemsil edilmektedir.

Toplam radyosentez süresi [11C]CH3OTf' nin tesliminden başlayarak 10 dakikadır, [11C]PiB'nin 0,2 mg prekürsör kullanarak RCY'si %22 'dir ([11C]CH3OTf'den başlayarak bozunma için düzeltilmemiştir) ve azı azı aktivitesi 190 GBq/μmol. Tracer klinik çalışmalar için çok merkezli Dominantly Kalıtsal Alzheimer Ağ Denemeler Birimi (DIAN-TU) tüm QC özellikleri ile uyumlu olmalıdır: radyokimyasal saflık% 95 üzerinde olmalıdır; radyoaktif olmayan yabancı maddeler içeriği 10 mL doz başına 1,3 μg'nin altında olmalıdır; pH 4 - 8 aralığında olmalıdır; ve etanol ve aseton içeriği sırasıyla% 10 ve 3000 ppm altında olmalıdır. Örnekler de steril ve endotoksin içermez. Dört tipik radyosentez koşusunun sonuçları Tablo 1'deözetlenmiştir.

Bildirilen tekniğin düzgün çalışması için, yukarıda açıklanan birkaç kritik adımda dikkatli olunmalıdır. [11C]PiB'nin reaksiyona girmeyen başlangıç malzemelerinden ve olası yan ürünlerden ayrılması için etkili yolu kısaltmamak için, tC18 kartuşu (adım 2.4) öncüluygulama uygulayın. [11C]CH3OTf'nin aktarım sırasında bir kartuş üzerinden akışı 20 mL/dk'yı geçmemelidir (adım 4.1). Elütion başladıktan sonra (adım 4.4), kartuşun ıslak tutulması ve atıktaki[11C]PiB'nin kayıpları nedeniyle izleyicinin veya daha düşük RCY'nin saflığına neden olabilecek kanalize edici etkilerden kaçınmak için havanın geçmesine izin vermemek çok önemlidir. Radyosentezde kullanılan 5 portlu manifold (adım 3.1) ACC-101 gibi standart polikarbonat manifoldu gibi aseton dirençli değilse, daha büyük hacimler aktivite transferi sırasında manifolda zarar verebileceğinden aseton miktarı 100°L'yi geçmemelidir ve sentezin başarısız lığa yol açacak. pH'ın teknik özelliklere uygun olmaması durumunda, tC18 kartuşu isteğe bağlı olarak atık şişesine 4,7 ile 4,8 arasında 10 mL steril su ile durulanabilir.

Figure 1
Şekil 1: [11C]PiB'nin radyosentezi 11C-metilasyon 6-OH-BTA-0 öncül ile [11C]CH3OTf. [11C]PiB ilişkili amiloid plakların görüntülenmesinde en yaygın olarak kullanılan radyoizleyicilerden biridir. PET tarafından AD ve diğer nörodejeneratif koşullar ile. Bu izleyici genellikle 6-OH-BTA-0 olarak adlandırılan anilin öncülünün 11C-metilasyonu ile sentezlenir ve[11C]metil triflate ([11C]CH3OTf) çözelti içinde veya kuru HPLC enjeksiyon döngüsünde (çözücü solvent) tutsak tekniği). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: TC18 kartuşunda[11C]PiB'nin adım adım sentezi ve saflaştırılması. (A) Gaz [11C]CH3OTf 6-OH-BTA-0 yüklü kartuştan geçirilir. 4.1 ve 4.2 adımlarında açıklandığı gibi, [11C]CH3OTf öncül içeren kartuşüzerinde sıkışıp kalır ve 2 dakika oda sıcaklığında öncül ile reaksiyona girer. (B) Yıkama 1 veya yıkama 2 çözeltisi dispenser şırıngasına çekilir. Adım 4.3'te açıklandığı gibi, modülün şırınga pompası kırpılmış şırınganın pistonunu yukarı doğru çeker ve manifoldun 1. (C) Kirler bir atık şişesine yıkanır. 4.4 adımda açıklandığı gibi, modülün şırınga pompası kırpılmış şırınganın pistonlu kısmını aşağıya doğru hareket ettirir ve geri çekilen yıkama çözeltisini 1, 3 ve 4 bağlantı noktaları üzerinden tC18 kartuşu üzerinden bir atık şişesine doğru iter. B ve C diyagramlarında temsil edilen adımlar, 4,5 - 4,7 adımlarında açıklandığı gibi, kartuşutaki tepkisiz tüm maddeleri temizlemek için birkaç kez bir döngü içinde tekrarlanır. (D) [11C]PiB steril bir filtre ile steril bir şişe içine son eluent ile eluted. 4.8 ve 4.9 adımlarında açıklandığı gibi, şırınga pompasına kırpılan şırınga çizgiden kesilir ve ilk olarak %50 sulu etanol2,5 mL içeren 10 mL'lik bir şırınga ile değiştirilir. Manifoldun Port 5'i steril şişeye doğru dalgalanır ve [11C]PiB tC18'den elle çıkar. Boş şırınga daha sonra 10 mL steril fosfat tamponu içeren başka bir şırınga ile değiştirilir ve tüm içerikler 4.10 adımda açıklandığı gibi çizgileri durulamak için tC18'den itilir. Steril şişe şimdi içerir [11C]PiB bir 12.5 mL 10% tamponlu sulu etanol çözeltisi. Bu rakam Boudjemeline ve ark.12'dendeğiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: [11C]PiB kalite kontrol analitik HPLC. (A) [11C]CH3OH'un tutma süreleri ([11C]CH3OTf'nin hidrolizinden), tepkisiz [11C]CH3OTf ve radyoaktivite kromatogramında[11C]PiB 2.1, 4.0 ve 6.6 dk, Sıra -sıyla. Radyoaktivite izlerinin analizi [11C]PiB'nin RCP'sinin %98.0 olduğunu göstermektedir. (B) UV kromatogramında 6-OH-BTA-0 (öncül) ve 6-OH-BTA-1 (izleyici pik) tutma süreleri sırasıyla 3,6 ve 5,9 dk'dır. UV izlerinin analizi, kabul edilebilir sınırın (1,3 μg) altında kalan öncül konsantrasyonu ve diğer radyoaktif olmayan yabancı maddelerin yokluğunu gösterir. Bu nedenle, izleyicinin radyokimyasal ve kimyasal saflığı klinik PET çalışmaları için kabul edilebilir. HPLC koşulları - kolon (Malzeme Tablosu): 5 μm, 100 x 4.0 mm; mobil faz: 40:60 asetonitril/su akış hızı: 0.7 mL/dk. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4: 6-OH-BTA-0 öncül miktarının optimizasyonu. En düşük miktar (0.1 mg) %18.1±3.8orta radyokimyasal verimde (RCY) [ 11 C]PiB sağlar. Radyosentez 0.2 mg 'dan başlayan [11C]PiB %22.0±3.1 rcy sağlarken, miktarı 0.3 mg'a çıkarmak, son üründeki öncül miktarı biraz daha yüksek bir oranda pahasına RCY'yi %32.1±3.7'ye yükseltiyor. TC18 kartuşu üzerinde sıkışmış [11C]CH3OTf radyoaktivitesinden başlayarak tüm RCY'ler çürüme (10 dk radyosentez süresi) için düzeltilmez. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 5
Şekil 5:[11C]ABP688 kalite kontrol analitik HPLC. (A) Radyoaktivite kromatogramı kombine RCP gösterir (E)- ve (Z)-[11C]ABP688% 98.1. (B) UV kromatogramı kalıntı öncül konsantrasyonu 10 μg'nin üzerinde gösterir. Kimyasal saflık klinik PET çalışmaları için kabul edilebilir olsa da, nispeten düşük etkili molar aktivitesi (Am < 37 GBq/μmol) daha fazla saflaştırma optimizasyonu gerektirir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Toplu iş Çalıştır 1 Çalıştır 2 Çalıştır 3 Koş 4
[11C] CH3OTf, GBq 9.21 11.25 7.84 6.44
[11C] PiB, GBq 2.26 2.37 2.11 1.41
RCY, %* 24.5 21.1 26.9 21.8
RCP, % 98 97.2 97.8 99.2
Molar aktivitesi, GBq/μmol 154.6 322.6 121.1 162.1
Artık öncül, μg 0.32 0.55 0.58 0.87
Ph 5 5 5 5
EtOH içeriği, % 9.4 8.8 7.7 8.1
Aseton içeriği, ppm 33 38 46 33
BET testi Yok <10 AB/mL <10 AB/mL <10 AB/mL
Sterilite testi Yok Büyüme Yok Büyüme Yok Büyüme Yok
* Dipnot: From [11C]CH3OTf, çürüme için düzeltilmemiş

Tablo 1. [11C]PiB üretiminin temsili sonuçları optimize edilmiş koşullar altında çalışır. Tüm toplu çalışmalar, klinik PET çalışmaları için tasarlanmış izleyiciler için gerekliliklere uygundur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Florbetapir, florbetaben ve flütmetamol gibi birkaç 18F etiketli PET izleyicilerin fda onayı ve son ortaya çıkmasına rağmen, [11C]PiB hızlı beyin alımı ve düşük non-spesifik nedeniyle amiloid görüntüleme için altın standart izleyici kalır Bağlama. Şu anda bu izleyici ya ıslak kimya16 yoluyla sentezlenir veya bir "kuru döngü" yaklaşım4,17. Her iki yöntem de HPLC arınmasını ve ardından[11C]CH3OTf'den başlayarak yaklaşık 20 - 30 dakika süren sulu etanolte rekonsültasyon gerektirir. [11C] PiB'nin 11C-metilasyon tekniği ve klinik önemi ile desteklenen solid faz ile ilgili önceki raporlardan esinlenerek, ucuz tek kullanımlık katı faz ekstraksiyonu kullanarak bu izleyicinin radyosentezini geliştirmeyi amaçladık ( SPE) reaksiyon, saflaştırma ve formülasyon için bir "3-in-1" varlık olarak kartuşları.

İnsan deneklerde in vivo görüntüleme için PET izleyicilerin başarılı üretimi için en kritik adımlar şunlardır: 1) radyoaktif izotopun bir izleyici molekülüne dahil edilmesi; 2) reaksiyona yanmamış radyoaktif ve radyoaktif olmayan türlerden izleyicinin ayrılması; 3) biyolojik uyumlu bir çözücü de izleyici remodülasyonu; 4) kalite kontrol prosedürleri ile uyum. Daha önce bildirilen solvent tutsak yöntemine dayanarak, SPE destekli tekniğin çözeltide 11C-metilasyona kıyasla daha düşük bir öncül gerektireceğini bekliyorduk. Özellikle, radyosentez için daha önce bildirilen çözücü esir prosedürleri [11C]PiB öncül 0.5 gerektirir - 1.0 öncülmg 4,17. Bu nedenle [11C]Ch 3 OTf'nin [11C]CH3OTf'den başlayarak 6-OH-BTA-0: 0.1, 0.2 ve 0.3 mg'lık üç farklı miktarda ki bozunma radyokimyasal verimleri için düzeltilmedik. Hatta en düşük miktarda (0.1 mg) nispeten düşük ve daha az güvenilir RCY (%18.1±3.8) olsa da, [11C]PiB orta miktarda sağlar. Radyosentez 0.2 mg başlayan [11C]PiB (%22.0±3.1) bir RCY sağlarken, miktarı daha da artırırken RCY artırır (32.1±3.7%), nihai üründe öncül biraz daha yüksek bir miktar pahasına. Her durumda radyosentez 10 dk içinde tamamlanmıştır. Bu nedenle, optimum öncül miktarı belirli PET merkezlerinde [11C] PiB'nin istenilen RCY ve saflığına bağlıdır. Öncül miktarına göre yapılan radyokimyasal verim optimizasyonu deneylerinin sonuçları Şekil 4'teözetlenmiştir. Özellikle [11C]CH3I'yi metilasyon maddesi veya etanol olarak reaksiyon çözücü olarak kullanan radyosentez girişimleri istenilen[11C]PiB'yi (veri gösterilmedi) vermedi.

Radyosentez reaksiyon karışımının kısa bir SPE kartuş üzerinde kantitatif olarak ayrılması, tanımlanan tekniğin en zorlu kısmıydı. Aromatik aminlerin 6-OH-BTA-0 ve 6-OH-BTA-1'in ağırlıklı olarak asidik ortamda protonlanmış formlarında bulunduğunu ve bu nedenle ters faz katı fazdan daha keskin elüsyon profillerine sahip olacağını varsaydık. Bu nedenle, tüm sulu etanol çözeltileri pH 3.7'de 0.2 M asetat tamponu kullanılarak hazırlanmıştır. Daha sonra, EtOH konsantrasyonu %15'e varan sulu etanol çözeltilerinin tepkisiz öncül 6-OH-BTA-0 ve [11C]CH3OTf'yi yavaş yavaş aşındırdığını, radyoetiketli[11C]PiB'nin ise tC18 kartuşuna sıkıştığını belirledik. Bu yabancı maddelerin son bir izleyici formülasyonuna dönüşmesini önlemek için etanol konsantrasyonu bir degrade elüsyonunda %12,5'ten %15'e yükseltildi. Tüm kirler kartuştan yıkandıktan sonra, en az miktarda (2,5 mL) konsantre etanol çözeltisi (%50) kullanılarak iz leyici elüsyonu elde edildi. Etanol içeriğini %10 sınırının altında tutmak ve formüle edilmiş izleyicinin pH'ını insan enjeksiyonu için kabul edilebilir aralıkta (4 - 8) getirmek için, izleyici steril fosfat tamponu ile seyreltilmiştir.

[11C]PiB'nin radyosentezi, dağıtıcı şırınga ve tek kullanımlık manifoldu ile donatılmış, ticari olarak kullanılabilen otomatik sentez ünitesi (ASU) kullanılarak otomatikleştirilmiştir. Bu özel ASU için manifoldu kurulum adımları 3.1 açıklandığı gibi basittir - 3.5. Özellikle, bu metodoloji kolayca yukarıda açıklanan tarifleri aşağıdaki diğer mevcut ASU's çoğu uygulanabilir. Optimize edilmiş koşullarda klinik uygulamaya uygun [11C]PiB'nin gruplar, 1,4 ila 2,4 GBq (38 - 61 mCi) arasında değişen son aktivitelerle sentezlenir.

Daha yakın zamanda, biz radyoetiketleme için "3-in-1" tekniği uygulanan [11C]ABP688, metabotropik glutamat reseptörlerinin görüntüleme için bir PET izleyici tip 5 (mGlu5)18,19. Bu izleyicinin radyosentezi oksimdeki -OH grubunun 11C-metilasyonuna dayanır; bu nedenle, desmetil öncül deprotonate baz eklenmesi gereklidir. Tetrabutylammonium hidroksit (MeOH'da 1 M çözelti olarak) çoğu kutuporganik çözücüde çözünebildiği için baz olarak seçilmiştir. Bir ön radyoetiketleme deneyinde, DMSO'da (100 μL) öncül (0,5 mg) bir çözelti MeOH'da (20 μL) 1 M TBAOH ile karıştırıldı ve karışım yukarıda açıklandığı gibi tC18 kartuşu üzerine dikkatlice uygulandı (bkz. adım 2.4). Gaz [11C]CH34.1 - 4.2 adlarında açıklandığı gibi kartuştan geçirildi ve reaksiyonun oda sıcaklığında 5 dk. Seyreltik etanol çözeltileri ile 0,2 M sodyum bikarbonat tampon (pH 8,5 - 9.0) - 92 mL %15 EtOH ve %20 EtOH 92 mL - tepkisiz [11C]CH3I ve artık öncül. Radyokimyasal olarak saf [11C]ABP688 (RCY = %18,2, RCP >98,0%) daha sonra 4.9 - 4.11 adımlarında açıklandığı gibi steril bir filtre ile aynı tampon% 50 EtOH çözeltisi ile eluted oldu. Öncüllerin %98'inden fazlası seyreltik etanol yıkama ile çıkarılmış olmasına rağmen, son izleyicide (20°G'ye kadar) tepkisiz bir öncünün varlığı radyosentez prosedürünün daha fazla optimizasyonunu gerektirir. Bu optimizasyon devam etmektedir ve bu projenin sonuçları zamanında yayınlanacaktır. [11C]ABP688 toplu temsili analitik HPLC UV ve radyoaktivite kromatogramları Şekil 5'tegösterilmiştir.

Sonuç olarak, klinik için kullanılan PET izleyicilerinin radyosentez, saflaştırma ve formülasyonu için "3'ü 1 arada" varlıklar olarak hazır bulunan ucuz SPE kartuşları kullanarak etkin bir katı faz destekli karbon-11 radyoetiketleme prosedürü geliştirdik. Görüntüleme. İnsan enjeksiyonuna uygun izleme ler 11C-metilasyon maddesi ([11C]CH3OTf veya [11C]CH3I) yüksek RCY ve molar aktivitesinden başlayarak 10 dakika içinde üretilir. Bu tekniği, sağlık ve radyasyon güvenliği otoriteleri tarafından uygulanan İyi Üretim Uygulamaları (GMP) yönetmeliklerine uygun hale getirmek için tam otomatikhale getirmiştik. Katı faz destekli radyosentez, düşük miktarda öncül gerektirir, toksik çözücülerin kullanımını önler, personel tarafından sürdürülen sentez süresini ve radyasyon dozunu azaltır. Ayrıca, HPLC ile ilgili arızaların önlenmesi radyosentez güvenilirliğini artırır ve rutin izleyici üretimi için tek kullanımlık kitlerin geliştirilmesine olanak sağlar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları olduğunu beyan.

Acknowledgments

Bu çalışma kısmen Bir hibe 18-05 Kanada Alzheimer Derneği (A. K. için) ve Beyin Kanada Vakfı Sağlık Kanada desteği ile desteklenmiştir. Yazarlar Bu çalışmanın desteklenmesi için McGill Üniversitesi Tıp Fakültesi, Montreal Nöroloji enstitüsü ve McConnell Beyin Görüntüleme Merkezi'ni kabul etmek isterler. Ayrıca kalite kontrol prosedürleri ve Dr Jean-Paul Soucy ve Gassan Massarweh radyoizotoplar ve radyokimya tesisi erişim için yardım için Bayan Monica Lacatus-Samoila teşekkür ederiz.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6-OH-BTA-0 ABX advanced biochemical compounds 5101 Non-radioactive precursor of [11C]PiB
6-OH-BTA-1 ABX advanced biochemical compounds 5140 Non-radioactive standard of [11C]PiB
Agilent 1200 HPLC system Agilent Agilent 1200 Analytical HPLC system
Ethanol absolute Commercial alcohols 432526
Hamilton syringe (luer-tip, 250 µL) Hamilton HAM80701
MZ Analytical PerfectSil 120 MZ-Analysentechik GmbH MZ1440-100040 Analytical HPLC column
Perkin Elmer Clarus 480 GC system Perkin Elmer Clarus 480 Gas chromotograph
polycarbonate manifold Scintomics ACC-101 Synthesis manifold
Restek MTX-Wax column (30 m, 0.53 mm) Restek 70625-273 Analytical GC column
Scintomics GRP module Scintomics Scintomics GRP Automated synthesis unit
Sep-Pak tC18 Plus Waters WAT020515 Solid phase extraction cartridge
solvent-resistant manifold Scintomics ACC-201 Synthesis manifold
Spinal needle BD 405181
Sterile extension line B. Braun 8255059
Sterile filter Millipore SLLG013SL
Sterile vial (20mL) Huayi SVV-20A
Sterile water Baxter JF7623
Synthra MeIplus Research Synthra MeIplus Research [11C]CH3I/[11C]CH3OTf module
Syringe (10 mL) BD 309604
Syringe (1mL) BD 309659
Syringe (20 mL) B. Braun 4617207V Dispenser syringe
Vent filter Millipore TEFG02525

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Langstrom, B., Lundqvist, H. The preparation of 11C-methyl iodide and its use in the synthesis of 11C-methyl-L-methionine. The International journal of applied radiation and isotopes. 27 (7), 357-363 (1976).
  2. Larsen, P., Ulin, J., Dahlstrøm, K., Jensen, M. Synthesis of [11C]iodomethane by iodination of [11C]methane. Applied radiation and isotopes. 48 (2), 153-157 (1997).
  3. Jewett, D. M. A simple synthesis of [11C]methyl triflate. International journal of radiation applications and instrumentation. Part A, Applied radiation and isotopes. 43 (11), 1383-1385 (1992).
  4. Wilson, A. A., Garcia, A., Houle, S., Vasdev, N. Utility of commercial radiosynthetic modules in captive solvent [11C]-methylation reactions. Journal of Labelled Compounds and Radiopharmaceuticals. 52 (11), 490-492 (2009).
  5. Wilson, A. A., Garcia, A., Jin, L., Houle, S. Radiotracer synthesis from [(11)C]-iodomethane: a remarkably simple captive solvent method. Nuclear medicine and biology. 27 (6), 529-532 (2000).
  6. Fedorova, O. S., Vaitekhovich, F. P., Krasikova, R. N. Automated Synthesis of [18F]Fluoromethylcholine for Positron-Emission Tomography Imaging. Pharmaceutical Chemistry Journal. 52 (8), 730-734 (2018).
  7. Jewett, D. M., Ehrenkaufer, R. L., Ram, S. A captive solvent method for rapid radiosynthesis: application to the synthesis of [1-(11)C]palmitic acid. The International journal of applied radiation and isotopes. 36 (8), 672-674 (1985).
  8. Watkins, G. L., Jewett, D. M., Mulholland, G. K., Kilbourn, M. R., Toorongian, S. A. A captive solvent method for rapid N-[11C]methylation of secondary amides: application to the benzodiazepine, 4'-chlorodiazepam (RO5-4864). International journal of radiation applications and instrumentation. Part A, Applied radiation and isotopes. 39 (5), 441-444 (1988).
  9. Hockley, B. G., Henderson, B., Shao, X. Chapter 27, Synthesis of {11C]Raclopride. Radiochemical Syntheses. , John Wiley & Sons. 167-175 (2012).
  10. Lodi, F., et al. Reliability and reproducibility of N-[11C]methyl-choline and L-(S-methyl-[11C])methionine solid-phase synthesis: a useful and suitable method in clinical practice. Nuclear Medicine Communications. 29 (8), 736-740 (2008).
  11. Jolly, D., et al. Development of "[(11)C]kits" for a fast, efficient and reliable production of carbon-11 labeled radiopharmaceuticals for Positron Emission Tomography. Applied radiation and isotopes. 121, 76-81 (2017).
  12. Boudjemeline, M., et al. Highly efficient solid phase supported radiosynthesis of [(11) C]PiB using tC18 cartridge as a "3-in-1" production entity. Journal of Labelled Compounds and Radiopharmaceuticals. 60 (14), 632-638 (2017).
  13. Mathis, C. A., et al. A lipophilic thioflavin-T derivative for positron emission tomography (PET) imaging of amyloid in brain. Bioorganic and medicinal chemistry letters. 12 (3), 295-298 (2002).
  14. Mathis, C. A., et al. Synthesis and evaluation of 11C-labeled 6-substituted 2-arylbenzothiazoles as amyloid imaging agents. Journal of medicinal chemistry. 46 (13), 2740-2754 (2003).
  15. Buffer Reference Center. , Sigma Aldrich. Available from: https://www.sigmaaldrich.com/life-science/core-bioreagents/biological-buffers/learning-center/buffer-reference-center.html (2019).
  16. Philippe, C., Mitterhauser, M., Wadsak, W. Chapter 18, Synthesis of 2-(4-N-[11C]Methylaminophenyl)-6-Hydroxybenzothiazole ([11C]6-OH-BTA-1; [11C]PIB). Radiochemical Syntheses. , John Wiley & Sons. 177-189 (2012).
  17. Shao, X., Fawaz, M. V., Jang, K., Scott, P. J. H. Synthesis and Applications of [11C]Hydrogen Cyanide. Radiochemical Syntheses. , John Wiley & Sons. 207-232 (2015).
  18. Ametamey, S. M., et al. Radiosynthesis and preclinical evaluation of 11C-ABP688 as a probe for imaging the metabotropic glutamate receptor subtype 5. Journal of Nuclear Medicine. 47 (4), 698-705 (2006).
  19. Ametamey, S. M., et al. Human PET studies of metabotropic glutamate receptor subtype 5 with 11C-ABP688. Journal of Nuclear Medicine. 48 (2), 247-252 (2007).

Tags

Kimya Sayı 152 karbon-11 radyoetiketleme pozitron emisyon tomografisi görüntüleme [11C]PiB [11C]ABP688 11C-metilasyon katı faz destekli sentez katı faz ekstraksiyonu otomasyon
Pet İzleyicilerin Üretimi için Katı Faz <sup>11</sup>C-Metilasyon, Arıtma ve Formülasyon
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Singleton, T. A., Boudjemeline, M.,… More

Singleton, T. A., Boudjemeline, M., Hopewell, R., Jolly, D., Bdair, H., Kostikov, A. Solid Phase 11C-Methylation, Purification and Formulation for the Production of PET Tracers. J. Vis. Exp. (152), e60237, doi:10.3791/60237 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter