Summary
We rapporteren een efficiënte Carbon-11 radiolabeling-techniek om klinisch relevante tracers te produceren voor positron emissie tomografie (PET) met behulp van Solid phase-extractie cartridges. 11 C-methylating agent wordt doorgegeven via een patroon vooraf geladen met precursor en opeenvolgende elutie met waterige ethanol biedt chemisch en radiochemisch zuivere PET tracers in hoge radiochemische opbrengsten.
Abstract
Routine matige productie van radiotracers gebruikt in positron emissie tomografie (PET) meestal vertrouwt op natte chemie waar de radioactieve synthon reageert met een niet-radioactieve precursor in oplossing. Deze aanpak vereist zuivering van de Tracer door hogedrukvloeistofchromatografie (HPLC), gevolgd door herformulering in een biocompatibel oplosmiddel voor menselijke toediening. We hebben onlangs een roman ontwikkeld 11C-Methylation aanpak voor de zeer efficiënte synthese van koolstof-11 GELABELDE huisdier radiofarmaca, gebruik te maken van Solid phase cartridges als wegwerp "3-in-1" eenheden voor de synthese, zuivering en herformulering van de tracers. Deze aanpak voorkomt het gebruik van preparatieve HPLC en vermindert de verliezen van de Tracer in Transfer lijnen en als gevolg van radioactief verval. Bovendien verbetert de cartridge-gebaseerde techniek de betrouwbaarheid van de synthese, vereenvoudigt het automatiseringsproces en vergemakkelijkt het de naleving van de Good Manufacturing Practices (GMP) vereisten. Hier demonstreren we deze techniek op het voorbeeld van de productie van een PET Tracer Pittsburgh compound B ([11C] PIB), een gouden standaard in vivo imaging agent voor amyloïde plaques in de menselijke hersenen.
Introduction
Positron emissie tomografie (PET) is een moleculaire beeldvormings modaliteit die berust op het opsporen van het radioactieve verval van een isotoop die is gekoppeld aan een biologisch actief molecuul om de in vivo visualisatie van biochemische processen, signalen en transformaties mogelijk te maken . Koolstof-11 (t1/2 = 20,3 min) is een van de meest gebruikte radio-isotopen in pet vanwege zijn overvloed aan organische moleculen en korte halfwaardetijd die meerdere Tracer administraties op dezelfde dag mogelijk maakt met hetzelfde menselijke of dierlijke onderwerp en vermindert de Stralingsbelasting van de patiënten. Veel tracers gelabeld met deze isotoop worden gebruikt in klinische studies en in fundamenteel gezondheidsonderzoek voor in vivo PET-beeldvorming van klassieke en opkomende biologisch relevante doelen-[11c] Raclopride voor d2/d3 -receptoren, [11c] PiB voor amyloïde plaques, [11C] PBR28 voor trans Locator eiwit-om er maar een paar te noemen.
Koolstof-11 gelabelde PET tracers worden voornamelijk geproduceerd via 11C-methylatie van niet-radioactieve PRECURSOREN bevattende-Oh (alcohol, fenol en carbonzuur),-NH (amine en amide) of-sh (thiol) groepen. Kort, de isotoop wordt gegenereerd in de gasdoelstelling van een cyclotron via een 14N (p, α)11c nucleaire reactie in de chemische vorm van [11c] co2. Deze laatste wordt vervolgens omgezet in [11c] methyljodide ([11c] ch3I) via ofwel natte chemie (reductie tot [11c] ch3Oh met LiAlH4 gevolgd door afschrikken met Hi)1 of droog Scheikunde (katalytische reductie tot [11C] ch4 gevolgd door radicale iodinatie met moleculaire I2)2. [11C] CH3ik kan dan verder worden omgezet naar de meer reactieve 11c-methyl triflaat ([11c] ch3otf) door het over een zilveren triflaat kolom3. De 11C-Methylation wordt vervolgens uitgevoerd door ofwel het borrelen van het radioactieve gas in een oplossing van niet-radioactieve precursor in organisch oplosmiddel of via de meer elegante Captive solvent "lus" methode4,5. De 11C-Tracer wordt vervolgens gezuiverd door middel van HPLC, geherformuleerd in een biocompatibel oplosmiddel, en doorgegeven via een steriel filter voordat het aan menselijke proefpersonen wordt toegediend. Al deze manipulaties moeten snel en betrouwbaar zijn gezien de korte halfwaardetijd van Carbon-11. Het gebruik van een HPLC-systeem verhoogt echter aanzienlijk de verliezen van de Tracer en de productietijd, vereist vaak het gebruik van giftige oplosmiddelen, bemoeilijkt de automatisering en leidt af en toe tot mislukte syntheses. Bovendien verlengt de vereiste reiniging van de reactoren en de HPLC-kolom de vertragingen tussen de syntheses van volgende Tracer batches en verhoogt het de blootstelling van personeel aan straling.
De radiochemie van fluor-18 (t1/2 = 109,7 min), de andere veelgebruikte Pet-isotoop, is onlangs gevorderd via de ontwikkeling van cassette-gebaseerde Kits die de noodzaak voor HPLC-zuivering overbodig maken. Door gebruik te maken van Solid phase extraction (SPE) cartridges, bieden deze volledig wegwerp kits de betrouwbare routine productie van 18f-tracers, waaronder [18f] FDG, [18f] FMISO, [18f] FMC en anderen, met kortere synthese minder betrokkenheid van het personeel en minimaal onderhoud van de apparatuur. Een van de redenen waarom Carbon-11 nog steeds een minder populaire isotoop in PET Imaging is, is een gebrek aan soortgelijke Kits voor de routine productie van 11C-tracers. Hun ontwikkeling zou de synthetische betrouwbaarheid aanzienlijk verbeteren, de radiochemische opbrengsten verhogen en de automatisering en het preventieve onderhoud van de productie modules vereenvoudigen.
Momenteel beschikbare productie kits profiteren van goedkope, wegwerp-, SPE-cartridges in plaats van HPLC-kolommen voor de scheiding van de radio Tracer van niet-gereageerd radioactieve isotoop, precursor en andere radioactieve en niet-radioactieve bijproducten. Idealiter gaat de radiolabeling-reactie ook op dezelfde cartridge voort; bijvoorbeeld, de [18f] fluoromethylatie van Dimethylaminoethanol met gasvormige [18f] ch2BRF in de productie van prostaatkanker Imaging Pet Tracer [18f] fluoromethylcholine treedt op een kation-uitwisseling hars cartridge 6. hoewel soortgelijke procedures voor het radiolabeling van verschillende 11c-tracers op cartridges zijn gemeld7,8 en werd bijzonder krachtig voor de radio synthese van [11c] choline9 en [11C] methionine10, deze voorbeelden blijven beperkt tot oncologische Pet-tracers waar de scheiding van de precursor vaak niet nodig is. Onlangs rapporteerden we de ontwikkeling van "[11c] kits" voor de productie van[11c] ch3I11 en daaropvolgende 11c-methylatie, evenals een solide fase-ondersteunde synthese12 in onze inspanningen om Vereenvoudig de routine productie van 11C-tracers. Hier willen we onze vooruitgang demonstreren met behulp van het voorbeeld van de vaste fase ondersteunde radio synthese van [11C] PIB, een radio Tracer voor Aβ-beeldvorming die een revolutie teweeggebracht in het gebied van de ziekte van Alzheimer (AD) Imaging toen het voor het eerst werd ontwikkeld in 2003 ( Figuur 1) 13,14. Bij deze methode wordt vluchtige [11C] ch3otf (BP 100 °c) over 6-Oh-BTA-0-precursor afgezet op de hars van een wegwerp cartridge. PET Tracer [11C] PIB wordt vervolgens gescheiden van de precursor en radioactieve onzuiverheden door elutie uit de patroon met biocompatibele waterige ethanol. Verder hebben we deze methode van [11C] PIB radiosynthese geautomatiseerd met behulp van een op afstand bediende radiochemie synthese module en wegwerp cassette Kits. Specifiek, we implementeerden deze radio synthese op een 20-Valve radiochemie module, uitgerust met spuit aandrijving (dispenser) die geschikt is voor standaard 20 mL wegwerp plastic spuit, gasstroom controller, vacuümpomp en gauge. Vanwege de eenvoud van deze methode, zijn we ervan overtuigd dat het kan worden aangepast aan de meeste commercieel verkrijgbare geautomatiseerde synthesizers, ofwel cassette-based of die uitgerust met stationaire kleppen. Deze solide fase ondersteunde techniek vergemakkelijkt [11C] PIB productie voldoet aan goede Manufacturing Practice (GMP) regelgeving en verbetert de betrouwbaarheid van de synthese. De hier beschreven techniek vermindert ook de hoeveelheid precursor die nodig is voor radio synthese, gebruikt alleen "groene" biocompatibele oplosmiddelen en verlaagt de tijd tussen opeenvolgende productie batches.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. voorbereiding van buffers en eluents
- Los 2,72 g natriumacetaattrihydraat op in 100 mL water om 0,2 M natriumacetaatoplossing (oplossing A) te bereiden.
- Los 11,4 mL ijsazijn in 1 liter water op om 0,2 M azijnzuur oplossing te bereiden (oplossing B).
- Combineer 50 mL oplossing A met 450 mL oplossing B om de acetaatbuffer voor te bereiden op pH 3,7 (buffer 1) volgens het buffer referentiecentrum15. Controleer de pH van de buffer met pH-strips of een pH-meter.
- Combineer 12,5 mL absolute ethanol met 87,5 mL buffer 1 om 12,5% waterige EtOH-oplossing (Wash 1) te maken in een 100 mL fles.
- Combineer 15 mL absolute ethanol met 85 mL buffer 1 om 15% waterige EtOH-oplossing (Wash 2) te maken in een fles van 100 mL.
- Combineer 5 mL absolute ethanol met 5 mL buffer 1 om 50% waterige EtOH oplossing (uiteindelijke eluent) te maken en trek 2,5 mL van deze oplossing in een 10 mL spuit.
2. toepassing van de voorloper op de patroon
- Laat 10 mL water passeren, gevolgd door 5 mL aceton door de tC18 patroon, om dit te voorkomen.
- Droog de patroon met een stroom van stikstof bij 50 mL/min gedurende 1 min.
- Los 2 mg van de precursor 6-OH-BTA-0 op in 1 mL watervrij aceton.
- Houd een Luer-Tip 250 μL precisie glazen spuit naar beneden, zuig 100 μL van de precursor oplossing en 50 μL luchtkussen bovenop de vloeistof. Verwijder de naald en breng de precursor oplossing op de tC18 cartridge aan vanaf het vrouwelijke uiteinde door de zuiger langzaam helemaal naar beneden te duwen. Duw de oplossing niet verder!
3. de variëteit instellen voor geautomatiseerde synthese
- Beveilig het standaard wegwerp spruitstuk van 5 poorten op de synthese module en monteer het volgens de Figuur 2 en de stappen 3,2-3,5 hieronder.
Opmerking: we raden aan om aceton bestendige variëteiten te gebruiken (Zie tabel met materialen). - Poort 1 heeft twee posities. Sluit de horizontale inlaat aan op de automatische dispenser met een spuit van 20 mL. Sluit de verticale inlaat aan op de fles met Wash 1.
- Verbind de uitgang van de module die [11C] ch3otf produceert naar poort 2 van de variëteit.
- Installeer de tC18 cartridge geladen met precursor 6-OH-BTA-0 tussen de poorten 3 en 4.
- Poort 5 heeft twee posities. Sluit het horizontale stopcontact aan op de afval fles die ten minste 200 mL moet vasthouden. Sluit de verticale uitlaatklep aan op de steriele injectieflacon voor Tracer inzameling via het steriele filter.
4. radio synthese van [11C] PIB
Let op: alle manipulaties met betrekking tot radioactieve isotopen moeten worden uitgevoerd in een door een lood afgeschermde Hot Cell door personeel met adequate training om te werken met radioactieve materialen.
Opmerking: dit protocol heeft geen betrekking op de details van de productie van [11c] co2 in de cyclotron en de omzetting ervan in [11c] ch3otf met behulp van de radiochemie module. Deze procedures zullen afhangen van de individuele uitrusting van het radiochemie laboratorium en vallen buiten het toepassingsgebied van dit protocol. Ons huisdieren centrum is uitgerust met een IBA cyclotron, die koolstof-11 produceert in de chemische vorm van [11c] co2via de 14N (p, α)11c kernreactie met een N2/o2 gasmengsel (99,5:0,5) in het gas doel en een in de handel verkrijgbare module voor de productie van [11c] ch3I via de "droge methode" (katalytische reductie tot [11C] ch4 , gevolgd door radicale iodinatie). [11C] CH3otf wordt geproduceerd door het passeren van [11C] l3I over een zilveren triflaat kolom verhit tot 175 ° c bij 20 ml/min.
- Lever [11c] ch3otf in de variëteit via poort 2 en geef deze door de geladen tC18 cartridge met een uitgangsstroom van 20 ml/min, gereguleerd door de [11c] ch3otf-module, via de poorten 3 en 4 en in de afval fles zoals weergegeven op Figuur 2A.
- Zodra alle radioactiviteit is overgebracht en gevangen op de tC18-cartridge, zoals bewaakt door de radioactiviteitsdetector achter de cartridge houder, stopt u de gasstroom door poort 2 te sluiten. Laat de patroon 2 minuten zitten om de reactie te voltooien.
- Trek 19 mL Wash 1-oplossing (zie stap 1,4) uit de flacon van 100 mL in de doseerspuit via poort 1 op 100 mL/min zoals afgebeeld op Figuur 2B.
- Verdeel 18,5 mL Wash 1-oplossing van de dispenser via de tC18-cartridge via de poorten 3 en 4 en in de afval fles van 50 ml/min, zoals afgebeeld op Figuur 2C. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen in de variëteit zijn, omdat ze de scheidingsefficiëntie kunnen verminderen.
- Herhaal de stappen 4,3 en 4,4 vier keer, waarbij u elke keer 18,5 mL Wash 1-oplossing intrekt en uittrekt. Het totale volume van Wash 1 oplossing doorgegeven via tC18 is 92,5 mL; echter, het kan variëren binnen de 90-100 mL bereik afhankelijk van de specifieke synthese module gebruikt.
- Zet de ingangs lijn op poort 1 van Wash 1 naar Wash 2 oplossing (zie stap 1,5).
- Herhaal de stappen 4,3 en 4,4 driemaal, waarbij u elke keer 18,5 mL Wash 2-oplossing intrekt en uittrekt. Het totale volume van Wash 2 oplossing doorgegeven via tC18 is 55,5 mL. Echter, het kan variëren binnen de 50-60 mL bereik afhankelijk van de specifieke synthese module gebruikt.
- Schakelklep 5 naar de laatste injectieflacon zoals afgebeeld op Figuur 2D. Koppel de lijn los van de dispenser en sluit deze aan op de spuit van 10 ml met 2,5 ml van de laatste eluens oplossing (50% waterige EtOH, zie stap 1,6) en 7,5 ml lucht.
- Houd de spuit naar beneden, duw handmatig de laatste eluens oplossing (2,5 ml), gevolgd door lucht (7,5 ml) via de tC18-patroon via de poorten 3 en 4 en in de steriele injectieflacon voor Tracer inzameling via het steriele filter, zoals afgebeeld op de afbeelding 2quinquies.
- Koppel de lege spuit los, sluit de spuit van 10 mL met 10 mL van de steriele fosfaatbuffer aan (recept niet inbegrepen zoals het kan variëren) en duw het volledige volume door de tC18-patroon in de steriele injectieflacon zoals hierboven beschreven (Figuur 2D ). Koppel de spuit los en spoel de lijn met 10 mL lucht met dezelfde spuit.
- Zuig 0,7 mL van de definitieve Tracer formulering op en verzamelmonsters voor kwaliteitscontroleprocedures (0,1 mL), bacteriële endotoxine test (0,1 mL) en steriliteit (0,5 mL).
5. procedures voor kwaliteitscontrole
Let op: elke partij van de radio Tracer moet worden onderworpen aan de passende kwaliteitscontroleprocedures (QC) voordat deze op de site voor huisdieren worden vrijgegeven voor toediening aan mensen of dieren. De auteurs van dit manuscript zijn niet verantwoordelijk voor de conformiteit van de radio Tracer die in andere centra met de lokale gezondheidsautoriteit is geproduceerd.
- Voer pre-release QC-procedures uit, die tests moeten omvatten voor radiochemische identiteit (RCI), radiochemische zuiverheid (RCP), chemische zuiverheid en molaire activiteit van de Tracer, evenals het resterende oplosmiddelgehalte en de pH van de formulering.
- Bepaal de RCI, RCP, chemische zuiverheid en molaire activiteit door middel van een analytisch HPLC-systeem dat is uitgerust met UV (bewaking bij 350 nm) en radioactiviteit detectoren, en een omgekeerde fase kolom. Bepaal de retentietijden van 6-OH-BTA-0 en 6-OH-BTA-1 en Kalibreer het instrument om de inhoud van elke stof te kwantificeren.
- Bepaal het residueel oplosmiddelgehalte door middel van een analytisch gaschromatografisch systeem dat is uitgerust met een capillaire kolom. Bepaal de retentietijden van aceton en ethanol en Kalibreer het instrument om de inhoud van elk oplosmiddel te kwantificeren.
- Voer de bacteriële endotoxine test uit met een cartridge lezer die is uitgerust met geschikte cartridges.
- Voer de Steriliteits analyse van het monster ten minste 14 dagen na de synthese uit om de afwezigheid van bacteriële groei te waarborgen of het Steriliteits monster naar een door de lokale gezondheidsautoriteit geaccrediteerd laboratorium te zenden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Om een typische radio synthese van [11c] PIB samen te vatten, wordt gasvormige [11c] ch3otf voor het eerst doorgegeven via een tC18-cartridge die vooraf is geladen met een oplossing van precursor (Figuur 1). De scheiding van het reactiemengsel wordt vervolgens bereikt door opeenvolgende elutie met waterige ethanol oplossingen als volgt. Ten eerste, 12,5% EtOH kolom de meerderheid van ongereageerde [11c] ch3otf en 6-Oh-BTA-0, dan 15% EtOH spoelt de resterende onzuiverheden, en ten slotte een 50% ethanol oplossing dempt de gewenste [11c] PIB in een steriele injectieflacon. De Tracer wordt vervolgens verdund met een steriele fosfaatbuffer en ondergaat strenge QC-procedures voordat deze op de beeldvormings plaats voor huisdieren worden uitgebracht. Typische analytische HPLC-UV en radioactiviteitschromatogrammen van de [11C] PIB-batch die geschikt zijn voor toediening, worden weergegeven in Figuur 3.
De totale radiosynthese tijd is 10 minuten vanaf de levering van [11c] ch3otf, de rcy van [11c] PIB met 0,2 mg precursor is 22% (BEGINNEND bij [11c] ch3otf, niet gecorrigeerd voor verval) en de molaire activiteit is 190 GBq/μmol. De Tracer moet voldoen aan alle QC-specificaties van de multicenter dominant geërfd Alzheimer Network Trials Unit (DIAN-TU) voor klinische proeven: de radiochemische zuiverheid moet hoger zijn dan 95%; het gehalte aan niet-radioactieve verontreinigingen moet lager zijn dan 1,3 μg per dosis van 10 mL; de pH moet binnen het bereik 4-8 liggen; en de inhoud van ethanol en aceton moet lager zijn dan 10% en 3000 ppm, respectievelijk. De monsters moeten ook steriel en endotoxine vrij zijn. De resultaten van vier typische radiosynthese runs worden samengevat in tabel 1.
Om de gerapporteerde techniek goed te laten werken, moet er worden gezorgd voor een aantal kritische stappen die hierboven worden beschreven. Om de voorloper op de tC18-cartridge toe te passen (stap 2,4), mag de oplossing niet naar de uitgang worden geduwd om het effectieve pad voor scheiding van de [11C] PIB niet te verkorten van de niet-gereageerd uitgangsmateriaal en mogelijke nevenproducten. De stroom van [11C] ch3otf via een patroon tijdens de overdracht mag niet hoger zijn dan 20 ml/min (stap 4,1). Zodra de elutie begint (stap 4,4), is het erg belangrijk om de patroon nat te houden en geen lucht door te laten om channeling effecten te voorkomen die kunnen resulteren in een lagere zuiverheid van de Tracer of lagere RCY als gevolg van de verliezen van [11C] PIB in het afval. Als het 5-poorts spruitstuk dat wordt gebruikt in de radio synthese (stap 3,1) niet resistent is tegen aceton, zoals een standaard polycarbonaat variëteit zoals ACC-101, mag de hoeveelheid aceton niet groter zijn dan 100 μL omdat grotere volumes de variëteit kunnen beschadigen tijdens de overdracht van de activiteit en resulteren in een mislukte synthese. Indien de pH niet aan de specificaties voldoet, kan de tC18 cartridge eventueel worden gespoeld met 10 mL steriel water tussen de stappen 4,7 en 4,8 in de afval fles.
Figuur 1: radio synthese van [11c] PIB door 11c-methylatie van 6-Oh-BTA-0 precursor met [11c] ch3otf. [11c] PIB is een van de meest gebruikte radiotracers voorbeeld vorming van amyloïde plaques geassocieerd met AD en andere neurodegeneratieve voorwaarden door PET. Deze Tracer wordt gewoonlijk gesynthetiseerd via 11c-methylatie van de voorloper van ANILINE genaamd 6-Oh-BTA-0 met behulp van [11c] methyl TRIFLAAT ([11c] ch3otf) ofwel in oplossing of in de droge HPLC-injectie kring (oplosmiddel techniek). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: stap-voor-stap synthese en zuivering van [11C] PIB op een tC18 patroon. A) gasvormige [11C] ch3otf wordt doorgegeven via de cartridge geladen met 6-Oh-BTA-0. Zoals beschreven in de stappen 4,1 en 4,2, [11C] ch3otf is gevangen op de cartridge met de voorloper en reageert met de voorloper bij kamertemperatuur 2 min. (B) Wash 1-of Wash 2-oplossing wordt in de doseerspuit opgezogen. Zoals beschreven in stap 4,3, trekt de spuitpomp van de module de zuiger van de geclipte spuit naar boven, waarbij een oplossing van ofwel eluens wordt teruggetrokken via een lijn die is aangesloten op poort 1 van de variëteit. C) de onzuiverheden worden in een afval fles weggespoeld. Zoals beschreven in stap 4,4, beweegt de spuitpomp van de module de zuiger van de geknipte spuit naar beneden en duwt de teruggetrokken reinigingsoplossing via de tC18-cartridge via de poorten 1, 3 en 4 van de variëteit in een afval fles. Stappen die worden weergegeven op de diagrammen B en C worden herhaaldelijk herhaald in een cyclus om alle niet-gereageerd materiaal uit de cartridge te wassen, zoals beschreven in de stappen 4,5-4,7. D) [11C] PIB wordt door middel van een steriel filter met het uiteindelijke eluens in een steriele injectieflacon geellueerd. Zoals beschreven in de stappen 4,8 en 4,9, wordt de spuit in een spuitpomp losgekoppeld van de lijn en eerst vervangen door een 10 mL spuit met 2,5 mL 50% waterige ethanol. Poort 5 van de variëteit wordt dan omgeschakeld naar de steriele injectieflacon en [11C] PIB wordt handmatig uit de tC18 geeluleerd. De lege spuit wordt vervolgens vervangen door een andere spuit met 10 mL steriele fosfaatbuffer en de gehele inhoud wordt door de tC18 geduwd om de lijnen te spoelen zoals beschreven in stap 4,10. De steriele injectieflacon bevat nu [11C] PIB in een 12,5 ml 10% gebufferde waterige ethanol oplossing. Dit cijfer is gewijzigd van Boudjemeline et al.12. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: kwaliteitscontrole analytische HPLC van [11C] PIB. A) de retentietijden van [11c] ch3Oh (van HYDROLYSE van [11c] ch3otf), niet gereageerd [11c] ch3otf en tracer [11c] PIB op de radioactiviteit chromatogram zijn 2,1, 4,0 en 6,6 min, Respectievelijk. Uit de analyse van het radioactiviteitsspoor blijkt dat de RCP van [11C] pib 98,0% is. B) de retentietijden van 6-Oh-BTA-0 (precursor) en 6-Oh-BTA-1 (Tracer piek) op het UV-chromatogram zijn respectievelijk 3,6 en 5,9 min. De analyse van de UV-Trace toont de residuele precursor concentratie onder de aanvaardbare grens (1,3 μg) en de afwezigheid van andere niet-radioactieve onzuiverheden. De radiochemische en chemische zuiverheid van de Tracer is dus aanvaardbaar voor klinische PET-studies. HPLC-condities-kolom (tabel met materialen): 5 μm, 100 x 4,0 mm; mobiele fase: 40:60 acetonitril/waterdebiet: 0,7 mL/min. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: optimalisatie van 6-Oh-BTA-0 precursor bedrag. Het laagste bedrag (0,1 mg) zorgt voor [11C] PIB in een matige radiochemische opbrengst (rcy) van 18,1 ± 3,8%. Radio synthese vanaf 0,2 mg biedt [11C] PIB een rcy van 22,0 ± 3,1%, terwijl het verhogen van het bedrag tot 0,3 mg de rcy verder verbetert tot 32,1 ± 3,7%, ten koste van een iets hoger bedrag van de precursor in het eindproduct. Alle RCY zijn niet gecorrigeerd voor verval (radiosynthese tijd van 10 min) vanaf de radioactiviteit van de [11C] ch3otf gevangen op tC18 cartridge. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: kwaliteitscontrole analytische HPLC van [11C] ABP688. A) radioactiviteit chromatogram toont rcp van gecombineerde (E)-en (Z)-[11C] ABP688 van 98,1%. B) UV-chromatogram vertoont een residuele precursor concentratie van meer dan 10 μg. Hoewel de chemische zuiverheid aanvaardbaar kan zijn voor klinische PET-studies, is een relatief lage effectieve molaire activiteit (eenm ≪ 37 gbq/μmol) vereist verdere zuivering optimalisatie. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| Batch | Run 1 | Run 2 | Run 3 | Run 4 |
| [11C] CH3otf, gbq | 9,21 | 11,25 | 7,84 | 6,44 |
| [11C] PiB, GBq | 2,26 | 2,37 | 2,11 | 1,41 |
| RCY,% * | 24,5 | 21,1 | 26,9 | 21,8 |
| RCP,% | 98 | 97,2 | 97,8 | 99,2 |
| Molaire activiteit, GBq/μmol | 154,6 | 322,6 | 121,1 | 162,1 |
| Residuele precursor, μg | 0,32 | 0,55 | 0,58 | 0,87 |
| Ph | 5 | 5 | 5 | 5 |
| EtOH-inhoud,% | 9,4 | 8,8 | 7,7 | 8,1 |
| Aceton inhoud, ppm | 33 | 38 | 46 | 33 |
| BET test | N/a | < 10 EU/mL | < 10 EU/mL | < 10 EU/mL |
| Steriliteits test | N/a | Geen groei | Geen groei | Geen groei |
| * Voetnoot: vanaf [11C] ch3otf, niet gecorrigeerd voor verval | ||||
Tabel 1. Representatieve resultaten van [11C] de productie van PIB loopt onder geoptimaliseerde omstandigheden. Alle batches voldoen aan de eisen voor tracers die bestemd zijn voor klinische PET-studies.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ondanks de recente opkomst en FDA-goedkeuring van verschillende 18F-GELABELDE Pet-tracers, zoals florbetapir, florbetaben en flutemetamol, blijft [11C] PIB een gouden standaard Tracer voor amyloïde beeldvorming vanwege de snelle hersen opname en lage niet-specifieke Bindend. Momenteel wordt deze Tracer gesynthetiseerd via ofwel natte chemie16 ofwel met behulp van een "Dry loop" aanpak4,17. Beide methoden vereisen HPLC-zuivering gevolgd door herformulering in waterige ethanol, die ongeveer 20-30 minuten duurt vanaf [11C] ch3otf. Geïnspireerd door enkele van de eerdere rapporten over Solid phase ondersteunde 11c-Methylation technieken en het klinische belang van [11c] PIB, hebben we ons gericht op het ontwikkelen van een radiosynthese van deze Tracer met behulp van goedkope wegwerp Solid phase-extractie ( SPE) als een "3-in-1"-entiteit voor reactie, zuivering en formulering.
De meest kritieke stappen voor een succesvolle productie van PET-tracers voor in vivo beeldvorming bij menselijke proefpersonen zijn: 1) opname van de radioactieve isotoop in een Tracer molecuul; 2) scheiding van de Tracer van ongereageerde radioactieve en niet-radioactieve soorten; 3) herformulering van de Tracer in een biologisch compatibel oplosmiddel; 4) naleving van de kwaliteitscontroleprocedures. Op basis van de eerder gerapporteerde solvent-Captive methode hadden we verwacht dat de SPE-ondersteunde techniek een lagere hoeveelheid voorloper zou vergen dan 11C-methylatie in oplossing. In het bijzonder, eerder gemelde oplosmiddel gevangenschap procedures voor de radio synthese van [11C] PIB vereisen 0,5-1,0 mg van de precursor4,17. Dus, we onderzocht niet gecorrigeerd voor verval radiochemische opbrengsten van [11c] PIB vanaf [11c] ch3otf op drie verschillende hoeveelheden van 6-Oh-bta-0:0,1, 0,2, en 0,3 mg. Zelfs het laagste bedrag (0,1 mg) biedt een matige hoeveelheid [11C] PIB, zij het bij relatief lage en minder betrouwbare rcy (18,1 ± 3,8%). Radio synthese vanaf 0,2 mg geeft een RCY van [11C] PIB (22,0 ± 3,1%), terwijl het verhogen van het bedrag naar 0,3 mg verder verbetert rcy (32,1 ± 3,7%), ten koste van een iets hoger bedrag van de precursor in het eindproduct. In alle gevallen werd de radio synthese in 10 minuten voltooid. Dus, de optimale voorloper bedrag hangt af van de gewenste RCY en zuiverheid van [11C] PIB in bepaalde Pet Centers. De resultaten van de radiochemische rendements optimaliserings experimenten op basis van het precursor bedrag worden samengevat in Figuur 4. Met name, radio synthese probeert met behulp van [11c]3I als een methylerings agent of ethanol als een reactie oplosmiddel niet de gewenste [11c] PIB (gegevens niet weergegeven).
De kwantitatieve scheiding van het radiosynthese reactiemengsel op een korte SPE-cartridge was het meest uitdagende deel van de beschreven techniek. We veronderstellen dat aromatische amines 6-OH-BTA-0 en 6-OH-BTA-1 voornamelijk bestaan in hun geprotoneerde vormen in zure media en daarom scherpere elutie profielen van de omgekeerde fase van de vaste fase zouden hebben. Daarom werden alle waterige ethanol oplossingen bereid met behulp van 0,2 M acetaatbuffer bij pH 3,7. Vervolgens bepaalden we dat waterige ethanol oplossingen met EtOH-concentratie tot 15% geleidelijk Elueer ongereageerde precursor 6-Oh-BTA-0 en [11c] ch3otf, terwijl van [11c] PIB blijft gevangen op de tC18 cartridge. Om te voorkomen dat deze onzuiverheden in een definitieve Tracer formulering worden gebracht, werd de ethanol concentratie verhoogd van 12,5% naar 15% in een gradiënt elutie. Nadat alle onzuiverheden uit de patroon waren weggespoeld, werd de Tracer elutie bereikt met een minimale hoeveelheid (2,5 mL) van de geconcentreerde ethanol oplossing (50%). Om het ethanol gehalte onder de limiet van 10% te houden en de pH van de geformuleerde Tracer binnen het aanvaardbare bereik voor menselijke injectie (4-8) te brengen, werd de Tracer verdund met steriele fosfaatbuffer.
Volgende voorwaarden optimalisatie, de radio synthese van [11C] PIB werd geautomatiseerd met behulp van een commercieel verkrijgbare geautomatiseerde synthese Unit (ASU), uitgerust met dispenser spuit en wegwerp spruitstuk. De Manifold Setup voor deze specifieke ASU is eenvoudig zoals beschreven in de stappen 3,1-3,5. Met name kan deze methodologie eenvoudig worden geïmplementeerd op de meeste andere beschikbare ASU, volgens de hierboven beschreven recepten. Onder geoptimaliseerde omstandigheden worden batches van [11C] PIB die geschikt zijn voor klinische toepassingen gesynthetiseerd met eind activiteiten variërend van 1,4 tot 2,4 gbq (38-61 MCI).
Meer recentelijk hebben we de "3-in-1"-techniek toegepast voor de radiolabeling van [11C] ABP688, een pet-Tracer voor de beeldvorming van metabotropic glutamaatreceptoren type 5 (mGlu5)18,19. Radio synthese van deze Tracer berust op de 11C-methylatie van de-OH-groep in de Oxime; Daarom is toevoeging van base nodig om deprotonaat de voorloper van de gedesmethyleerd. Tetrabutylammoniumhydroxide (als een oplossing van 1 M in MeOH) werd geselecteerd als basis omdat het oplosbaar is in de meeste polaire organische oplosmiddelen. In een voorlopig radioolabeling-experiment werd een oplossing van precursor (0,5 mg) in DMSO (100 μL) gemengd met 1 M TBAOH in MeOH (20 μL) en werd het mengsel zorgvuldig aangebracht op de tC18-patroon zoals hierboven beschreven (zie stap 2,4). Gasvormig [11C] l3ik werd door de patroon doorgegeven zoals beschreven in de stappen 4,1-4,2 en de reactie was toegestaan om op kamertemperatuur te gaan gedurende 5 minuten. sequentiële elutie met verdunde ethanol oplossingen in 0,2 M natriumbicarbonaat buffer (pH 8,5- 9,0)-92 mL van 15% EtOH gevolgd door 92 mL 20% EtOH-uitgewassen de ongereageerde [11C] ch3I en rest precursor. Radiochemisch zuiver [11C] ABP688 (rcy = 18,2%, rcp > 98.0%) werd vervolgens met 50% EtOH oplossing in dezelfde buffer door een steriel filter, zoals beschreven in stappen 4,9-4,11. Ondanks het feit dat meer dan 98% van de precursor wordt verwijderd met verdunde ethanol wasses, vereist de aanwezigheid van enkele niet-gereageerd precursor in de laatste Tracer (tot 20 μg) verdere optimalisering van de radiosynthese procedure. Deze optimalisatie is aan de gang en de resultaten van dit project zullen te zijner tijd worden gepubliceerd. Representatieve analytische HPLC-UV en radioactiviteitschromatogrammen van de [11C] ABP688 batch worden weergegeven op Figuur 5.
Concluderend hebben we een efficiënte, solide fase ondersteunde koolstof-11 radiolabeling-procedure ontwikkeld met behulp van gemakkelijk beschikbare goedkope SPE-cartridges als "3-in-1"-entiteiten voor radio synthese, zuivering en formulering van PET-tracers die worden gebruikt voor klinische Imaging. Tracers geschikt voor menselijke injectie worden geproduceerd binnen 10 minuten vanaf de toevoeging van 11c-methylating agent ([11c] ch3otf of [11c] ch3I) bij hoge rcy en molaire activiteit. We hebben deze techniek volledig geautomatiseerd om deze in overeenstemming te brengen met Good Manufacturing Practices (GMP) regelgeving opgelegd door gezondheids-en stralings veiligheidsinstanties. Solide fase ondersteunde radio synthese vereist een lage hoeveelheid precursor, vermijdt het gebruik van giftige oplosmiddelen, verlaagt de synthese tijd en stralingsdosis opgelopen door het personeel. Bovendien verbetert het vermijden van HPLC-gerelateerde storingen de betrouwbaarheid van de radio synthese en maakt het mogelijk om wegwerp Kits voor routine Tracer productie te ontwikkelen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.
Acknowledgments
Deze studie werd gedeeltelijk gesteund door een subsidie 18-05 van de Alzheimer's Society of Canada (voor A. K.) en Brain Canada Foundation met ondersteuning van Health Canada. De auteurs willen graag de McGill University faculteit geneeskunde, Montreal neurologische Instituut en McConnell Brain Imaging Centre erkennen ter ondersteuning van dit werk. We danken ook mevrouw Monica Lacatus-Samoila voor hulp bij kwaliteitscontroleprocedures en Drs. Jean-Paul Soucy en Gassan Massarweh voor de toegang tot radio-isotopen en de radiochemie faciliteit.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-OH-BTA-0 | ABX advanced biochemical compounds | 5101 | Non-radioactive precursor of [11C]PiB |
| 6-OH-BTA-1 | ABX advanced biochemical compounds | 5140 | Non-radioactive standard of [11C]PiB |
| Agilent 1200 HPLC system | Agilent | Agilent 1200 | Analytical HPLC system |
| Ethanol absolute | Commercial alcohols | 432526 | |
| Hamilton syringe (luer-tip, 250 µL) | Hamilton | HAM80701 | |
| MZ Analytical PerfectSil 120 | MZ-Analysentechik GmbH | MZ1440-100040 | Analytical HPLC column |
| Perkin Elmer Clarus 480 GC system | Perkin Elmer | Clarus 480 | Gas chromotograph |
| polycarbonate manifold | Scintomics | ACC-101 | Synthesis manifold |
| Restek MTX-Wax column (30 m, 0.53 mm) | Restek | 70625-273 | Analytical GC column |
| Scintomics GRP module | Scintomics | Scintomics GRP | Automated synthesis unit |
| Sep-Pak tC18 Plus | Waters | WAT020515 | Solid phase extraction cartridge |
| solvent-resistant manifold | Scintomics | ACC-201 | Synthesis manifold |
| Spinal needle | BD | 405181 | |
| Sterile extension line | B. Braun | 8255059 | |
| Sterile filter | Millipore | SLLG013SL | |
| Sterile vial (20mL) | Huayi | SVV-20A | |
| Sterile water | Baxter | JF7623 | |
| Synthra MeIplus Research | Synthra | MeIplus Research | [11C]CH3I/[11C]CH3OTf module |
| Syringe (10 mL) | BD | 309604 | |
| Syringe (1mL) | BD | 309659 | |
| Syringe (20 mL) | B. Braun | 4617207V | Dispenser syringe |
| Vent filter | Millipore | TEFG02525 |
References
- Langstrom, B., Lundqvist, H. The preparation of 11C-methyl iodide and its use in the synthesis of 11C-methyl-L-methionine. The International journal of applied radiation and isotopes. 27 (7), 357-363 (1976).
- Larsen, P., Ulin, J., Dahlstrøm, K., Jensen, M. Synthesis of [11C]iodomethane by iodination of [11C]methane. Applied radiation and isotopes. 48 (2), 153-157 (1997).
- Jewett, D. M. A simple synthesis of [11C]methyl triflate. International journal of radiation applications and instrumentation. Part A, Applied radiation and isotopes. 43 (11), 1383-1385 (1992).
- Wilson, A. A., Garcia, A., Houle, S., Vasdev, N. Utility of commercial radiosynthetic modules in captive solvent [11C]-methylation reactions. Journal of Labelled Compounds and Radiopharmaceuticals. 52 (11), 490-492 (2009).
- Wilson, A. A., Garcia, A., Jin, L., Houle, S. Radiotracer synthesis from [(11)C]-iodomethane: a remarkably simple captive solvent method. Nuclear medicine and biology. 27 (6), 529-532 (2000).
- Fedorova, O. S., Vaitekhovich, F. P., Krasikova, R. N. Automated Synthesis of [18F]Fluoromethylcholine for Positron-Emission Tomography Imaging. Pharmaceutical Chemistry Journal. 52 (8), 730-734 (2018).
- Jewett, D. M., Ehrenkaufer, R. L., Ram, S. A captive solvent method for rapid radiosynthesis: application to the synthesis of [1-(11)C]palmitic acid. The International journal of applied radiation and isotopes. 36 (8), 672-674 (1985).
- Watkins, G. L., Jewett, D. M., Mulholland, G. K., Kilbourn, M. R., Toorongian, S. A. A captive solvent method for rapid N-[11C]methylation of secondary amides: application to the benzodiazepine, 4'-chlorodiazepam (RO5-4864). International journal of radiation applications and instrumentation. Part A, Applied radiation and isotopes. 39 (5), 441-444 (1988).
- Hockley, B. G., Henderson, B., Shao, X. Chapter 27, Synthesis of {11C]Raclopride. Radiochemical Syntheses. , John Wiley & Sons. 167-175 (2012).
- Lodi, F., et al. Reliability and reproducibility of N-[11C]methyl-choline and L-(S-methyl-[11C])methionine solid-phase synthesis: a useful and suitable method in clinical practice. Nuclear Medicine Communications. 29 (8), 736-740 (2008).
- Jolly, D., et al. Development of "[(11)C]kits" for a fast, efficient and reliable production of carbon-11 labeled radiopharmaceuticals for Positron Emission Tomography. Applied radiation and isotopes. 121, 76-81 (2017).
- Boudjemeline, M., et al. Highly efficient solid phase supported radiosynthesis of [(11) C]PiB using tC18 cartridge as a "3-in-1" production entity. Journal of Labelled Compounds and Radiopharmaceuticals. 60 (14), 632-638 (2017).
- Mathis, C. A., et al. A lipophilic thioflavin-T derivative for positron emission tomography (PET) imaging of amyloid in brain. Bioorganic and medicinal chemistry letters. 12 (3), 295-298 (2002).
- Mathis, C. A., et al. Synthesis and evaluation of 11C-labeled 6-substituted 2-arylbenzothiazoles as amyloid imaging agents. Journal of medicinal chemistry. 46 (13), 2740-2754 (2003).
- Buffer Reference Center. , Sigma Aldrich. Available from: https://www.sigmaaldrich.com/life-science/core-bioreagents/biological-buffers/learning-center/buffer-reference-center.html (2019).
- Philippe, C., Mitterhauser, M., Wadsak, W. Chapter 18, Synthesis of 2-(4-N-[11C]Methylaminophenyl)-6-Hydroxybenzothiazole ([11C]6-OH-BTA-1; [11C]PIB). Radiochemical Syntheses. , John Wiley & Sons. 177-189 (2012).
- Shao, X., Fawaz, M. V., Jang, K., Scott, P. J. H. Synthesis and Applications of [11C]Hydrogen Cyanide. Radiochemical Syntheses. , John Wiley & Sons. 207-232 (2015).
- Ametamey, S. M., et al. Radiosynthesis and preclinical evaluation of 11C-ABP688 as a probe for imaging the metabotropic glutamate receptor subtype 5. Journal of Nuclear Medicine. 47 (4), 698-705 (2006).
- Ametamey, S. M., et al. Human PET studies of metabotropic glutamate receptor subtype 5 with 11C-ABP688. Journal of Nuclear Medicine. 48 (2), 247-252 (2007).
