Summary
당사는 고체 상 추출 카트리지를 사용하여 양전자 방출 단층 촬영(PET)에 대한 임상적으로 관련된 추적기를 생산하기 위해 효율적인 탄소 11 방사성 라벨링 기술을 보고합니다. 11세 C-메틸화제는 전구체와 연속용출로 미리 로드된 카트리지를 통과하여 높은 방사성 화학적 수율에서 화학적 및 방사성 화학적으로 순수한 PET 트레이서를 제공합니다.
Abstract
양전자 방출 단층 촬영에 사용되는 방사성 추적기의 일상적인 생산 (PET) 주로 방사성 신디톤용액에 비 방사성 전구체와 반응 젖은 화학에 의존. 이러한 접근법은 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)에 의한 트레이서의 정제를 필요로 하고 인간 투여를 위한 생체 적합성 용매에서 재제형이 뒤따릅니다. 우리는 최근 합성, 정화 및 일회용 "3-in-1"단위로 고체 상 카트리지를 활용하여 탄소 11 표지 PET 방사성 의약품의 고효율 합성을위한 새로운 11C-메틸화 접근법을 개발했습니다. 트레이서의 재구성. 이 접근법은 예비 HPLC의 사용을 없애고 전사 라인과 방사성 붕괴로 인한 트레이서의 손실을 줄입니다. 또한 카트리지 기반 기술은 합성 신뢰성을 향상시키고 자동화 프로세스를 단순화하며 GMP(우수 제조 관행) 요구 사항을 준수합니다. 여기에서, 우리는 PET 추적자 피츠버그 화합물 B([11C]PiB)의 생산의 예에 이 기술을 보여줍니다, 인간의 두뇌에 있는 아밀로이드 플라크를 위한 생체 내 화상 진찰 에이전트에 있는 금 본위제.
Introduction
양전자 방출 단층 촬영 (PET)은 생화학 적 과정, 신호 및 변형의 생체 시각화를 가능하게하기 위해 생물학적 활성 분자에 부착 된 동위원소의 방사성 붕괴를 감지하는 데 의존하는 분자 이미징 양식입니다. . 탄소 11 (t1/2 = 20.3 분)은 유기 분자가 풍부하고 짧은 반감기로 인해 PET에서 가장 일반적으로 사용되는 방사성 동위 원소 중 하나이며 동일한 인간 또는 동물 대상체에 대해 동일한 날에 여러 추적기를 투여 할 수 있습니다. 방사선 부담을 줄입니다. 이 동위원소로 표지된 많은 트레이서는 임상 연구 및 생체 내 PET 이미징을 위한 기본 건강 연구에 사용되며, 생물학적으로 관련된D2/D3 수용체에 대한[11C]raclopride,[11C] 아밀로이드 플라크에 대한 PiB,[11C]PBR28 트랜스로케이터 단백질-단지 몇 가지 이름을 지정합니다.
탄소-11 표지 PET 추적기는 주로 -OH(알코올, 페놀 및 카르복실산), -NH(아민 및 아미드) 또는 -SH(티올) 그룹을 함유하는 비방사성 전구체의 11C-메틸화를 통해 생산됩니다. 간략하게, 동위원소는[11C]CO2의 화학적 형태로 14N(p,α)11C핵 반응을 통해 사이클로트론의 가스 표적에서 발생된다. 후자는 젖은 화학 (LiAlH4로 [11C]CH3OH로 감소)를 통해 [11C]CH3 I)로 변환된 후HI로 담금질하거나 1 또는 건조합니다. 화학([11C]CH4에 촉매 환원 후 분자 I2를가진 급진적 인 이오디네이션2) 【11C 】 CH3는 실버 트라이플랫 컬럼3을통해 전달함으로써 보다 반응성 11C-메틸트리플랫([11 C]CH3OTf))으로 더 변환될 수 있다. 11C-메틸화는 유기 용매에서 비방사성 전구체의 용액으로 방사성 가스를 버블링하거나 보다 우아한 포로 용매 "루프" 방법4,5를 통해 수행된다. 11C-추적자는 HPLC를 통해 정제되고 생체 적합성 용매로 재조화되고 인간 피험자에게 투여되기 전에 멸균 필터를 통과합니다. 이러한 모든 조작은 탄소 11의 짧은 반감기를 감안할 때 빠르고 신뢰할 수 있어야 합니다. 그러나 HPLC 시스템을 사용하면 트레이서와 생산 시간의 손실이 크게 증가하고 종종 독성 용매의 사용이 필요하고 자동화가 복잡해지고 때로는 실패한 합성으로 이어집니다. 또한 반응기와 HPLC 컬럼의 세척이 필요하면 후속 트레이서 배치의 합성 사이의 지연이 연장되고 방사선에 대한 인력의 노출이 증가합니다.
불소-18(t1/2 = 109.7분)의 방사성 화학은 다른 널리 사용되는 PET 동위원소로, 최근 HPLC 정제의 필요성을 없애주는 카세트 기반 키트의 개발을 통해 발전되었습니다. 고체 상 추출 (SPE) 카트리지를 채택함으로써,이 완전히 일회용 키트는[18F] FDG,[18F] FMISO,[18F] FMC 등을 포함하여 18F-추적기의 신뢰할 수있는 일상적인 생산을 허용, 짧은 합성 인력 의 참여감소 및 장비 유지 보수를 최소화할 수 있습니다. 탄소-11이 PET 이미징에서 덜 인기 있는 동위원소로 남아 있는 이유 중 하나는 11C-tracers의 일상적인 생산을 위한 유사한 키트의 부족입니다. 이들의 개발은 합성 신뢰성을 크게 향상시키고, 방사성 화학 수율을 증가시키고, 생산 모듈의 자동화 및 예방 유지 보수를 단순화할 것입니다.
현재 사용 가능한 생산 키트는 반응되지 않은 방사성 동위원소, 전구체 및 기타 방사성 및 비방사성 부산물에서 방사성 추적자를 분리하기 위해 HPLC 기둥 대신 저렴한 일회용 SPE 카트리지를 활용합니다. 이상적으로, 방사성 라벨링 반응은 또한 동일한 카트리지에서 진행; 예를 들어,[18F]의디메틸아미노에탄올을 기체로[18F]CH2BrF를 전립선암 이미징 PET 트레이서[18F]의 생산에서 양이온 교환 수지 카트리지에서 발생 6. 카트리지에 여러 11C 추적기의 방사성 라벨링에 대한 유사한 절차가보고되었지만7,8 및[11C]콜린9의 방사성 합성에 특히 강력해졌습니다. 및[11C]메티오닌(10)은, 이들 예는 전구체로부터의 분리가 종종 필요하지 않은 종양학적 PET 트레이서에 한정된 채로 남아 있다. 우리는 최근에[11C]CH3I11 및 후속 11C-메틸화의 생산을위한"[11C]키트"의 개발뿐만 아니라 고체 상 지원 합성12의 개발을보고우리의 노력에 11C-추적기의 일상적인 생산을 단순화합니다. 여기서, 우리는 2003년에 처음 개발되었을 때 알츠하이머병(AD) 이미징 분야에 혁명을 일으킨 Aβ 이미징용 방사선 추적기인[11C]PiB의 고체 상 지원 방사성 합성의 예를 사용하여 우리의 진전을 보여주고자 합니다. 그림 1) 13,14. 이 방법에서, 휘발성[11C]CH3OTf(bp 100°C)는 일회용 카트리지의 수지에 증착된 6-OH-BTA-0 전구체를 통해 전달된다. PET트레이서[11C]PiB는 생체 적합성 수성 에탄올과 카트리지로부터 용출에 의해 전구체 및 방사성 불순물로부터 분리된다. 또한, 원격으로 작동하는 방사성 화학 합성 모듈과 일회용 카세트 키트를 사용하여[11C]PiB 방합성의 이 방법을 자동화했습니다. 특히 표준 20mL 일회용 플라스틱 주사기, 가스 흐름 컨트롤러, 진공 펌프 및 게이지에 맞는 주사기 드라이브(디스펜서)가 장착된 20밸브 방사성 화학 모듈에 이 방사능 합성을 구현했습니다. 이 방법의 단순성으로 인해, 우리는 카세트 기반 또는 고정 밸브가 장착 된 대부분의 상업적으로 사용할 수있는 자동화 된 신디사이저로 수정 할 수 있다고 확신합니다. 이 고체 위상 지원 기술은[11C]PiB 생산을 우수 제조 관행(GMP) 규정을 준수하고 합성 신뢰성을 향상시킵니다. 여기에 설명된 기술은 또한 방사성 합성에 필요한 전구체의 양을 감소시키고, "녹색" 생체 적합성 용매만을 사용하고 연속생산 배치 사이의 시간을 감소시킨다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. 버퍼 및 용리산의 준비
- 100 mL의 물에 2.72 g의 아세테이트 트리하이드레이트 나트륨을 용해하여 0.2M 나트륨 아세테이트 용액 (용액 A)을 준비하십시오.
- 11.4 mL의 빙하 아세트산을 물 1 L에 용해하여 0.2 M 아세트산 용액 (용액 B)을 준비하십시오.
- 용액 A의 50 mL을 450 mL의 용액 B와 결합하여 버퍼 레퍼런스센터(15)에따라 pH 3.7(buffer 1)에서 아세테이트 버퍼를 준비한다. pH 스트립 또는 pH 측정기로 버퍼의 pH를 확인합니다.
- 절대 에탄올 12.5 mL과 87.5 mL의 버퍼 1을 결합하여 100 mL 병에 12.5 % 수성 EtOH 용액 (세척 1)을 만듭니다.
- 절대 에탄올 15mL와 85 mL의 버퍼 1을 결합하여 100 mL 병에 15 % 수성 EtOH 용액 (세척 2)을 만듭니다.
- 절대 에탄올 5mL와 5 mL의 버퍼 1을 결합하여 50% 수성 EtOH 용액(최종 용리액)을 만들고 이 용액의 2.5 mL을 10 mL 주사기에 그립니다.
2. 전구체를 카트리지에 적용
- 10 mL의 물을 통과한 다음 tC18 카트리지를 통해 5 mL의 아세톤을 통과하여 사전 컨디셔닝합니다.
- 1 분 동안 50 mL / min에서 질소 스트림으로 카트리지를 건조.
- 무수 아세톤의 1 mL에 전구체 6-OH-BTA-0 의 2 mg을 용해.
- Luer-tip 250 μL 정밀 유리 주사기를 아래쪽으로 잡고 전구체 용액의 100 μL과 액체 위에 50 μL의 에어 쿠션을 인출합니다. 바늘을 제거하고 천천히 아래로 플런저를 밀어 여성 끝에서 tC18 카트리지에 전구체 용액을 적용합니다. 더 이상 솔루션을 밀어하지 마십시오!
3. 자동 합성을 위한 매니폴드 설정
- 합성 모듈상에서 표준 5포트 일회용 매니폴드를 고정하고 아래 그림 2 및 단계 3.2 - 3.5에 따라 조립합니다.
참고: 아세톤 내성 매니폴드를 사용하는 것이 좋습니다(재료 표참조). - 포트 1에는 두 개의 위치가 있습니다. 수평 입구를 20mL 주사기가 장착된 자동 디스펜서에 연결합니다. 수직 입구를 세척 1로 병에 연결합니다.
- [11C]CH3 OTf를 생성하는 모듈의 출력을 매니폴드의 포트 2에 연결합니다.
- 포트 3과 4 사이에 전구체 6-OH-BTA-0이 장착된 tC18 카트리지를 설치합니다.
- 포트 5에는 두 개의 위치가 있습니다. 수평 콘센트를 200mL 이상 보관해야 하는 폐병에 연결합니다. 멸균 필터를 통해 트레이서 수집을 위해 수직 출구를 멸균 바이알에 연결합니다.
4.[11C]PiB의 방합성
주의: 방사성 동위원소와 관련된 모든 조작은 방사성 물질로 작업할 수 있는 적절한 교육을 받은 직원이 납 보호 핫 셀에서 수행해야 합니다.
참고: 이 프로토콜은 방사화학 모듈을 사용하여 [11 C]CH3 OTf로의 전환 및사이클로트론에서[11C]CO2의 생산의 세부 사항을 다루지 않는다. 이러한 절차는 방사성 화학 실험실의 개별 장비에 따라 달라지며 이 프로토콜의 범위를 벗어납니다. 우리의 PET 센터는 가스에 N2/O 2 가스 혼합물 (99.5:0.5)와 14N (p,α) 11 C 핵 반응을통해 [11C]CO2의 화학 형태로 탄소11을생산하는 IBA 사이클로트론이 장착되어 있습니다. 표적, 및[11C]CH3 I의생산을 위한 시판되는 모듈은 "건조 방법"(촉매 환원[11C]CH4 및 라디칼 이오디네이션)을 통해 한다. 【11C 】 CH3OTf는[11C]CH3 I를 20 mL/min에서 175°C로 가열된 은 삼중팽창 컬럼위에 통과시킴으로써 제조된다.
- [11C]CH3OTf를 포트 2를 통해 매니폴드에 전달하고[11C]CH3OTf 모듈에 의해 조절된 20 mL/min 출력 흐름에서 로드된 tC18 카트리지를 통과하고, 포트 3과 4를 통해 폐기물 병에 그림 2A.
- 모든 방사능이 카트리지 홀더 뒤의 방사능 검출기에 의해 모니터링되는 tC18 카트리지에 전송되고 트랩되면 포트 2를 닫아 가스의 흐름을 중지합니다. 카트리지가 2분 동안 앉아 서 서 반응을 완료 합니다.
- 그림 2B에도시된 바와 같이 100 mL 병에서 100 mL 병에서 포트 1을 통해 디스펜서 주사기로 19 mL의 세척 1용액(단계 1.4참조)을 인출한다.
- 도 2C에표시된 대로 포트 3과 4를 통해 tC18 카트리지를 통해 디스펜서에서 세척 1 8.5 mL을 분배하고 50 mL / min에서 폐병에 분배하십시오. 분리 효율을 떨어뜨릴 수 있기 때문에 매니폴드에 기포가 없는지 확인합니다.
- 4.3단계와 4.4번을 4회 반복하여 매번 18.5 mL의 세척 용액을 인출하고 분배합니다. tC18을 통과한 세척 1 용액의 총 부피는 92.5 mL; 그러나, 사용되는 특정 합성 모듈에 따라 90- 100 mL 범위 내에서 달라질 수 있다.
- 포트 1의 입력 라인을 세척 1에서 세척 2 용액으로 전환합니다(1.5단계 참조).
- 4.3단계와 4.4번을 세 번 반복하여 매번 18.5 mL의 세척 2용액을 인출하고 분배합니다. tC18을 통과한 세척 2 용액의 총 부피는 55.5 mL입니다. 그러나, 사용되는 특정 합성 모듈에 따라 50- 60 mL 범위 내에서 달라질 수 있다.
- 그림 2D에표시된 대로 밸브 5를 최종 바이알쪽으로 전환합니다. 디스펜서에서 라인을 분리하고 최종 용리액 의 2.5 mL을 포함하는 10 mL 주사기에 연결하십시오 (50 % 수성 EtOH, 단계 1.6 참조) 및 공기 7.5 mL.
- 주사기를 아래쪽으로 잡고, 최종 용리액 용액(2.5mL)을 수동으로 밀어내고, 그 다음에 공기(7.5 mL)를 포트 3과 4를 통해 tC18 카트리지를 통과하고 그림과 같이 멸균 필터를 통해 트레이서 수집을 위한 멸균 바이알로 2D.
- 빈 주사기를 분리하고 멸균 인산완충액 10mL를 함유한 10mL 주사기를 연결하고(레시피는 다를 수 있으므로 포함되지 않음) 전술한 바와 같이 tC18 카트리지를 통해 전체 부피를 멸균 바이알에 밀어 넣습니다(그림2D ). 주사기를 분리하고 동일한 주사기를 사용하여 10mL의 공기로 라인을 세척합니다.
- 최종 트레이서 제제의 0.7 mL을 철회하고 품질 관리 절차 (0.1 mL), 세균 내독소 테스트 (0.1 mL) 및 멸균 (0.5 mL)에 대한 샘플을 수집합니다.
5. 품질 관리 절차
주의: 방사성 추적기의 각 배치는 인간 또는 동물 대상체로 투여하기 위해 PET 이미징 부위에 방출되기 전에 적절한 품질 관리 절차(QC)를 거쳐야 합니다. 이 원고의 저자는 지역 보건 당국 규정과 다른 센터에서 생산 된 방사성 추적기의 준수에 대한 책임을지지 않습니다.
- 제형의 잔류 용매 함량 및 pH뿐만 아니라 추적자의 방사성 화학적 정체성 (RCI), 방사성 화학 적 순도 (RCP), 화학 적 순도 및 대구치 활성에 대한 테스트를 포함해야하는 시험판 QC 절차를 수행하십시오.
- UV(350nm에서 모니터링) 및 방사능 검출기 및 역위상 컬럼이 장착된 분석 HPLC 시스템을 통해 RCI, RCP, 화학적 순도 및 대구치 활성을 결정합니다. 6-OH-BTA-0 및 6-OH-BTA-1의 유지 시간을 결정하고 각 화합물의 함량을 정량화하기 위해 계측기를 보정합니다.
- 모세관 컬럼이 장착된 분석 가스 크로마토그래피 시스템을 통해 잔류 용매 함량을 결정합니다. 아세톤과 에탄올의 유지 시간을 결정하고 각 용매의 함량을 정량화하기 위해 계측기를 보정합니다.
- 적합한 카트리지가 장착된 카트리지 리더기를 사용하여 세균 내독소 테스트를 수행합니다.
- 세균 성장의 부재를 보장하기 위해 합성 후 적어도 14 일 샘플의 멸균 분석을 수행하거나 지역 보건 당국에 의해 공인 된 실험실에 멸균 샘플을 보냅니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
[11C]PiB의 전형적인 방사성 합성을 요약하기 위해, 기체[11C]CH3 OTf는 먼저 전구체의 용액으로 미리 로드된 tC18 카트리지를 통과한다(도1). 반응 혼합물의 분리는 다음과 같이 수성 에탄올 용액을 가진 연속적인 용출에 의해 달성된다. 먼저, 12.5% EtOH는 대부분의 미반응[11C]CH3OTf 및 6-OH-BTA-0을 용해시키고, 15% EtOH는 잔류 불순물을 안아 내고, 마지막으로 50% 에탄올 용액은 원하는[11C]PiB를 멸균 바이알로 용해시낸다. 트레이저는 멸균 인산염 버퍼로 희석되고 PET 이미징 부위로 방출되기 전에 엄격한 QC 절차를 거칩니다. 투여에 적합한[11C]PiB배치의 전형적인 분석적 HPLC UV 및 방사능 크로마토그램은 도 3에나타내고 있다.
총 방사성 합성 시간은[11C]CH3OTf의 전달로부터 시작하여 10 분, 전구체의 0.2 mg을 사용하는 RCY는22 %입니다 ([11 C]CH3OTf에서 시작하여, 붕괴에 대해 교정되지 않음) 어금니 활성은 190 GBq/μmol. 추적기는 임상 시험을 위해 다중 센터의 모든 QC 사양을 준수해야 합니다(DIAN-TU): 방사성 화학적 순도는 95% 이상이어야 합니다. 비 방사성 불순물 함량은 10 mL 용량 당 1.3 μg 미만이어야합니다. pH는 4 - 8 범위 내에 있어야합니다. 에탄올 과 아세톤 함량은 각각 10 % 및 3000 ppm 미만이어야합니다. 샘플은 또한 멸균 및 내독소가 없어야합니다. 4개의 전형적인 방사성 합성 실행의 결과는 표 1에요약되어 있습니다.
보고된 기술이 제대로 작동하려면 위에서 설명한 몇 가지 중요한 단계 동안 주의를 기울여야 합니다. tC18 카트리지(단계 2.4)에 전구체를 적용하기 위해 용액은 미반응 시동 재료 및 가능한 측면제품으로부터 [11C]PiB의 분리를 위한 유효 경로를 단축시키지 않도록 출력쪽으로 밀려서는 안 된다. [11C]CH3OTf가 전송 중에 카트리지를 통해 흐르는 것은 20 mL/min을 초과해서는 안 된다(단계 4.1). 용출이 시작되면 (단계 4.4), 카트리지를 젖은 상태로 유지하고 폐기물에서[11C]PiB의 손실로 인해 트레이서의 낮은 순도 또는 낮은 RCY를 초래할 수있는 채널링 효과를 피하기 위해 공기를 통과시키지 않는 것이 매우 중요합니다. 방사성 합성에 사용되는 5포트 매니폴드(단계 3.1)가 ACC-101과 같은 표준 폴리카보네이트 매니폴드와 같은 아세톤에 내성이 없는 경우, 아세톤의 양이 100 μL을 초과해서는 안 되며, 더 큰 부피가 활동 전달 중에 매니폴드를 손상시킬 수 있기 때문에, 합성에 실패합니다. pH가 사양을 충족하지 않는 경우 tC18 카트리지는 4.7단계와 4.8단계 사이의 멸균수 10mL로 선택적으로 폐기병에 헹구어질 수 있습니다.
그림 1: [11 C]PiB에 의한[11C]PiB의6-OH-BTA-0 전구체의 11C-메틸화[11C]CH3OTf. [11C]PiB는 연관된 아밀로이드 플라크의 이미징을 위해 가장 널리 사용되는 방사성 추적제 중 하나입니다. 애완 동물에 의해 AD 및 기타 신경 퇴행성 조건. 이 트레이서는 일반적으로 용액 또는 건조 HPLC 주입 루프 (용매)에서[11C]CH3 OTf)를 사용하여 6-OH-BTA-0이라고 불리는아니라인 전구체의11C-메틸화를 통해 일반적으로 합성됩니다. 포로 기술). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: tC18 카트리지상에서[11C]PiB의 단계별 합성 및 정제. (A)기체[11C]CH3 OTf는 6-OH-BTA-0으로 로드된 카트리지를 통과한다. 4.1 단계 및 4.2에 기재된 바와 같이,[11C]CH3OTf는 전구체를 함유하는 카트리지상에 갇혀 실온에서 전구체와 2분 동안 반응한다.(B)세척 1 또는 세척 2용액이 디스펜서 주사기내로 인출된다. 단계 4.3에서 설명한 바와 같이, 모듈의 주사기 펌프는 클리핑된 주사기의 플런저를 위쪽으로 당겨, 매니폴드의 포트 1에 연결된 라인을 통해 어느 용리액의 용액을 인출한다. (C)불순물이 폐병으로 씻어 낸다. 4.4 단계에서 설명한 바와 같이, 모듈의 주사기 펌프는 클리핑된 주사기의 플런저를 아래쪽으로 이동시켜, 매니폴드의 1, 3 및 4포트를 통해 tC18 카트리지를 통해 철회된 세척 용액을 폐병으로 밀어 넣는다. 도면B 및 C에 표현된 단계는 4.5- 4.7 단계에 설명된 바와 같이 카트리지로부터 모든 미반응 물질을 세척하기 위해 주기에서 여러 번 반복된다. (D)[11C]PiB는멸균 필터를 통해 멸균 바이알로 최종 용리토로 용출된다. 단계 4.8 및 4.9에 설명된 바와 같이, 주사기 펌프로 클리핑된 주사기는 라인에서 분리되고 먼저 50% 수성 에탄올의 2.5 mL를 함유하는 10 mL 주사기로 대체된다. 매니폴드의 포트 5는 멸균 바이알을 향해 전환되고[11C]PiB는 tC18로부터 수동으로 용출된다. 빈 주사기는 멸균 인산 완충액 10 mL을 포함하는 다른 주사기로 대체되고 전체 내용체는 4.10 단계에서 설명된 대로 라인을 헹군 tC18을 통해 밀려나게 됩니다. 멸균 바이알은 이제 12.5 mL 10% 완충 형 에탄올 용액에[11C]PiB를 함유하고 있다. 이 수치는 부제멜린 외12에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: [11C]PiB의품질 관리 분석 HPLC. (A)[11C]CH3OH(11C]CH3OTf의 가수 분해로부터, 미반응[11C]CH3OTf 및 추적자[11C]PiB의 방사능 크로마토그램의 보존 시간은 2.1, 4.0 및 6.6 분이며, 각각. 방사능 추적의 분석은[11C]PiB의 RCP가 98.0%임을 나타낸다. (B)UV 크로마토그램상에서 6-OH-BTA-0(전구체)과 6-OH-BTA-1(트레이서 피크)의 체류 시간은 각각 3.6 및 5.9분이다. UV 트레이스의 분석은 허용 한계(1.3 μg) 이하의 잔류 전구체 농도 및 기타 비방사성 불순물의 부재를 나타낸다. 따라서, 트레이서의 방사성 화학적 및 화학적 순도는 임상 PET 연구에 허용된다. HPLC 조건 - 컬럼(재료 표):5 μm, 100 x 4.0 mm; 모바일 단계: 40:60 아세토니트릴/물 유량: 0.7 mL/min. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 4: 6-OH-BTA-0 전구체 량의 최적화. 최저량(0.1 mg)은 18.1±3.8%의 적당한 방사성 화학수율(RCY)에서[11C]PiB를 제공한다. 0.2 mg에서 시작되는 방사합성은[11C]PiB의 RCY를 22.0±3.1%로 증가시키면서, 0.3 mg으로 증가시키면서 RCY를 32.1±3.7%로 더욱 향상시키고, 최종 제품에서 전구체의 약간 더 높은 양을 희생한다. 모든 RCY는 tC18 카트리지에 갇힌 [11C]CH3 OTf의 방사능으로부터시작하여부패(10분의방사성 합성 시간)에 대해 보정되지 않는다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: [11C]ABP688의 품질 관리 분석 HPLC. (a)방사능 크로마토그램은 98.1%의 RCP(E)-와(Z)-[11 C]의 RCP를 나타낸다. (B)UV 크로마토그램은 잔류 전구체 농도를 10 μg 이상으로 나타낸다. 화학적 순도는 임상 PET 연구에서 허용될 수 있지만, 상대적으로 낮은 효과적인 몰활성(A m < 37 GBq/μmol)은 추가적인 정제 최적화를 필요로 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 일괄 처리 | 실행 1 | 실행 2 | 실행 3 | 4 실행 |
| 【11C 】 CH3OTf, GBq | 9.21 | 11.25 | 7.84 | 6.44 |
| 【11C 】 PiB, GBq | 2.26 | 2.37 | 2.11 | 1.41 |
| RCY, %* | 24.5 | 21.1 | 26.9 | 21.8 |
| RCP, % | 98 | 97.2 | 97.8 | 99.2 |
| 어금니 활동, GBq/μmol | 154.6 | 322.6 | 121.1 | 162.1 |
| 잔류 전구체, μg | 0.32 | 0.55 | 0.58 | 0.87 |
| Ph | 5 | 5 | 5 | 5 |
| EtOH 콘텐츠, % | 9.4 | 8.8 | 7.7 | 8.1 |
| 아세톤 함량, ppm | 33 | 38 | 46 | 33 |
| 베팅 테스트 | 해당/A | 10 EU/mL | 10 EU/mL | 10 EU/mL |
| 불임 검사 | 해당/A | 성장 없음 | 성장 없음 | 성장 없음 |
| * 각주 : [11C]CH3OTf에서, 부패에 대한 수정되지 않음 | ||||
표 1. [11C]PiB 생산의 대표적인 결과는 최적화된 조건에서 실행됩니다. 모든 배치는 임상 PET 연구를 위한 트레이서에 대한 요구 사항을 준수합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
플로베타피르, 플로르베타벤 및 플루메타몰과 같은 18개의F 라벨이 부착된 PET 트레이서의 최근 출현 및 FDA 승인에도불구하고[11C]PiB는 빠른 뇌 섭취와 낮은 비특이성 으로 인해 아밀로이드 이미징을 위한 골드 표준 트레이서로 남아 있습니다. 바인딩. 현재 이 트레이저는 습식 화학16을 통해 합성되거나 "드라이 루프" 접근법4,17을사용하여 합성된다. 두 방법 모두 HPLC 정제를 요구하고 수성 에탄올에서 재제형이 필요하며, 이는[11C]CH3OTf로부터 시작하여 약 20-30분이 소요된다. 고체 상에 대한 이전 보고서의 일부에 의해 영감을 11C-메틸화 기술과[11C]PiB의 임상 중요성, 우리는 저렴한 일회용 고체 상 추출을 사용하여이 추적자의 방사성 합성을 개발하는 것을 목표로 ( SPE) 반응, 정제 및 제형을 위한 "3-in-1" 엔티티로서 카트리지.
인간 피험자에서 생체 내 이미징을 위한 PET 트레이서의 성공적인 생산을 위한 가장 중요한 단계는 다음과 같습니다: 1) 방사성 동위원소를 트레이서 분자에 통합하는 단계; 2) 미반응 방사성 및 비방사성 종으로부터 트레이서의 분리; 3) 생물학적으로 호환되는 용매에서 트레이서의 재제형; 4) 품질 관리 절차 준수. 이전에 보고된 용매 포로 방법에 기초하여, 우리는 SPE 지원 기술이 용액의 11C-메틸화에 비해 더 적은 양의 전구체를 필요로 할 것으로 예상했다. 특히, 이전에 보고된 용매 포로 절차는[11C]PiB의 전구체4,17의0.5-1.0 mg을 필요로 한다. 따라서, 우리는[11C]CH3OTf로부터 시작하여 6-OH-BTA-0: 0.1, 0.2, 및 0.3 mg의 부패 방사성 화학수율에 대해 보정되지 않은 것을 조사하였다. 가장 낮은 양(0.1 mg)조차도 상대적으로 낮고 신뢰성이 낮은 RCY(18.1±3.8%)에도 불구하고[11C]PiB의 적당한 양을 제공한다. 0.2 mg에서 시작되는 방합성은[11C]PiB (22.0±3.1%)의 RCY를 제공하며, 양을 0.3 mg으로 증가시키면서 RCY(32.1±3.7%)를 더욱 향상시키고, 최종 제품에서 전구체의 양이 약간 더 높다는 것을 희생한다. 모든 경우에, 방사능 은 10 분 안에 완료되었다. 따라서, 최적의 전구체 양은 특정 PET 센터에서[11C]PiB의 원하는 RCY 및 순도에 의존한다. 전구체 량을 기반으로 한 방사성 화학적 수율 최적화 실험의 결과는 도 4에요약되어 있다. 특히, 방사성 합성 시도는[11C]CH3I를 메틸화제 또는 에탄올반응용매로서 사용하여 원하는 [11C]PiB(데이터는 도시되지 않음)를 산출하지 않았다.
짧은 SPE 카트리지상에서 의 방사성 반응 혼합물의 정량적 분리는 기술 기술의 가장 어려운 부분이었다. 우리는 방향족 아민 6-OH-BTA-0 및 6-OH-BTA-1이 주로 산성 매체에 있는 그들의 protonated 양식에서 존재하고 그러므로 역상 고체 상에서 선명한 용출 단면도가 있을 것이라는 것을 가설을 세워졌습니다. 따라서, 모든 수성 에탄올 용액은 pH 3.7에서 0.2 M 아세테이트 버퍼를 사용하여 제조하였다. 다음으로, EtOH 농도가 최대 15%까지 수성 에탄올 용액이 미반응 전구체 6-OH-BTA-0 및[11C]CH3OTf를 점차적으로 용해시키고, 방사성 라벨이 붙은 상태에서[11C]PiB는 tC18 카트리지에 갇혀 있는 것으로 판단하였다. 최종 트레이서 제형으로 이러한 불순물의 꼬리를 방지하기 위해 에탄올 농도는 그라데이션 용출에서 12.5%에서 15%로 증가하였다. 모든 불순물을 카트리지밖으로 세척한 후, 트레이서 용출은 농축 된 에탄올 용액 (50 %)의 최소 량 (2.5 mL)을 사용하여 달성되었다. 에탄올 함량을 10% 한계 이하로 유지하고 인간 주입을 위한 허용 범위 내에서 제형 트레이서의 pH를 가져오기 위해(4-8), 트레이서를 멸균 인산완충액으로 희석하였다.
조건 최적화에 따라,[11C]PiB의 방사성 합성은 디스펜서 주사기 및 일회용 매니폴드가 장착된 시판되는 자동 합성 유닛(ASU)을 사용하여 자동화되었다. 이 특정 ASU에 대한 매니폴드 설정은 단계 3.1 - 3.5에 설명된 대로 간단합니다. 특히, 이 방법론은 위에서 설명한 레시피를 따르는 대부분의 다른 ASU에서 쉽게 구현할 수 있습니다. 최적화된 조건하에서 임상 적용에 적합한[11C]PiB의 배치는 1.4 에서 2.4 GBq (38 - 61 mCi)에 이르는 최종 활동으로 합성됩니다.
최근에는[11C]ABP688, 메타보트로픽 글루타메이트 수용체 유형 5(mGlu5)18,19의이미징을 위한 PET 트레이서의 방사성 라벨링에 "3-in-1" 기술을 적용하였다. 이 트레이서의 방사성 합성은 옥시메에서 -OH 기의 11C-메틸화에 의존; 따라서 데스메틸 전구체를 탈보화하기 위해 베이스를 첨가해야 합니다. 테트라부틸람모늄 수산화물(MeOH에서 1M 용액으로서)은 대부분의 극성 유기 용매에 용해되기 때문에 염기체로 선택되었다. 예비 방사성 라벨링 실험에서, DMSO(100 μL)에서 전구체(0.5 mg)의 용액을 MeOH(20 μL)에서 1M TBAOH와 혼합하고 상기와 같이 tC18 카트리지에 신중하게 적용하였다(단계 2.4 참조). 기체[11C]CH3단계 4.1-4.2에 기재된 바와 같이 카트리지를 통과하고 반응을 5분 동안 실온에서 진행하도록 허용하였고, 0.2M 중탄산나트륨 완충액에서 희석 된 에탄올 용액을 가진 순차적 용출 (pH 8.5 - 9.0) - 15% EtOH의 92 mL 다음에 20% EtOH의 92 mL-미반응[11C]CH3I 및 잔류 전구체를 세척하였다. 방사성 화학적으로 순수한[11C]ABP688 (RCY = 18.2%, RCP >98.0%) 이어서 단계 4.9-4.11에 기재된 바와 같이 멸균 필터를 통해 동일한 완충액에서 50% EtOH 용액을 용출하였다. 전구체의 98 % 이상이 희석 된 에탄올 워시로 제거된다는 사실에도 불구하고 최종 추적기 (최대 20 μg)에서 일부 미반응 전구체가 존재하므로 방사성 합성 절차의 추가 최적화가 필요합니다. 이 최적화는 진행 중이며 이 프로젝트의 결과는 적절한 절차에 따라 게시됩니다. [11C]ABP688 배치의 대표적인 분석적HPLC UV 및 방사능 크로마토그램은 도 5에도시되어 있다.
결론적으로, 우리는 임상에 사용되는 PET 추적기의 방사성 합성, 정화 및 제형을 위한 "3-in-1" 엔티티로서 쉽게 구할 수 있는 저렴한 SPE 카트리지를 사용하여 효율적인 고체 상 지원 탄소-11 방사성 라벨링 절차를 개발했습니다. 이미징. 인간 주입에 적합한 트레이서는 높은 RCY 및 몰 활성에서 11C-메틸화제([[11 C]CH3OTf 또는[11C]CH3 I)를 첨가한 후 10분 이내에 생산된다. 당사는 이 기술을 완전히 자동화하여 보건 및 방사선 안전 당국이 부과하는 우수 제조 관행(GMP) 규정을 준수하도록 했습니다. 고체 상 지원 방사성 합성은 낮은 양의 전구체를 필요로하며, 독성 용매의 사용을 피하고, 인력에 의해 지속되는 합성 시간 및 방사선 량을 감소시이다. 또한 HPLC 관련 고장을 방지하면 방합성 신뢰성이 향상되고 일상적인 추적자 생산을 위한 일회용 키트를 개발할 수 있습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 그들이 경쟁 적인 재정적 이익이 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
이 연구는 부분적으로 보조금에 의해 지원 되었다 18-05 캐나다의 알 츠 하이 머 학회에서 (A. K.에 대 한) 그리고 건강 캐나다에서 지원 으로 뇌 캐나다 재단. 저자는 의학의 맥길 대학 학부를 인정하고 싶습니다, 몬트리올 신경 학회와 맥코넬 뇌 이미징 센터는이 작품의 지원을 위해. 또한 모니카 라카투스-사모일라 부인에게 품질 관리 절차에 도움을 주신 것에 대해 감사드리며, 장 폴 수시 박사와 가산 마사웨 박사는 방사성 동위원소와 방사성 화학 시설에 접근할 수 있게 해 주었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-OH-BTA-0 | ABX advanced biochemical compounds | 5101 | Non-radioactive precursor of [11C]PiB |
| 6-OH-BTA-1 | ABX advanced biochemical compounds | 5140 | Non-radioactive standard of [11C]PiB |
| Agilent 1200 HPLC system | Agilent | Agilent 1200 | Analytical HPLC system |
| Ethanol absolute | Commercial alcohols | 432526 | |
| Hamilton syringe (luer-tip, 250 µL) | Hamilton | HAM80701 | |
| MZ Analytical PerfectSil 120 | MZ-Analysentechik GmbH | MZ1440-100040 | Analytical HPLC column |
| Perkin Elmer Clarus 480 GC system | Perkin Elmer | Clarus 480 | Gas chromotograph |
| polycarbonate manifold | Scintomics | ACC-101 | Synthesis manifold |
| Restek MTX-Wax column (30 m, 0.53 mm) | Restek | 70625-273 | Analytical GC column |
| Scintomics GRP module | Scintomics | Scintomics GRP | Automated synthesis unit |
| Sep-Pak tC18 Plus | Waters | WAT020515 | Solid phase extraction cartridge |
| solvent-resistant manifold | Scintomics | ACC-201 | Synthesis manifold |
| Spinal needle | BD | 405181 | |
| Sterile extension line | B. Braun | 8255059 | |
| Sterile filter | Millipore | SLLG013SL | |
| Sterile vial (20mL) | Huayi | SVV-20A | |
| Sterile water | Baxter | JF7623 | |
| Synthra MeIplus Research | Synthra | MeIplus Research | [11C]CH3I/[11C]CH3OTf module |
| Syringe (10 mL) | BD | 309604 | |
| Syringe (1mL) | BD | 309659 | |
| Syringe (20 mL) | B. Braun | 4617207V | Dispenser syringe |
| Vent filter | Millipore | TEFG02525 |
References
- Langstrom, B., Lundqvist, H. The preparation of 11C-methyl iodide and its use in the synthesis of 11C-methyl-L-methionine. The International journal of applied radiation and isotopes. 27 (7), 357-363 (1976).
- Larsen, P., Ulin, J., Dahlstrøm, K., Jensen, M. Synthesis of [11C]iodomethane by iodination of [11C]methane. Applied radiation and isotopes. 48 (2), 153-157 (1997).
- Jewett, D. M. A simple synthesis of [11C]methyl triflate. International journal of radiation applications and instrumentation. Part A, Applied radiation and isotopes. 43 (11), 1383-1385 (1992).
- Wilson, A. A., Garcia, A., Houle, S., Vasdev, N. Utility of commercial radiosynthetic modules in captive solvent [11C]-methylation reactions. Journal of Labelled Compounds and Radiopharmaceuticals. 52 (11), 490-492 (2009).
- Wilson, A. A., Garcia, A., Jin, L., Houle, S. Radiotracer synthesis from [(11)C]-iodomethane: a remarkably simple captive solvent method. Nuclear medicine and biology. 27 (6), 529-532 (2000).
- Fedorova, O. S., Vaitekhovich, F. P., Krasikova, R. N. Automated Synthesis of [18F]Fluoromethylcholine for Positron-Emission Tomography Imaging. Pharmaceutical Chemistry Journal. 52 (8), 730-734 (2018).
- Jewett, D. M., Ehrenkaufer, R. L., Ram, S. A captive solvent method for rapid radiosynthesis: application to the synthesis of [1-(11)C]palmitic acid. The International journal of applied radiation and isotopes. 36 (8), 672-674 (1985).
- Watkins, G. L., Jewett, D. M., Mulholland, G. K., Kilbourn, M. R., Toorongian, S. A. A captive solvent method for rapid N-[11C]methylation of secondary amides: application to the benzodiazepine, 4'-chlorodiazepam (RO5-4864). International journal of radiation applications and instrumentation. Part A, Applied radiation and isotopes. 39 (5), 441-444 (1988).
- Hockley, B. G., Henderson, B., Shao, X. Chapter 27, Synthesis of {11C]Raclopride. Radiochemical Syntheses. , John Wiley & Sons. 167-175 (2012).
- Lodi, F., et al. Reliability and reproducibility of N-[11C]methyl-choline and L-(S-methyl-[11C])methionine solid-phase synthesis: a useful and suitable method in clinical practice. Nuclear Medicine Communications. 29 (8), 736-740 (2008).
- Jolly, D., et al. Development of "[(11)C]kits" for a fast, efficient and reliable production of carbon-11 labeled radiopharmaceuticals for Positron Emission Tomography. Applied radiation and isotopes. 121, 76-81 (2017).
- Boudjemeline, M., et al. Highly efficient solid phase supported radiosynthesis of [(11) C]PiB using tC18 cartridge as a "3-in-1" production entity. Journal of Labelled Compounds and Radiopharmaceuticals. 60 (14), 632-638 (2017).
- Mathis, C. A., et al. A lipophilic thioflavin-T derivative for positron emission tomography (PET) imaging of amyloid in brain. Bioorganic and medicinal chemistry letters. 12 (3), 295-298 (2002).
- Mathis, C. A., et al. Synthesis and evaluation of 11C-labeled 6-substituted 2-arylbenzothiazoles as amyloid imaging agents. Journal of medicinal chemistry. 46 (13), 2740-2754 (2003).
- Buffer Reference Center. , Sigma Aldrich. Available from: https://www.sigmaaldrich.com/life-science/core-bioreagents/biological-buffers/learning-center/buffer-reference-center.html (2019).
- Philippe, C., Mitterhauser, M., Wadsak, W. Chapter 18, Synthesis of 2-(4-N-[11C]Methylaminophenyl)-6-Hydroxybenzothiazole ([11C]6-OH-BTA-1; [11C]PIB). Radiochemical Syntheses. , John Wiley & Sons. 177-189 (2012).
- Shao, X., Fawaz, M. V., Jang, K., Scott, P. J. H. Synthesis and Applications of [11C]Hydrogen Cyanide. Radiochemical Syntheses. , John Wiley & Sons. 207-232 (2015).
- Ametamey, S. M., et al. Radiosynthesis and preclinical evaluation of 11C-ABP688 as a probe for imaging the metabotropic glutamate receptor subtype 5. Journal of Nuclear Medicine. 47 (4), 698-705 (2006).
- Ametamey, S. M., et al. Human PET studies of metabotropic glutamate receptor subtype 5 with 11C-ABP688. Journal of Nuclear Medicine. 48 (2), 247-252 (2007).
