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Chemistry

Fase sólida 11C-Metilación, purificación y formulación para la producción de trazadores PET

Published: October 24, 2019 doi: 10.3791/60237
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1,2
1McConnell Brain Imaging Centre, Montreal Neurological Institute, McGill University, 2Department of Neurology and Neurosurgery, McGill University
* These authors contributed equally

Summary

Reportamos una técnica eficiente de radioetiquetado carbono-11 para producir trazadores clínicamente relevantes para la tomografía por emisión de positrones (PET) utilizando cartuchos de extracción de fase sólida. 11 El agente metilante C se pasa a través de un cartucho precargado con elución precursora y sucesiva con etanol acuoso proporciona trazadores PET química y radioquímicamente puros en altos rendimientos radioquímicos.

Abstract

La producción rutinaria de radiosondas utilizada en la tomografía por emisión de positrones (PET) se basa principalmente en la química húmeda donde el sintetizador radiactivo reacciona con un precursor no radiactivo en solución. Este enfoque requiere la purificación del trazador mediante cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) seguida de reformulación en un disolvente biocompatible para administración humana. Recientemente desarrollamos un novedoso enfoque de 11C-metilación para la síntesis altamente eficiente de radiofármacos PET etiquetados con carbono-11, aprovechando los cartuchos de fase sólida como unidades desechables "3-en-1" para la síntesis, purificación y reformulación de los trazadores. Este enfoque evita el uso de HPLC preparativo y reduce las pérdidas del trazador en las líneas de transferencia y debido a la descomposición radiactiva. Además, la técnica basada en cartuchos mejora la fiabilidad de la síntesis, simplifica el proceso de automatización y facilita el cumplimiento de los requisitos de Buenas Prácticas de Manufactura (GMP). Aquí, demostramos esta técnica en el ejemplo de la producción de un trazador PET compuesto de Pittsburgh B ([11C]PiB), un agente de imagen in vivo estándar de oro para placas amiloideas en los cerebros humanos.

Introduction

La tomografía por emisión de positrones (PET) es una modalidad de imagen molecular que se basa en la detección de la descomposición radiactiva de un isótopo unido a una molécula biológicamente activa para permitir la visualización in vivo de procesos bioquímicos, señales y transformaciones . El carbono-11 (t1/2 x 20,3 min) es uno de los radioisótopos más utilizados en PET debido a su abundancia en moléculas orgánicas y vida media corta que permite múltiples administraciones de trazador en el mismo día al mismo sujeto humano o animal y reduce la carga de radiación en los pacientes. Muchos trazadores etiquetados con este isótopo se utilizan en estudios clínicos y en investigaciones básicas de salud para imágenes IN vivo PET de objetivos clásicos y emergentes biológicamente relevantes - [11C]raclopride para receptores D2/D3, [11C] PiB para placas amiloideas, [11C]PBR28 para proteína transclodor - por nombrar sólo unos pocos.

Los trazadores PET etiquetados con carbono-11 se producen predominantemente a través de 11grupos C-metilación de precursores no radiactivos que contienen -OH (alcohol, fenol y ácido carboxílico), -NH (amina y amida) o -SH (tiol). En resumen, el isótopo se genera en el objetivo de gas de un ciclotrón a través de una reacción nuclear de 14N(p,o)11C en forma química de [11C]CO2. Este último se convierte entonces en [11C]yoduro de metilo ([11C]CH3I) a través de la química húmeda (reducción a [11C]CH3OH con LiAlH4 seguido de temple con HI)1 o seco química (reducción catalítica a [11C]CH4 seguida de yodiminación radical con molecular I2)2. [11C] CH3A continuación, puedo convertirse en el triflato más reactivo 11C-metil ([11C]CH3OTf) pasándolo sobre una columna triflada de plata3. La metilación 11C se realiza entonces burbujeando el gas radiactivo en una solución de precursor no radioactivo en disolvente orgánico o a través del método de "bucle" de disolvente cautivo más elegante4,5. El trazador C 11se purifica por medio de HPLC, se reformula en un disolvente biocompatible y se pasa a través de un filtro estéril antes de ser administrado a sujetos humanos. Todas estas manipulaciones deben ser rápidas y fiables dada la corta vida media de carbono-11. Sin embargo, el uso de un sistema HPLC aumenta significativamente las pérdidas del trazador y el tiempo de producción, a menudo requiere el uso de disolventes tóxicos, complica la automatización y ocasionalmente conduce a sintetizaciones fallidas. Además, la limpieza necesaria de los reactores y la columna HPLC prolonga los retrasos entre las síntesis de los lotes de trazadores posteriores y aumenta la exposición del personal a la radiación.

La radioquímica del flúor-18 (t1/2 a 109,7 min), el otro isótopo PET ampliamente utilizado, se ha avanzado recientemente mediante el desarrollo de kits basados en casetes que obvian la necesidad de purificación de HPLC. Mediante el empleo de cartuchos de extracción de fase sólida (SPE), estos kits totalmente desechables permiten la producción rutinaria confiable de 18trazadores F, incluyendo [18F]FDG, [18F]FMISO, [18F]FMC y otros, con síntesis más corta reducción de la participación del personal y mantenimiento mínimo del equipo. Una de las razones por las que carbon-11 sigue siendo un isótopo menos popular en las imágenes PET es la falta de kits similares para la producción rutinaria de 11trazadores C. Su desarrollo mejoraría significativamente la fiabilidad sintética, aumentaría los rendimientos radioquímicos y simplificaría la automatización y el mantenimiento preventivo de los módulos de producción.

Los kits de producción disponibles actualmente aprovechan los cartuchos SPE baratos y desechables en lugar de las columnas HPLC para la separación de la radiosonda de isótopos radiactivos, precursores y otros subproductos radiactivos y no radiactivos no reaccionados. Idealmente, la reacción de radioetiquetado también procede en el mismo cartucho; por ejemplo, la[18F]fluoromethylation de dimetilaminoetanol con gaseoso [18F]CH2BrF en la producción de marcador de IMAGEN de cáncer de próstata PET trazación [18F]fluorometilcolina se produce en un cartucho de resina de intercambio catiónico 6. Aunque procedimientos similares para el etiquetado radioeléctrico de varios 11c-trazadores en cartuchos se han reportado7,8 y se convirtió en especialmente potente para la radiosíntesis de [11C]colina9 y [11C]metionina10, estos ejemplos permanecen limitados a trazadores ONcológicos PET donde a menudo no se requiere la separación del precursor. Recientemente informamos del desarrollo de "[11C]kits" para la producción de [11C]CH3I11 y posterior 11C-metilación, así como síntesis sólida apoyada en fase12 en nuestros esfuerzos por simplificar la producción rutinaria de 11trazadores C. Aquí, queremos demostrar nuestros progresos utilizando el ejemplo de la radiosíntesis apoyada en fase sólida de [11C]PiB, una radiosonda para la imagen a A que revolucionó el campo de la enfermedad de Alzheimer (AD) cuando se desarrolló por primera vez en 2003 ( Figura 1) 13,14. En este método, volátil [11C]CH3OTf (bp 100 oC) se pasa sobre el precursor 6-OH-BTA-0 depositado en la resina de un cartucho desechable. El trazador PET [11C]PiB se separa de las impurezas precursoras y radiactivas por elución del cartucho con etanol acuoso biocompatible. Además, automatizamos este método de radiosíntesis [11C]PiB utilizando un módulo de síntesis de radioquímica operado a distancia y kits de casete desechables. Específicamente, implementamos esta radiosíntesis en un módulo de radioquímica de 20 válvulas, equipado con accionamiento de jeringa (dispensador) que se adapta a la jeringa de plástico desechable estándar de 20 ml, controlador de flujo de gas, bomba de vacío y medidor. Debido a la simplicidad de este método, estamos seguros de que se puede modificar a la mayoría de los sintetizadores automatizados disponibles comercialmente, ya sea a base de casete o a aquellos equipados con válvulas estacionarias. Esta técnica de soporte de fase sólida facilita la producción [11C]PiB compatible con las regulaciones de Buenas Prácticas de Manufactura (GMP) y mejora la fiabilidad de la síntesis. La técnica descrita aquí también reduce la cantidad de precursor necesario para la radiosíntesis, utiliza sólo disolventes biocompatibles "verdes" y disminuye el tiempo entre lotes de producción consecutivos.

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Protocol

1. Preparación de tampones y eluyentes

  1. Disolver 2,72 g de acetato de sodio trihidrato en 100 ml de agua para preparar 0,2 M de solución de acetato de sodio (solución A).
  2. Disolver 11,4 ml de ácido acético glacial en 1 L de agua para preparar 0,2 M de solución de ácido acético (solución B).
  3. Combinar 50 ml de solución A con 450 ml de solución B para preparar el búfer de acetato a pH 3,7 (buffer 1) según el centro de referencia del búfer15. Verifique el pH del tampón con tiras de pH o un medidor de pH.
  4. Combinar 12,5 ml de etanol absoluto con 87,5 ml de tampón 1 para hacer una solución EtOH acuosa al 12,5% (lavado 1) en una botella de 100 ml.
  5. Combine 15 ml de etanol absoluto con 85 ml de tampón 1 para hacer una solución EtOH acuosa al 15% (lavado 2) en una botella de 100 ml.
  6. Combine 5 ml de etanol absoluto con 5 ml de tampón 1 para hacer una solución EtOH acuosa al 50% (eluyente final) y extraiga 2,5 ml de esta solución en una jeringa de 10 ml.

2. Aplicación del precursor del cartucho

  1. Pasar 10 ml de agua seguido de 5 ml de acetona a través del cartucho tC18 para preacondicionarlo.
  2. Seque el cartucho con una corriente de nitrógeno a 50 ml/min durante 1 min.
  3. Disolver 2 mg del precursor 6-OH-BTA-0 en 1 mL de acetona anhidra.
  4. Sosteniendo una jeringa de vidrio de precisión Luer-tip de 250 l hacia abajo, retire 100 s de la solución precursora y 50 l de cojín de aire en la parte superior del líquido. Retire la aguja y aplique la solución precursora en el cartucho tC18 del extremo femenino empujando lentamente el émbolo hasta el fondo. ¡No empuje más la solución!

3. Configuración del colector para la síntesis automatizada

  1. Asegure el colector desechable estándar de 5 puertos en el módulo de síntesis y ensamblelo de acuerdo con la Figura 2 y los pasos 3.2 - 3.5 a continuación.
    NOTA: Recomendamos el uso de colectores resistentes a la acetona (consulte Tabla de materiales).
  2. El puerto 1 tiene dos posiciones. Conecte la entrada horizontal al dispensador automatizado equipado con una jeringa de 20 ml. Conecte la entrada vertical al frasco con el lavado 1.
  3. Conecte la salida del módulo que produce [11C]CH3OTf al puerto 2 del colector.
  4. Instale el cartucho tC18 cargado con el precursor 6-OH-BTA-0 entre los puertos 3 y 4.
  5. El puerto 5 tiene dos posiciones. Conecte la salida horizontal a la botella de residuos que debe contener al menos 200 ml. Conecte la salida vertical al vial estéril para la recogida del trazador a través del filtro estéril.

4. Radiosíntesis de [11C]PiB

ADVERTENCIA: Todas las manipulaciones relacionadas con isótopos radiactivos deben ser realizadas en una célula caliente blindada por plomo por personal con la formación adecuada para trabajar con materiales radiactivos.
NOTA: Este protocolo no cubre los detalles de la producción de [11C]CO2 en el ciclotrón y su conversión en [11C]CH3OTf utilizando el módulo de radioquímica. Estos procedimientos dependerán del equipo individual del laboratorio de radioquímica y están fuera del alcance de este protocolo. Nuestro centro PET está equipado con un ciclotrón IBA, que produce carbono-11 en forma química de [11C]CO2a través de la reacción nuclear de 14N(p,o)11C con una mezcla de gas N2/O2 (99.5:0.5) en el gas objetivo, y un módulo disponible comercialmente para la producción de [11C]CH3I a través del "método seco" (reducción catalítica a [11C]CH4 seguida de iodiminación radical). [11C] CH3OTf se produce pasando [11C]CH3I sobre una columna de triflos de plata calentada a 175 oC a 20 ml/min.

  1. Entregue [11C]CH3OTf en el colector a través del puerto 2 y pase a través del cartucho tC18 cargado a un flujo de salida de 20 ml/min regulado por el módulo [11C]CH3OTf, a través de los puertos 3 y 4 y en la botella de residuos como se muestra en Figura 2A.
  2. Una vez que toda la radiactividad se ha transferido y atrapado en el cartucho tC18 según lo monitoreado por el detector de radiactividad detrás del soporte del cartucho, detenga el flujo de gas cerrando el puerto 2. Deje que el cartucho se quede durante 2 minutos para completar la reacción.
  3. Extraer 19 ml de solución de lavado 1 (ver paso 1.4) del frasco de 100 ml en la jeringa dispensadora a través del puerto 1 a 100 ml/min, como se muestra en la Figura 2B.
  4. Dispensar 18,5 ml de solución de lavado 1 del dispensador a través del cartucho tC18 a través de los puertos 3 y 4 y en la botella de residuos a 50 ml/min como se muestra en la Figura 2C. Asegurar la ausencia de burbujas de aire en el colector, ya que podrían disminuir la eficiencia de separación.
  5. Repita los pasos 4.3 y 4.4 cuatro veces, retirando y dispensando 18,5 ml de lavado 1 solución cada vez. El volumen total de la solución de lavado 1 pasado a través de tC18 es de 92,5 ml; sin embargo, puede variar dentro del rango de 90 - 100 mL dependiendo del módulo de síntesis particular utilizado.
  6. Cambie la línea de entrada en el puerto 1 de lavado 1 a lavado 2 solución (ver paso 1.5).
  7. Repita los pasos 4.3 y 4.4 tres veces, retirando y dispensando 18,5 ml de solución de lavado 2 cada vez. El volumen total de la solución wash 2 pasada a través de tC18 es de 55,5 ml. Sin embargo, puede variar dentro del rango de 50 - 60 mL dependiendo del módulo de síntesis particular utilizado.
  8. Alternar la válvula 5 hacia el vial final como se muestra en la Figura 2D. Desconecte la línea del dispensador y conéctela a la jeringa de 10 ml que contiene 2,5 ml de la solución eluyente final (50% EtOH acuoso, ver paso 1.6) y 7,5 ml de aire.
  9. Sosteniendo la jeringa hacia abajo, empuje manualmente la solución eluyente final (2,5 ml) seguida de aire (7,5 ml) a través del cartucho tC18 a través de los puertos 3 y 4 y en el vial estéril para la recogida del trazador a través del filtro estéril como se muestra en la figura 2D.
  10. Desconecte la jeringa vacía, conecte la jeringa de 10 ml que contiene 10 ml del tampón de fosfato estéril (receta no incluida, ya que puede variar) y empuje todo el volumen a través del cartucho tC18 en el vial estéril como se ha descrito anteriormente(Figura 2D ). Desconecte la jeringa y enjuague la línea con 10 ml de aire utilizando la misma jeringa.
  11. Retirar 0,7 ml de la formulación final del trazador y recoger muestras para procedimientos de control de calidad (0,1 ml), prueba de endotoxina bacteriana (0,1 ml) y esterilidad (0,5 ml).

5. Procedimientos de control de calidad

ADVERTENCIA: Cada lote de la radiosonda debe someterse a los procedimientos de control de calidad (QC) adecuados antes de su liberación en el sitio de imágenes PET para su administración en sujetos humanos o animales. Los autores de este manuscrito no son responsables del cumplimiento de la radiosonda producida en otros centros con las regulaciones de las autoridades sanitarias locales.

  1. Realizar procedimientos de control de calidad previos a la liberación, que deben incluir pruebas de identidad radioquímica (RCI), pureza radioquímica (RCP), pureza química y actividad molar del trazador, así como contenido de disolvente residual y pH de la formulación.
  2. Determinar el RCI, RCP, pureza química y actividad molar por medio de un sistema hPLC analítico equipado con UV (monitoreo a 350 nm) y detectores de radiactividad, y una columna de fase invertida. Determinar los tiempos de retención de 6-OH-BTA-0 y 6-OH-BTA-1 y calibrar el instrumento para cuantificar el contenido de cada compuesto.
  3. Determinar el contenido residual de disolventemediante según el sistema de cromatografía analítica de gases equipado con una columna capilar. Determinar los tiempos de retención de acetona y etanol y calibrar el instrumento para cuantificar el contenido de cada disolvente.
  4. Realice la prueba de endotoxinas bacterianas utilizando un lector de cartuchos equipado con cartuchos adecuados.
  5. Realizar el análisis de esterilidad de la muestra al menos 14 días después de la síntesis para asegurar la ausencia de crecimiento bacteriano o enviar la muestra de esterilidad a un laboratorio acreditado por la autoridad sanitaria local.

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Representative Results

Para resumir una radiosíntesis típica de [11C]PiB, gaseoso [11C]CH3OTf se pasa primero a través de un cartucho tC18 precargado con una solución de precursor (Figura 1). La separación de la mezcla de reacción se logra entonces mediante la elución sucesiva con soluciones de etanol acuoso de la siguiente manera. En primer lugar, el 12,5% EtOH eluye la mayoría de losSoluciónde OTfy6-OH-BTA-0 no reaccionados, luego el 15% EtOH lava las impurezas residuales, y finalmente una solución de etanol del 50% elue el deseado [11C]PiB en un vial estéril. El trazador se diluye con tampón de fosfato estéril y se somete a estrictos procedimientos de control de calidad antes de su liberación en el sitio de imágenes PET. Los cromatogramas hPLC UV y radioactividad típicos del lote [11C]PiB adecuado para la administración están representados en la Figura 3.

El tiempo total de radiosíntesis es de 10 minutos a partir de la entrega de [11C]CH3OTf, el RCY de [11C]PiB usando 0.2 mg de precursor es 22% (a partir de [11C]CH3OTf, no corregido para la descomposición) y la actividad molar es 190 GBq/mol. El trazador debe cumplir con todas las especificaciones de control de calidad de la unidad multicéntrico de ensayos de la red de alzheimer heredada dominantemente (DIAN-TU) para los ensayos clínicos: la pureza radioquímica debe estar por encima del 95%; el contenido de impurezas no radiactivas debe ser inferior a 1,3 g por dosis de 10 ml; el pH debe estar dentro del rango 4 - 8; y el contenido de etanol y acetona debe ser inferior al 10% y 3000 ppm, respectivamente. Las muestras también deben ser estériles y libres de endotoxinas. Los resultados de cuatro corridas típicas de radiosíntesis se resumen en el Cuadro 1.

Para que la técnica notificada funcione correctamente, se debe tener cuidado durante varios pasos críticos descritos anteriormente. Para aplicar el precursor en el cartucho tC18 (paso 2.4) la solución no debe empujarse hacia la salida, a fin de no acortar la trayectoria efectiva para la separación del [11C]PiB de los materiales de partida no reaccionados y los posibles productos secundarios. El caudal de [11C]CH3OTf a través de un cartucho durante la transferencia no debe superar los 20 ml/min (paso 4.1). Una vez que comienza la elución (paso 4.4), es muy importante mantener el cartucho húmedo y no dejar pasar el aire para evitar efectos de canalización que podrían resultar en una menor pureza del trazador o RCY inferior debido a las pérdidas de [11C]PiB en los residuos. Si el colector de 5 puertos utilizado en la radiosíntesis (paso 3.1) no es resistente a la acetona, como un colector de policarbonato estándar como ACC-101, la cantidad de acetona no debe exceder de 100 ml, ya que los volúmenes más grandes podrían dañar el colector durante la transferencia de actividad y resultado en una síntesis fallida. En caso de que el pH no cumpla con las especificaciones, el cartucho tC18 puede enjuagarse opcionalmente con 10 ml de agua estéril entre los pasos 4.7 y 4.8 en la botella de residuos.

Figure 1
Figura 1: La radiosíntesis de [11C]PiB por 11C-metilación del precursor 6-OH-BTA-0 con [11C]CH3OTf. [11C]PiB es uno de los radiosondas más utilizados para la toma de imágenes de placas amiloideas asociadas con AD y otras condiciones neurodegenerativas por PET. Este trazador se sintetiza comúnmente a través de 11C-metilación del precursor de anilina llamado 6-OH-BTA-0 usando [11C]metil triflate ([11C]CH3OTf) ya sea en solución o en el bucle de inyección HPLC seco (disolvente técnica cautiva). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Síntesis y purificación paso a paso de [11C]PiB en un cartucho tC18. (A) Gaseous [11C]CH3OTf se pasa a través del cartucho cargado con 6-OH-BTA-0. Como se describe en los pasos 4.1 y 4.2, [11C]CH3OTf queda atrapado en el cartucho que contiene el precursor y reacciona con el precursor a temperatura ambiente durante 2 min. (B) El lavado 1 o lavado 2 solución se retira en la jeringa dispensadora. Como se describe en el paso 4.3, la bomba de jeringa del módulo tira del émbolo de la jeringa recortada hacia arriba, retirando una solución de cualquiera de eluyente a través de una línea conectada al puerto 1 del colector. (C) Las impurezas se lavan en una botella de residuos. Como se describe en el paso 4.4, la bomba de jeringa del módulo mueve el émbolo de la jeringa recortada hacia abajo, empujando la solución de lavado retirada a través del cartucho tC18 a través de los puertos 1, 3 y 4 del colector en una botella de residuos. Los pasos representados en los diagramas B y C se repiten en un ciclo varias veces para lavar todos los materiales no reaccionados del cartucho, como se describe en los pasos 4.5 - 4.7. (D) [11C]PiB se eluye con el eluyente final en un vial estéril a través de un filtro estéril. Como se describe en los pasos 4.8 y 4.9, la jeringa se sujeta a una bomba de jeringa se desconecta de la línea y se reemplaza primero con una jeringa de 10 ml que contiene 2,5 ml de etanol acuoso al 50%. El puerto 5 del colector se alterna hacia el vial estéril y [11C]PiB se eluye del tC18 manualmente. A continuación, la jeringa vacía se sustituye por otra jeringa que contiene 10 ml de tampón de fosfato estéril y todo el contenido se empuja a través del tC18 para enjuagar las líneas como se describe en el paso 4.10. El vial estéril ahora contiene [11C]PiB en una solución de etanol acuoso tamposo de 12,5 ml 10%. Esta cifra ha sido modificada de Boudjemeline et al.12. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: HPLC analítico de control de calidad de [11C]PiB. (A) Los tiempos de retención de [11C]CH3OH (de hidrólisis de [11C]CH3OTf), no reaccionados [11C]CH3OTf, y tracer [11C]PiB en el cromatograma de radiactividad son 2.1, 4.0 y 6.6 min, Respectivamente. El análisis de la traza de radiactividad muestra que el RCP de [11C]PiB es 98,0%. (B) Los tiempos de retención de 6-OH-BTA-0 (precursor) y 6-OH-BTA-1 (pico de trazador) en el cromatograma UV son 3.6 y 5.9 min, respectivamente. El análisis de la traza UV muestra la concentración residual de precursores por debajo del límite aceptable (1,3 g) y la ausencia de otras impurezas no radiactivas. Por lo tanto, la pureza radioquímica y química del trazador es aceptable para los estudios clínicos de PET. Condiciones hPLC - columna(Tabla de materiales):5 m, 100 x 4,0 mm; fase móvil: 40:60 acetonitrilo / caudal de agua: 0,7 mL / min. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta cifra.

Figure 4
Figura 4: Optimización de la cantidad del precursor 6-OH-BTA-0. La cantidad más baja (0,1 mg) proporciona [11C]PiB en un rendimiento radioquímico moderado (RCY) de 18,1-3,8%. La radiosíntesis a partir de 0,2 mg proporciona [11C]PiB un RCY de 22,0 a 3,1%, mientras que el aumento de la cantidad a 0,3 mg mejora aún más el RCY a 32,1 -3,7%, a expensas de una cantidad ligeramente mayor del precursor en el producto final. Todos los RCY no se corrigen por descomposición (tiempo de radiosíntesis de 10 min) a partir de la radiactividad del OTf [11C]CH3atrapado en el cartucho tC18. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: HPLC analítico de control de calidad de [11C]ABP688. (A) El cromatograma de radiactividad muestra RCP de combined (E)- y (Z)-[11C]ABP688 del 98,1%. (B) el cromatograma UV muestra una concentración residual de precursores por encima de 10 g. Mientras que la pureza química podría ser aceptable para los estudios clínicos de PET, la actividad molar relativamente baja efectiva (Am < 37 GBq / mol) requiere una optimización de purificación adicional. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Lote Ejecutar 1 Ejecutar 2 Ejecutar 3 Ejecutar 4
[11C] CH3OTf, GBq 9.21 11.25 7.84 6.44
[11C] PiB, GBq 2.26 2.37 2.11 1.41
RCY, %* 24.5 21.1 26.9 21.8
RCP, % 98 97.2 97.8 99.2
Actividad molar, GBq/mol 154.6 322.6 121.1 162.1
Precursor residual, g 0.32 0.55 0.58 0.87
Ph 5 5 5 5
Contenido etOH, % 9.4 8.8 7.7 8.1
Contenido de acetona, ppm 33 38 46 33
Prueba BET N/A <10 EU/mL <10 EU/mL <10 EU/mL
Prueba de esterilidad N/A Sin crecimiento Sin crecimiento Sin crecimiento
* Nota al pie de página: A partir de [11C]CH3OTf, no corregido por descomposición

Tabla 1. Los resultados representativos de la producción de [11C]PiB se ejecutan en condiciones optimizadas. Todos los lotes cumplen con los requisitos para los trazadores destinados a estudios clínicos de PET.

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Discussion

A pesar de la reciente aparición y la aprobación por la FDA de varios 18marcadores PET con etiqueta F, como florbetapir, florbetaben y flutemetamol, [11C]PiB sigue siendo un marcador estándar de oro para imágenes amiloideas debido a la rápida aparición cerebral y baja inespecífico Vinculante. Actualmente este trazador se sintetiza a través de la química húmeda16 o utilizando un enfoque de "bucle seco"4,17. Ambos métodos requieren purificación de HPLC seguida de reformulación en etanol acuoso, que toma aproximadamente 20 - 30 minutos a partir de [11C]CH3OTf. Inspirados en algunos de los informes anteriores sobre fase sólida apoyado 11técnicas de c-metilación y la importancia clínica de [11C]PiB, nos propusimos desarrollar una radiosíntesis de este trazador utilizando la extracción de fase sólida desechable de bajo costo ( SPE) como entidad "3 en 1" para reacción, purificación y formulación.

Los pasos más críticos para la producción exitosa de marcadores de PET para la toma de imágenes in vivo en sujetos humanos son: 1) la incorporación del isótopo radiactivo en una molécula de trazador; 2) separación del trazador de especies radiactivas y no radiactivas no reaccionadas; 3) reformulación del trazador en un disolvente biológicamente compatible; 4) cumplimiento de los procedimientos de control de calidad. Basándonos en el método cautivo de disolvente notificado anteriormente, esperábamos que la técnica apoyada por SPE requeriría una menor cantidad de precursor en comparación con 11C-metilación en solución. En particular, los procedimientos cautivos solventes previamente notificados para la radiosíntesis de [11C]PiB requieren 0,5 - 1,0 mg del precursor4,17. Por lo tanto, investigamos no corregidos para rendimientos radioquímicos de descomposición de [11C]PiB a partir de [11C]CH3OTf en tres cantidades diferentes de 6-OH-BTA-0: 0.1, 0.2, y 0.3 mg. Incluso la cantidad más baja (0,1 mg) proporciona una cantidad moderada de [11C]PiB, aunque a RCY relativamente baja y menos confiable (18,1-3,8%). La radiosíntesis a partir de 0,2 mg proporciona un RCY de [11C]PiB (22,0 x 3,1%), mientras que el aumento de la cantidad a 0,3 mg mejora aún más RCY (32,1-3,7%), a expensas de una cantidad ligeramente mayor del precursor en el producto final. En todos los casos, la radiofensisisis se completó en 10 minutos. Por lo tanto, la cantidad óptima del precursor depende del RCY deseado y la pureza de [11C]PiB en centros PET particulares. Los resultados de los experimentos de optimización del rendimiento radioquímico basados en la cantidad de precursores se resumen en la Figura 4. En particular, los intentos de radiosíntesis utilizando [11C]CH3I como agente metilador o etanol como disolvente de reacción no produjeron el [11C]PiB deseado (datos no mostrados).

La separación cuantitativa de la mezcla de reacción de radiosíntesis en un cartucho SPE corto fue la parte más difícil de la técnica descrita. Hemos planteado la hipótesis de que las aminas aromáticas 6-OH-BTA-0 y 6-OH-BTA-1 existen predominantemente en sus formas protonadas en medios ácidos y, por lo tanto, tendrían perfiles de elución más nítidos de la fase sólida invertida. Por lo tanto, todas las soluciones de etanol acuoso se prepararon utilizando un tampón de acetato de 0,2 M a pH 3,7. A continuación, determinamos que las soluciones de etanol acuosa con concentración de EtOH hasta un 15% eluden gradualmente eluir el precursor no reaccionado 6-OH-BTA-0 y [11C]CH3OTf, mientras que la radioetiqueta [11C]PiB permanece atrapada en el cartucho tC18. Con el fin de evitar el relave de esas impurezas en una formulación de trazador final, la concentración de etanol se incrementó del 12,5% al 15% en una elución de gradiente. Después de que todas las impurezas se habían lavado fuera del cartucho, la elución del trazador se logró utilizando una cantidad mínima (2,5 ml) de la solución de etanol concentrado (50%). Con el fin de mantener el contenido de etanol por debajo del límite del 10% y para llevar el pH del trazador formulado dentro del rango aceptable para la inyección humana (4 - 8), el trazador se diluyó con tampón de fosfato estéril.

Después de la optimización de las condiciones, la radiosíntesis de [11C]PiB se automatizó utilizando una unidad de síntesis automatizada (ASU) disponible comercialmente, equipada con jeringa dispensadora y colector desechable. La configuración del colector para este ASU en particular es directa como se describe en los pasos 3.1 - 3.5. En particular, esta metodología se puede implementar fácilmente en la mayoría de los otros ASU disponibles siguiendo las recetas descritas anteriormente. En condiciones optimizadas, los lotes de [11C]PiB adecuados para la aplicación clínica se sintetizan con actividades finales que van desde 1,4 a 2,4 GBq (38 - 61 mCi).

Más recientemente, aplicamos la técnica "3-en-1" para el marcado radioeléctrico de [11C]ABP688, un trazador PET para la toma de imágenes de receptores de glutamato metabotrópicos tipo 5 (mGlu5)18,19. La radiosíntesis de este trazador se basa en la 11C-metilación del grupo -OH en el oxima; por lo tanto, se requiere la adición de base para desprotonar el precursor desmetil. El hidróxido de tetrabutilammonio (como solución de 1 M en MeOH) fue seleccionado como base porque es soluble en la mayoría de los disolventes orgánicos polares. En un experimento preliminar de radioetiquetado, se mezcló una solución de precursor (0,5 mg) en DMSO (100 l) con 1 M TBAOH en MeOH (20 l) y la mezcla se aplicó cuidadosamente en el cartucho tC18 como se describió anteriormente (ver paso 2.4). Gaseous [11C]CH3Me pasaron a través del cartucho como se describe en los pasos 4.1 - 4.2 y se permitió que la reacción continuara a temperatura ambiente durante 5 min. Elución secuencial con soluciones de etanol diluido en tampón de bicarbonato sódico de 0,2 M (pH 8,5 - 9.0) - 92 mL de 15% EtOH seguido de 92 mL de 20% EtOH - lavado el no reaccionado [11C]CH3I y precursor residual. Radioquímicamente puro [11C]ABP688 (RCY - 18,2%, RCP >98,0%) luego se eluyó con una solución de 50% EtOH en el mismo búfer a través de un filtro estéril como se describe en los pasos 4.9 - 4.11. A pesar del hecho de que más del 98% del precursor se elimina con lavados de etanol diluidos, la presencia de algún precursor no reaccionado en el trazador final (hasta 20 g) requiere una mayor optimización del procedimiento de radiosíntesis. Esta optimización está en curso, y los resultados de este proyecto se publicarán a su debido tiempo. Los cromatogramas analíticos representativos HPLC UV y radioactividad del lote [11C]ABP688 se muestran en la Figura 5.

En conclusión, hemos desarrollado un procedimiento eficiente de radioetiquetado carbono-11 compatible con fase sólida utilizando cartuchos de SPE baratos fácilmente disponibles como entidades "3 en 1" para radiosíntesis, purificación y formulación de trazadores PET utilizados para marcadores clínicos Imagen. Los trazadores adecuados para inyección humana se producen en un plazo de 10 minutos a partir de la adición de 11agentes de metilación C ([11C]CH3OTf o [11C]CH3I) en alta actividad de RCY y molar. Automatizamos completamente esta técnica para que cumpla con las regulaciones de Buenas Prácticas de Manufactura (GMP) impuestas por las autoridades de salud y seguridad radiológica. La radiosíntesis apoyada en fase sólida requiere una baja cantidad de precursor, evita el uso de disolventes tóxicos, disminuye el tiempo de síntesis y la dosis de radiación sostenida por el personal. Además, evitar fallos relacionados con HPLC mejora la fiabilidad de la radiofenesisa y permite el desarrollo de kits desechables para la producción rutinaria de trazadores.

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Disclosures

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Acknowledgments

Este estudio fue parcialmente apoyado por una subvención 18-05 de la Sociedad de Alzheimer de Canadá (para A. K.) y Brain Canada Foundation con el apoyo de Health Canada. Los autores quieren reconocer a la Facultad de Medicina de la Universidad McGill, el Instituto Neurológico de Montreal y el Centro de Imágenes Cerebrales McConnell por el apoyo a este trabajo. También damos las gracias a la Sra. Monica Lacatus-Samoila por su ayuda con los procedimientos de control de calidad y a los doctores Jean-Paul Soucy y Gassan Massarweh por el acceso a los radioisótopos y a las instalaciones de radioquímica.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6-OH-BTA-0 ABX advanced biochemical compounds 5101 Non-radioactive precursor of [11C]PiB
6-OH-BTA-1 ABX advanced biochemical compounds 5140 Non-radioactive standard of [11C]PiB
Agilent 1200 HPLC system Agilent Agilent 1200 Analytical HPLC system
Ethanol absolute Commercial alcohols 432526
Hamilton syringe (luer-tip, 250 µL) Hamilton HAM80701
MZ Analytical PerfectSil 120 MZ-Analysentechik GmbH MZ1440-100040 Analytical HPLC column
Perkin Elmer Clarus 480 GC system Perkin Elmer Clarus 480 Gas chromotograph
polycarbonate manifold Scintomics ACC-101 Synthesis manifold
Restek MTX-Wax column (30 m, 0.53 mm) Restek 70625-273 Analytical GC column
Scintomics GRP module Scintomics Scintomics GRP Automated synthesis unit
Sep-Pak tC18 Plus Waters WAT020515 Solid phase extraction cartridge
solvent-resistant manifold Scintomics ACC-201 Synthesis manifold
Spinal needle BD 405181
Sterile extension line B. Braun 8255059
Sterile filter Millipore SLLG013SL
Sterile vial (20mL) Huayi SVV-20A
Sterile water Baxter JF7623
Synthra MeIplus Research Synthra MeIplus Research [11C]CH3I/[11C]CH3OTf module
Syringe (10 mL) BD 309604
Syringe (1mL) BD 309659
Syringe (20 mL) B. Braun 4617207V Dispenser syringe
Vent filter Millipore TEFG02525

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References

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Química Número 152 carbono-11 radioetiquetado tomografía por emisión de positrones imágenes [11C]PiB [11C]ABP688 11C-metilación síntesis de fase sólida extracción de fase sólida automatización
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Singleton, T. A., Boudjemeline, M., Hopewell, R., Jolly, D., Bdair, H., Kostikov, A. Solid Phase 11C-Methylation, Purification and Formulation for the Production of PET Tracers. J. Vis. Exp. (152), e60237, doi:10.3791/60237 (2019).

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