Кохлеарная поверхность Подготовка в взрослой мыши
Summary
В этой статье представлен модифицированный метод подготовки кохлеарной поверхности, который требует декальцинации и использования клея клетки и ткани, чтобы придерживаться кусочков кохлеарной эпителии к 10 мм круглым крышкам для иммуногистохимии у взрослых улиток мыши.
Abstract
Слуховая обработка в улине зависит от целостности механосенсорных волосковых клеток. В течение жизни, потеря слуха может быть приобретена из многочисленных этиологий, таких как воздействие чрезмерного шума, использование ототоксических препаратов, бактериальных или вирусных инфекций уха, травмы головы, и процесс старения. Потеря сенсорных волосковых клеток является общей патологической особенностью разновидностей приобретенной потери слуха. Кроме того, синапс внутренней клетки волос может быть поврежден мягкимоскорбления. Поэтому поверхностные препараты кохлеарных эпителий, в сочетании с иммуномаркировкой и конфокальными изображениями, являются очень полезным инструментом для исследования кохлеарных патологий, включая потери ленточных синапсов и сенсорных волосковых клеток, изменения в уровнях белка в волосковых клетках и поддерживающих клетках, регенерация волосяных клеток и определение экспрессии генов отчета (т.е. GFP) для проверки успешной трансдукции и идентификации трансиндуцированных типов клеток. Улита, костлявая спиральная структура во внутреннем ухе, содержит слуховой сенсорный конечный орган, орган Корти (OC). Сенсорные волосковые клетки и окружающие поддерживающие клетки в ОК содержатся в кохлеарном протоке и покоятся на базилярной мембране, организованном тонотопическим способом с высокочастотным обнаружением, происходящим в основании и низкочастотным на вершине. С наличием молекулярной и генетической информации и способностью манипулировать генами нокаутом и стучать в методы, мыши были широко использованы в биологических исследованиях, в том числе в науке о слухе. Тем не менее, взрослая улитка мыши является незначительным, и кохлеарный эпителий инкапсулируется в костлявом лабиринте, что затрудняет микрорассеилосцию. Хотя методы вскрытия были разработаны и использованы во многих лабораториях, этот модифицированный метод микродиссекции с использованием клея клеток и тканей проще и удобнее. Он может быть использован во всех типах взрослых улиток мыши после декальцинации.
Introduction
Улишайка посвящена обнаружению звука и отвечает за слух. Кохлеарный проток сжимается в спиральной форме в костлявом лабиринте и содержит слуховой сенсорный конечный орган, орган Корти (OC). OC опирается на базилярную мембрану, составляющую кохлеарный эпителий, с длиной около 5,7 мм, когда рассеялся у взрослых cbA/CaJ мышей1,2. Поскольку OC тонотопически организован с высокими частотами, обнаруженными в основании и низких частотах в вершине, кохлеарный эпителий часто делится на три части для аналитических сравнений: пикические, средние и базальные повороты, соответствующие низким, среднего и высокочастотного обнаружения, соответственно. В дополнение к массиву поддерживающих клеток, OC состоит из одного ряда внутренних волосковых клеток (IHCs), расположенных медиально и трех рядов наружных волосковых клеток (OHCs), расположенных боково по отношению к кохлеарной спирали.
Правильная слуховая обработка зависит от целостности сенсорных волосковых клеток в улине. Повреждение или потеря сенсорных волосковых клеток является общей патологической особенностью приобретенной потери слуха, вызванной многочисленными этиологиями, такими как воздействие чрезмерного шума, использование ототоксических препаратов, бактериальных или вирусных инфекций уха, травмы головы и старение процесс3. Кроме того, целостность и функции внутренней клетки волос / слуховых нервных синапсов могут быть нарушены мягкими оскорблениями4. С наличием молекулярной и генетической информации и манипуляции генов нокаутом и стук в методы, мыши были широко использованы в науке о слухе. Хотя улитка для взрослых мышей мизерна, а кохлеарный эпителий окружен костлявой капсулой, что приводит к технически сложным микрорасделяциям, поверхностным препаратам эпителия в сочетании с иммуномаркировкой или иммуногистохимией и конфокальные изображения широко использовались для исследования кохлеарных патологий, включая потери ленточных синапсов и волосковых клеток, изменения в уровнях белков в сенсорных волосковых клетках и поддерживающих клетках, а также регенерацию волосяных клеток. Кохлеарные поверхностные препараты также использовались для определения модели экспрессии генов репортеров (т.е. GFP) и подтверждения успешной трансдукции и выявления трансиндуцированных типов клеток. Эти методы ранее были использованы для изучения молекулярных механизмов, лежащих в основе шума индуцированной потерей слуха с использованием взрослых CBA / J мышей5,6,7,8,9.
В отличие от иммуногистохимии с использованием парафиновых секций или криосекций для получения небольших поперечных частей улишки, которые содержат три внешние волосковые клетки (OHCs) и одну внутреннюю клетку волос (IHC) на каждом участке, кохлеарные препараты поверхности позволяют визуализация всей длины OC для подсчета сенсорных волосковых клеток и ленточных синапсов и иммуномаркировки сенсорных волосковых клеток, соответствующих специфическим функциональным частотам. В таблице 1 показано отображение частот слуха как функция расстояния по длине кохлеарной спирали у взрослых CBA/J mouse согласно исследованиям Мюллера1 и Viberg и Canlon1,2. Кохлеарные поверхностные препараты широко используются для исследования кохлеарных патологий4,5,6,7,8,9,10 ,11,12,13,14,15. Метод кохлеарной рассечения всего гора был первоначально описан в книге под редакцией Ганса Энгстрома в 1966году 16. Этот метод был впоследствии усовершенствован и адаптирован к различным видам, как описано в литературе рядом ученых в слух науки10,11,12,13, 15,17 и Eaton-Peabody лабораторий в Массачусетсглаз и ухо18. Недавно, другой метод кохлеарного вскрытия было сообщено Монтгомери и др.19. Микродиссекция улиски является важным и критическим шагом для кохлеарных препаратов поверхности. Тем не менее, вскрытие мыши улики является технической задачей и требует значительной практики. Здесь представлен модифицированный метод подготовки кохлеарной поверхности для использования во взрослых уличках мышей. Этот метод требует декальцинации и использования клея клеток и тканей (т.е. Cell-Tak) для присоединения кусочков кохлеарного эпителия к 10 мм круглым крышкам для иммуномаркировки. Клейк клеток и тканей широко используется для иммуногистохимии20. Этот модифицированный метод микродиссекции кохлеарных относительно прост по сравнению с теми, которые ранее сообщалось18,19.
Protocol
Representative Results
Discussion
Кохлеарная микродиссекция цельномонтажных препаратов поверхности в сочетании с иммуномаркировкой является основным инструментом для исследования патологий внутреннего уха и молекулярных механизмов. Этот модифицированный метод кохлеарного рассечения клеток и тканей с использован…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Описанный исследовательский проект был поддержан грантом R01 DC009222 от Национального института глухоты и других коммуникационных расстройств, Национальные институты здравоохранения. Эта работа велась в здании WR в МЦУ в отремонтированном помещении при поддержке гранта C06 RR014516. Звери были размещены в musC CRI животных объектов при поддержке гранта C06 RR015455 от вневедомственные научно-исследовательские учреждения программы Национального центра научных ресурсов. Авторы благодарят д-ра Иохена Шахта за его ценные комментарии и Андру Талашу за коррективы рукописи.
Materials
| 10-mm Rund Coverslips | Microscopy products for science and industry | 260367 | |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-mouse IgG2 | Thermo Fisher Scientific | A-21131 | |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A12379 | |
| Alexa Fluor 594 Goat Anti-mouse IgG1 | Thermo Fisher Scientific | A-21125 | |
| Alexa Fluor 594 Goat Anti-rabbit IgG (H+L) | Thermo Fisher Scientific | A11012 | |
| Carboard Micro Slide Trays | Fisher Scientific | 12-587-10 | |
| Cell-Tak | BD Biosciences | 354240 | |
| Corning Petri Dishes | Fisher Scientific | 353004 | |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific | 62247 | |
| Dumont #5 Forceps | FST fine science tools | 11251-20 | |
| EDTA Disodium Salt | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Fluoro-gel with Tris Buffer | Electron Microscopy Sciences | 17985-10 | |
| Four-well Cell Culture Dishes | Greiner Bio-One | 627170 | |
| Goat Anti-myosin VIIa Antibody | Proteus Biosciences | 25-6790 | |
| Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| Mouse Anti-CtBP2 Antibody | BD Biosciences | #612044 | |
| Mouse Anti-Glu2R Antibody | Millipore | MAB397 | |
| Normal Goat Serum | Thermo Fisher Scientific | 31872 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 441244 | |
| Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | BP665-1 | |
| Scalpel | VWR | 100491-038 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ML | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15001-08 |
References
- Muller, M., von Hunerbein, K., Hoidis, S., Smolders, J. W. A physiological place-frequency map of the cochlea in the CBA/J mouse. Hearing Research. 202 (1-2), 63-73 (2005).
- Viberg, A., Canlon, B. The guide to plotting a cochleogram. Hearing Research. 197 (1-10), (2004).
- Sha, S. H., Schacht, J. Emerging therapeutic interventions against noise-induced hearing loss. Expert Opinion on Investigational Drugs. 26 (1), 85-96 (2017).
- Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Adding insult to injury: cochlear nerve degeneration after “temporary” noise-induced hearing loss. Journal of Neuroscience. 29 (45), 14077-14085 (2009).
- Chen, F. Q., Zheng, H. W., Hill, K., Sha, S. H. Traumatic Noise Activates Rho-Family GTPases through Transient Cellular Energy Depletion. Journal of Neuroscience. 32 (36), 12421-12430 (2012).
- Hill, K., Yuan, H., Wang, X., Sha, S. H. Noise-Induced Loss of Hair Cells and Cochlear Synaptopathy Are Mediated by the Activation of AMPK. Journal of Neuroscience. 36 (28), 7497-7510 (2016).
- Xiong, H. Inhibition of Histone Methyltransferase G9a Attenuates Noise-Induced Cochlear Synaptopathy and Hearing Loss. Journal of Association for Research in Otolaryngology. 20 (3), 217-232 (2019).
- Yuan, H., et al. Autophagy attenuates noise-induced hearing loss by reducing oxidative stress. Antioxidant & Redox Signaling. 22 (15), 1308-1324 (2015).
- Wang, X. Mitochondrial Calcium Transporters Mediate Sensitivity to Noise-Induced Losses of Hair Cells and Cochlear Synapses. Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 469 (2018).
- Bohne, B. A., Harding, G. W. Processing and analyzing the mouse temporal bone to identify gross, cellular and subcellular pathology. Hearing Research. 109 (1-2), 34-45 (1997).
- Jiang, H., Sha, S. H., Forge, A., Schacht, J. Caspase-independent pathways of hair cell death induced by kanamycin in vivo. Cell Death & Differentiation. 13 (1), 20-30 (2006).
- Johnsson, L. G., Hawkins, J. E. Sensory and neural degeneration with aging, as seen in microdissections of the human inner ear. Annals of Otology, Rhinology, and Laryngology. 81 (2), 179-193 (1972).
- Wan, G., Gomez-Casati, M. E., Gigliello, A. R., Liberman, M. C., Corfas, G. Neurotrophin-3 regulates ribbon synapse density in the cochlea and induces synapse regeneration after acoustic trauma. Elife. 3, (2014).
- Wang, L. Targeting HDAC with a novel inhibitor effectively reverses paclitaxel resistance in non-small cell lung cancer via multiple mechanisms. Cell Death & Disease. 7, 2063 (2016).
- Weber, T., et al. Rapid cell-cycle reentry and cell death after acute inactivation of the retinoblastoma gene product in postnatal cochlear hair cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (2), 781-785 (2008).
- Engström, H., Ades, H. W., Andersson, A. . Structural pattern of the organ of Corti: a systematic mapping of sensory cells and neural elements. , (1966).
- Hawkins, J. E., Linthicum, F. H., Johnsson, L. G. Cochlear and vestibular lesions in capsular otosclerosis as seen in microdissection. Annals of Otology, Rhinology, and Laryngology Supplement. 87, 1-40 (1978).
- . MassEyeAndEar.org Available from: https://www.masseyeandear.org/research/otolaryngology/eaton-peabody-laboratories (2019)
- Montgomery, S. C., Cox, B. C. Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea. Journal of Visualized Experiments. (107), (2016).
- . Corning Cell Culture Surfaces Available from: https://www.corning.com/catalog/cls/documents/brochures/CLS-C-DL-006.pdf (2019)
- Nouvian, R., Beutner, D., Parsons, T. D., Moser, T. Structure and function of the hair cell ribbon synapse. The Journal of Membrane Biology. 209 (2-3), 153-165 (2006).
- Atturo, F., Barbara, M., Rask-Andersen, H. On the anatomy of the ‘hook’ region of the human cochlea and how it relates to cochlear implantation. Audiology and Neurootology. 19 (6), 378-385 (2014).
- Kim, N., Steele, C. R., Puria, S. The importance of the hook region of the cochlea for bone-conduction hearing. Biophysical Journal. 107 (1), 233-241 (2014).
- Zheng, H. W., Chen, J., Sha, S. H. Receptor-interacting protein kinases modulate noise-induced sensory hair cell death. Cell Death & Disease. 5, 1262 (2014).
- Brown, L. N., et al. Macrophage-Mediated Glial Cell Elimination in the Postnatal Mouse Cochlea. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 407 (2017).
