Summary
La reconstrucción esofágica es un procedimiento desafiante, y el desarrollo de un esófago diseñado con tejido que permite la regeneración de la mucosa esofágica y el músculo y que se puede implantar como un injerto artificial es necesario. Aquí, presentamos nuestro protocolo para generar un esófago artificial, incluyendo la fabricación de andamios, el cultivo de biorreactores y diversas técnicas quirúrgicas.
Abstract
El uso de materiales biocompatibles para la reconstrucción esofágica circunferencial es una tarea técnicamente difícil en ratas y requiere una técnica de implante óptima con apoyo nutricional. Recientemente, ha habido muchos intentos de ingeniería de tejido esofágico, pero la tasa de éxito ha sido limitada debido a la dificultad en la epitelización temprana en el entorno especial de la peristalsis. Aquí, desarrollamos un esófago artificial que puede mejorar la regeneración de la mucosa esofágica y las capas musculares a través de un andamio tubular de dos capas, un sistema de biorreactor a base de células madre mesenquimales, y una técnica de alimentación de bypass con Gastrostomy. El andamio está hecho de nanofibras de poliuretano (PU) en forma cilíndrica con una hebra de policaprolactona impresa tridimensional (3D) envuelta alrededor de la pared exterior. Antes del trasplante, las células madre mesenquimales derivadas del ser humano se sembraban en el lumen del andamio, y se realizaba el cultivo del biorreactor para mejorar la reactividad celular. Mejoramos la tasa de supervivencia del injerto aplicando anastomosis quirúrgica y cubriendo la prótesis implantada con un colgajo de la glándula tiroides, seguido de la alimentación temporal de la gastrostomía no oral. Estos injertos fueron capaces de recapitular los hallazgos de epitelización inicial y regeneración muscular alrededor de los sitios implantados, como lo demuestra el análisis histológico. Además, se observaron un aumento de las fibras de elastina y la neovascularización en la periferia del injerto. Por lo tanto, este modelo presenta una nueva técnica potencial para la reconstrucción esofágica circunferencial.
Introduction
El tratamiento de los trastornos esofágicos, como las malformaciones congénitas y los carcinomas esofágicos, puede conducir a la pérdida del segmento estructural del esófago. En la mayoría de los casos, se han realizado injertos de reemplazo autólogos, como conductos de extracción gástricos o interposiciones de colon,1,2. Sin embargo, estos reemplazos esofágistas tienen una variedad de complicaciones quirúrgicas y riesgos de reoperación3. Por lo tanto, el uso de andamios de esófago con ingeniería de tejido imitando el esófago nativo puede ser una estrategia alternativa prometedora para regenerar finalmente los tejidos perdidos4,5,6.
Aunque un esófago con ingeniería de tejido potencialmente ofrece una alternativa a los tratamientos actuales de defectos esofágicos, existen barreras significativas para su aplicación in vivo. La fuga anastomótica postoperatoria y la necrosis del andamio esofágico implantado conducen inevitablemente a una infección letal del espacio aséptico circundante, como el mediastinum7. Por lo tanto, es extremadamente importante prevenir la contaminación de alimentos o saliva en la herida y el tubo nasogástrico. Se debe considerar la gastrostomía o la nutrición intravenosa hasta que se complete la cicatrización de la herida primaria. Hasta la fecha, la ingeniería de tejido esofágico se ha realizado en grandes modelos animales porque los animales grandes sólo pueden ser alimentados por hiperalimentación intravenosa durante 2-4 semanas después de la implantación del andamio8. Sin embargo, no se ha establecido tal modelo de alimentación no oral para la supervivencia temprana después del trasplante de esófago en animales pequeños. Esto se debe a que los animales eran extremadamente activos e incontrolables, por lo que no podían mantener el tubo de alimentación en sus estómagos durante un largo período de tiempo. Por esta razón, ha habido pocos casos de trasplante de esófago exitoso en animales pequeños.
En vista de las circunstancias de la ingeniería del tejido esofágico, diseñamos un andamio tubular de dos capas que consiste en nanofibras electrospun (capa interna; Figura 1A) y una hebra impresa en 3D (capa exterior; Figura 1B) incluyendo una técnica de gastrostomía modificada. La nanofibra interna está hecha de PU, un polímero no degradable, y evita la fuga de alimentos y saliva. Las hebras externas impresas en 3D están hechas de policaprolactona biodegradable (PCL), que puede proporcionar flexibilidad mecánica y adaptarse al movimiento peristáltico. Las células madre mesenquimales derivadas de los adiposos humanos (hAD-MSC) fueron sembradas en la capa interna del andamio para promover la reepitelización. La estructura de nanofibra puede facilitar la regeneración inicial de la mucosa proporcionando un entorno de matriz extracelular estructural (ECM) para la migración celular.
También hemos aumentado la tasa de supervivencia y la bioactividad de las células inoculadas a través del cultivo del biorreactor. El andamio implantado estaba cubierto con un colgajo de la glándula tiroides para permitir una regeneración más estable de la mucosa esofágica y la capa muscular. En este informe, describimos protocolos para técnicas de ingeniería de tejido esofágico, incluyendo la fabricación de andamios, el cultivo de biorreactores a base de células madre mesenquimales, una técnica de alimentación de bypass con gastrostomía modificada y una técnica de anastomosis para la reconstrucción esofágica circunferencial en un modelo de rata.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Todos los métodos descritos aquí han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC No 17-0164-S1A0) del Hospital Universitario Nacional de Seúl.
1. Fabricación de andamios
NOTA: Los andamios esofágicos de dos capas se fabrican combinando electrospinning e impresión 3D. La membrana interna del andamio tubular fue fabricada por poliuretano electrospinning (PU) con mandriles giratorios de acero inoxidable como los colectores9.
- Para la preparación de nanofibras tubulares de PU, prepare una solución de polímero de PU al 20% (p/v) agitando en N,N-dimetilformamida (DMF) durante 8 h a temperatura ambiente.
- Coloque la solución de PU en la jeringa con una aguja de metal contundente (22 G) y electrospin en mandriles giratorios de acero inoxidable (diámetro de 2 mm) a una distancia de 30 cm entre la punta de la aguja y el colector giratorio.
NOTA: La fuente de alimentación se establece en una corriente directa de alta tensión de 15 kV potencial. La velocidad de alimentación de la solución se fija a 0,5 ml/h utilizando una bomba de jeringa. - Hacer una capa tubular de nanofibra en la superficie del mandril girando a 3,14 m/s.
- Seque la nanofibra de PU en un horno al vacío a 40 oC durante la noche para eliminar por completo el disolvente residual.
NOTA: La pared exterior impresa en 3D del andamio esofágico se prepara utilizando un sistema de prototipado rápido. El equipo de impresión 3D consta de un dispensador, boquilla, controlador de compresión/calor, etapa de conversión de 3 ejes y sistema de software. - Los pellets PCL se disuelven a 100 oC en un cilindro de calentamiento y luego se imprimen en la superficie de las nanofibras a alta presión (7 bar) bajo el control de un sistema de biotrazado. El tamaño de la boquilla es de 300 m y la distancia de la hebra es de 700 m.
- Después de retirar el andamio de dos capas del mandril, esteriliza dope en 70% de etanol bajo luz ultravioleta.
NOTA: En estudios anteriores10se han notificado características más detalladas del andamio.
2. Sembrado celular en los injertos y cultivo del biorreactor
NOTA: Las células madre mesenquimales derivadas de adiposos humanos (hCM) compradas a una empresa se utilizaron sin modificaciones.
- Antes del trasplante de células, esterilizar el andamio esófago impreso en 3D durante 1 h bajo luz ultravioleta, mojarlo durante 10 minutos con etanol y lavarlo 3 veces con solución salina con fosfato (PBS).
- Cultivar y ampliar los hMSCs en medio de crecimiento (suplemento basal medio/crecimiento). Los andamios tubulares de dos capas se transfirieron a 24 placas de cultivo de tejido de pozos no adherentes.
- Para unir las células a la superficie interna del andamio, agregue suavemente la suspensión hMSC a una densidad de 1 x 106 células/ml en la matriz de membrana del sótano que contenga el medio de crecimiento.
- Deposite uniformemente la suspensión de la matriz de membrana del sótano en la superficie interna del andamio tubular de dos capas.
- Fije firmemente el andamio tubular con sede sin hMSC al soporte de acrílico en la cámara de cultivo del biorreactor utilizando un sistema de biorreactor de flujo pulsátil.
NOTA: El sistema de biorreactor diseñado a medida consta de una bomba, trampa de burbujas, cámara de flujo, manómetro, válvula controlable y depósito medio. Al aplicar tensión de cizallamiento en la cámara de cultivo, permita un tiempo de descanso de 1-2 min11. - Añada un medio de crecimiento a la cámara de cultivo y aplique una tensión de cizallamiento inducida por flujo de 0,1 dyne/cm2 bajo una atmósfera humidificada que contenga un 5% de CO210.
NOTA: El valor de la tensión cortante inducida por el flujo se calculó simulando la peristalsis del tejido esofágico derivado del cuerpo humano de estudios anteriores10. - Determinar las respuestas celulares en las superficies internas de los andamios tubulares de dos capas sin cultivo de biorreactor después de 5 días utilizando un kit de ensayo de viabilidad LIVE/DEAD de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Obtenga imágenes mediante microscopía confocal utilizando la herramienta Z-stack.
- Al tercer día, observe la morfología superficial del andamio tubular con semillas de hMSC a través de un microscopio electrónico de barrido (SEM).
- Fijar el andamio que fue incubado con hMSC con 2.5% glutaraldehído y OsO4 durante 24 h y deshidratar con etanol.
- Recubrir los hMSC fijos con platino utilizando una capa de esputo en condiciones atmosféricas de argón y obtener imágenes SEM a una tensión de aceleración de 25 kV.
3. Preparación quirúrgica para cirugía animal
NOTA: Las preparaciones quirúrgicas se aplican antes de la gastrostomía y el trasplante de esófago.
- Configurar los instrumentos quirúrgicos estériles: cuchilla de escalpelo, retractor Weitlaner, soporte de microaguja, fórceps de microsutura, fórceps de microtejido, microtijeras, porta agujas Mayo-Hegar, tijeras de operación, tijeras de iris, fórceps de vendaje, fórceps de tejido, Fórceps de astilla, fórceps de iris, jeringa de 5 ml (aguja de 21 G), jeringa de 10 ml (aguja de 22 G), sutura de poliamida 9-0, sutura de 4-0 poliglactina.
- Anestesiar al animal con una inyección intramuscular de tetiamina/zolazepam (dosis de 50 mg/g) y 2% de clorhidrato de xilazina (2 mg/kg de dosis).
NOTA: Las ratas adultas Sprague-Dawley (SD) que pesan 398-420 g se utilizaron para el trasplante de esófago. - Antes de transferirse a la cortina quirúrgica, compruebe la condición anestésica adecuada del animal pellizcando la cola con los fórceps.
- Coloque al animal en posición supina sobre la cortina estéril y use cortadoras para extraer el cabello del cuello (para trasplante de esófago) o abdomen (para gastrostomía). A continuación, frote el sitio quirúrgico con betadina y 70% de etanol.
- Antes de la incisión, inyectar por vía subcutánea un analgésico como la buprenorfina (0,05-0,1 mg/kg) para aliviar el dolor.
4. Cirugía de gastrostomía utilizando un tubo T en ratas
NOTA: Se realizó una gastrostomía modificada en todos los animales experimentales para permitir la alimentación temporal del tubo no oral de derivación (n.o 5).
- Pida a las ratas que ayunan el día antes de la cirugía. Preparar la cirugía como en la sección 3.
- Exponga el estómago a través de una incisión de línea media de la piel y los músculos abdominales de las ratas anestesiadas.
- Cree un orificio de 3 mm en la pared gástrica anterior con una cuchilla de bisturí.
- Inserte la punta del tubo T de silicona en el lugar del defecto para fijarlo a la pared del estómago.
- Suturar correctamente para que el tubo T no se desprenda de la pared gástrica.
- Saque el extremo distal del tubo T implantado a través del túnel subcutáneo en la parte posterior del cuello.
- Inserte la tapa de heparina en el extremo del tubo T para evitar que el contenido del estómago fluya hacia atrás.
NOTA: Utilice un angiocatéter para conectar el extremo del tubo T con la tapa de heparina. - Sutura todas las capas de la pared abdominal y la piel usando 4-0 suturas de poliglactina.
- Mantenga todas las ratas experimentales separadas en una jaula metabólica después de que se haya completado la gastrostomía.
5. Trasplante esofágico
NOTA: El trasplante esofágico del andamio tubular de dos capas se realiza 1 semana después de la gastrostomía (n.o 5). Antes del trasplante, inocular hMSC (densidad celular: 1 x 106 células/ml en la matriz de membrana del sótano) en la pared interna de cada andamio e incubar durante 3 días en el sistema de biorreactor. El procedimiento quirúrgico es el siguiente.
- Retire el vello del cuello de los animales modelo y realice el drenaje estándar del sitio quirúrgico para la cirugía aséptica.
NOTA: Se recomienda crear un área de afeitado grande para mantener la cirugía asceptica en el animal. - Después de la incisión mediana anterior del cuello, separe los músculos de la correa y exponga la estructura traqueoesofágica.
- Diseccionar con rodeos el nervio vago del esófago antes de volver a sellar el segmento, de lo contrario la respiración del animal se vea comprometida.
- Bajo aumento, aísle el lado izquierdo del esófago de la tráquea y separe cuidadosamente la parte superior de la glándula tiroides.
- Crear un defecto circunferencial completo de 5 mm de largo que contenga todas las capas del esófago utilizando tijeras quirúrgicas.
NOTA: Antes del trasplante de esófago, corte los andamios preparados con tijeras quirúrgicas para que coincidan con la longitud del sitio del trasplante. - Bajo un microscopio, realice microanastomosis en ambos extremos del defecto esofágico distal utilizando un hilo de sutura 9-0. Coloque la primera sutura entre el margen inferoposterior derecho del remanente del esófago superior y el andamio. Continúe suturando de derecha a izquierda entre el remanente del esófago superior y el andamio. Anastomosa del andamio de la misma manera que el margen superior del remanente del esófago inferior.
NOTA: Realizar anastomosis microvascular como se utiliza en la cirugía clínica para el trasplante de esófago. Trabaje con un microscopio para una sutura precisa y estanca del sitio del implante. - Después, poner el colgajo de la glándula tiroides circundante sobre el sitio trasplantado para asegurar el mantenimiento estable y el suministro vascular a los injertos.
- Después del trasplante, coser el músculo subcutáneo y el tejido de la piel con una sutura de 4-0 vicryl.
- Mantener todas las ratas experimentales individualmente en jaulas metabólicas.
6. Procedimientos postoperatorios
NOTA: Los procedimientos postoperatorios se realizan después de la gastrostomía y el trasplante de esófago.
- Después del cierre de la herida abdominal, coloque las ratas en jaulas metabólicas individuales y coloque las jaulas en dispositivos de calentamiento infrarrojo para evitar la hipotermia.
- Monitoree a los animales hasta que logren y mantengan la recumbencia esternal (es decir, acostado sin corazón sobre el pecho).
- Para minimizar la inflamación en el sitio quirúrgico, administre diariamente el antibiótico gentamicina (20 mg/kg) a las ratas.
- Comience la alimentación líquida oral en el tercer día postoperatorio hasta la variable del estudio. Suministrar toda la fórmula nutricional (20,6 g/100 ml [g%] carbohidratos, 3,8 g% de proteína, 0,2 g% de grasa) a través de la tapa de heparina 3 veces al día a partir del día después de la cirugía.
- Compruebe la apariencia de los animales y el peso corporal diariamente. Compruebe el comportamiento, como el sitio de incisión autolesionante o la resistencia a la ingesta de tubos, así como varias complicaciones quirúrgicas. Cuando el peso corporal de los modelos de ratas disminuya rápidamente en un 20% o más, realice la eutanasia por inhalación deCO2.
7. Histología e inmunohistoquímica
NOTA: Para el análisis histológico, todo el tejido esofágico de los animales eutanasiados se extrae mediante tijeras quirúrgicas. La tinción de hematoxilina y eosina y la tinción tricroma de Masson se realizaron utilizando técnicas histológicas estándar. La inmunohistoquímica se realizó de acuerdo con el siguiente protocolo.
- Fije todo el esófago que contiene los sitios trasplantados en un 4% de paraformaldehído. Crea un bloque de parafina y corta secciones de 4 m de espesor.
- Desparaffinizar las secciones tisulares y deshidratarlas en una serie de etanol. Sumerja los portaobjetos en el tampón de citrato y caliente durante 10 minutos en el microondas. Enfríe las células con PBS frío durante 20 min. Sumergir en 3% peróxido de hidrógeno durante 6 min, y lavar con PBS durante 10 min.
- Incubar en albúmina sérica bovina (BSA) al 3% durante 1 h a temperatura ambiente para bloquear reacciones inespecíficas de las secciones de tejido.
- Lavar 3x con PBS durante 5 min. Incubar con anticuerpos primarios contra Desmin (diluido a 1:200), queratina 13 (diluido a 1:100) y factor von Willebrand (vWF; diluido a 1:100) durante la noche a 4oC.
- Lavar 3x con PBS durante 15 min. Incubar con el anticuerpo secundario adecuado a una concentración de 1:500 para Desmin y Queratina 13 a temperatura ambiente. A continuación, lave los portaobjetos dos veces con PBS durante 10 minutos.
NOTA: Las secciones de tejido para vWF se incuban utilizando un kit conjugado con peroxidasa de rábano picante (ver Tabla de Materiales)y luego se visualizaron con 3,3'-diaminobenzidina (DAB). - Montar con un cubrevidrio y 4',6-diamidino-2-phenolindole (DAPI) que contiene medio de montaje.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
La Figura 1 muestra un diagrama esquemático del proceso de fabricación del andamio tubular de dos capas PU-PCL. La solución de PU fue electrospun de una aguja de 18 G para hacer una estructura interna cilíndrica con un espesor de 200 m. Luego, el PCL fundido se imprimió en la pared exterior de la nanofibra de la PU a intervalos regulares. La morfología superficial de las paredes internas y externas del andamio tubular completado se puede ver en las imágenes de microscopía electrónica de barrido.
La Figura 2 muestra el proceso de inserción de un tubo de gastrostomía en una rata para el suministro externo de nutrientes(Figura 2A). El tubo de silicona en forma de T se insertó en la pared del estómago y suturado(Figura 2B). A continuación, el tubo se movió a través del túnel subcutáneo hasta la parte posterior del cuello y se conectó con una tapa de heparina(Figura 2C). El tubo facilita la inyección de alimentos líquidos. También prohíbe el flujo inverso del contenido gástrico a través de los tubos.
La Figura 3 muestra el proceso de inoculación celular en la pared interna del andamio, el cultivo del biorreactor y el trasplante de esófago. La matriz de membrana de sótano incrustada en hMSC se aplicó uniformemente a la pared interna del andamio mediante inyección(Figura 3A). La imagen SEM muestra la morfología de la superficie interna conectada a la célula. La tinción viva/muerta para analizar la viabilidad celular en el andamio tubular de dos capas (superficie luminal) indicaba que la mayoría de las células eran viables, y se propagaban bien en la estructura de nanofibra en 5 días. El andamio inoculado con las células se fijó al biorreactor, y la tensión de cizallamiento fue aplicada por la bomba(Figura 3B). Los andamios tubulares con semillas de hMSC, incluido el cultivo de biorreactores, fueron trasplantados en ratas con defectos esofágicos circunferenciales completos a través de técnicas de microsutura. El injerto se cubrió con un colgajo de la glándula tiroides para una fijación estable y el suministro vascular del sitio implantado(Figura 3C). El cambio de peso de las ratas después del trasplante se observó hasta el final del experimento. Las ratas trasplantadas de esófago permanecieron a 340 g hasta el noveno día, pero luego disminuyeron rápidamente de peso debido a diversas causas(Figura 3D). Como resultado, la mayoría de los animales murieron en 15 días.
La Figura 4 muestra la regeneración esofágica después de la implantación del injerto. Aunque la mayoría de las ratas desarrollaron obstrucción neoesofágica causada por bolas de pelo, no hubo evidencia bruta de perforación, fuga de anastomosis con fístula, acumulación de seroma, formación de abscesos o necrosis de tejido blando circundante en cualquier rata experimental. La reepitelización del lugar del trasplante se confirmó mediante la tinción de inmunofluorescencia para la queratina 13. La morfología de la capa de colágeno y las fibras de elastina se confirmó claramente en el sitio de regeneración. La presencia de abundantes fibras de elastina y colágeno puede contribuir a mejorar las propiedades mecánicas. La regeneración de la capa muscular esofágica fue exhibida por la inmunohistoquímica de sinmina, y se observó abundante neovascularización en este sitio.
Figura 1: Ilustración esquemática del proceso utilizado para fabricar andamios tubulares de 2 capas. Después de fabricar la membrana interna mediante electrospinning utilizando PU (A), la resistencia estructural del andamio tubular se reforzó añadiendo hebras a la superficie exterior de la membrana utilizando un sistema de impresión 3D sin disolvente (B). La imagen SEM muestra la morfología de las capas internas y externas del andamio tubular de 2 capas. (Abreviaturas: PU - poliuretano). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Gastrostomía. (A) Un diagrama esquemático que muestra las técnicas de gastrostomía a través de la inserción del tubo T en la pared gástrica. (B) Se hace un agujero de punción en el centro del forestomach, y la punta del tubo T se inserta en el forestomach. (C) La parte de entrada del tubo T se encuentra con la tapa de heparina en el centro del occipucio. La siguiente figura presenta un aparato de gastrostomía de tubo En T con diferentes componentes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Trasplante esofágico. (A) Los hMSC encapsulados en la matriz de membrana del sótano se sembraron en las capas internas del andamio tubular de dos capas. La imagen SEM muestra la morfología de los hMSC en la pared interior. La viabilidad de las células inoculadas también fue confirmada por la tinción viva-muerta (células vivas). Los andamios de la semilla de hMSC se incubaron inmediatamente en un sistema de biorreactor (B), y luego los esófagos diseñados por tejido se implantaron en el esófago cervical (C). El sitio implantado fue cubierto con un colgajo de la glándula tiroides para una reconstrucción esofágica estable (flechas). (D) Estudios de pérdida de peso después del trasplante de esófago. La pérdida de peso se determinó como un cambio absoluto con el peso inicial de las ratas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Histología entera del esófago reconstruido 2 semanas después de la implantación del andamio ortotópico. La tinción tricroma de Masson muestra la deposición de colágeno alrededor de los sitios implantados. La regeneración del músculo esofágico y las capas mucosas se confirmó mediante inmunomanchas de desmina (verde) y queratina 13 (roja), respectivamente. Además, la neovascularización (flechas) se observó claramente alrededor de la capa mucosa regenerada. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Los estudios en animales existentes sobre esofagia artificial siguen estando limitados por varios factores críticos. El andamio esofágico artificial ideal debe ser biocompatible y tener excelentes propiedades físicas. Debe ser capaz de regenerar el epitelio de la mucosa en el período postoperatorio temprano para evitar fugas anastomóticas. La regeneración de las capas musculares longitudinales circulares y externas internas también es importante para la peristalsis funcional12,13.
Las características mecánicas del esófago son esenciales porque el esófago colapsa durante la respiración y se abre durante la deglución, con exposición constante al estiramiento máximo con un fenómeno de retroceso14. El andamio implantado también debe tener estas características mecánicas. La viscoelasticidad del esófago implantado debe ser adecuada para la relajación repetitiva de la rampa del movimiento peristáltico a través del esófago. Los andamios que son demasiado débiles pueden romperse o fugarse y causar condiciones graves (p. ej., mediastinitis) en el receptor. Por el contrario, un andamio demasiado rígido podría abultarse en el lumen esofágico y prevenir el paso de los alimentos. Las nanofibras electrospun tienen propiedades físicas muy favorables para la reconstrucción esofágica. La naturaleza topográfica del ECM proporciona un entorno favorable para la migración y diferenciación de células epiteliales en capas esofágicas15. También tiene una estructura de nanoporos que evita fugas de saliva y varios patógenos16. Sin embargo, los andamios hechos de nanofibras de electrospun tienen un uso limitado debido a sus propiedades mecánicas suaves. Para resolver este problema, mejoramos su resistencia mecánica utilizando la tecnología de impresión 3D. El hilo impreso en 3D en la capa exterior de la nanofibra tiene una anchura de 780 m, y la estructura interna de los poros es bastante ancha. Proporciona apoyo físico para intervenciones esofágicas en lugar de guiar la regeneración del tejido circundante.
En este estudio, los defectos esofágicos circunferenciales se curaron completamente en los injertos cultivados en biorreactor durante un máximo de 2 semanas, pero todas las ratas experimentales murieron dentro de los 15 días posteriores a la cirugía. La mayoría de las muertes fueron causadas por peritonitis y desnutrición causada por fugas de alimentos y saliva proximales en el sitio de anastomosis. Todos los animales consumieron libremente una dieta líquida hasta por una semana, pero a medida que avanzaba la cicatrización de la herida, se produjo una obstrucción mecánica no intencional en el esófago reconstruido debido a la deglución de la bola de pelo. Este fenómeno ha demostrado causar trastorno digestivo completo dentro de los andamios no dinámicos implantados. Hay varias opciones para superar estos problemas técnicos. En primer lugar, el desarrollo de un implante esofágico altamente elástico que puede imitar la peristalsis esofágica. En segundo lugar, estudios en animales con ratas sin pelo para evitar la deglución del cabello. En tercer lugar, el stent biliar se puede aplicar simultáneamente con el andamio para minimizar el colapso del implante y el daño de la anastomosis. Además, la aplicación de anastomosis microvascular a la implantación de andamios esofágicos es importante para prevenir completamente la fuga de saliva. La técnica de sutura convencional usando los ojos desnudos es extremadamente difícil de hacer estanco en modelos de ratas.
Un vehículo vascular confiable es esencial para nutrientes, factores de crecimiento y suministro de oxígeno en las primeras etapas de la regeneración. La glándula tiroides es tejido vascular situado cerca del esófago. Usamos el colgajo de la glándula tiroides después de la esofagectomía circunferencial debido a su fácil accesibilidad en el modelo de rata. En conclusión, proponemos diversas técnicas preclínicas para superar las dificultades de la reconstrucción esofágica en el modelo de rata. Este estudio presenta una buena alternativa para superar las limitaciones del trasplante convencional de esófago animal pequeño.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Se ha comercializado el sistema de biorreactor diseñado para este estudio (número de modelo: ACBF-100).
Acknowledgments
Esta investigación fue apoyada por el Proyecto de I+D de La Tecnología Sanitaria de Corea a través del Instituto de Desarrollo de la Industria Sanitaria de Corea (KHIDI), financiado por el Ministerio de Salud y Bienestar de la República de Corea (número de concesión: HI16C0362) y el Instituto de Investigación en Ciencias Básicas Programa a través de la Fundación Nacional de Investigación de Corea (NRF) financiado por el Ministerio de Educación (2017R1C1B2011132). Los bioespecímenes y los datos utilizados en este estudio fueron proporcionados por el Biobanco del Hospital Universitario Nacional de Seúl, miembro de Korea Biobank Network.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Metabolic cage | TEUNGDO BIO & PLANT | JD-C-66 | |
| Zoletil (50 mg/g dose) | Virbac | 1000000188 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| 1 mL Syringe | BD | 309659 | |
| 2% xylazine hydrochloride (Rumpun) | Byely | Q-0615-035 | |
| 4% paraformaldehyde | BIOSOLUTION | BP031 | |
| 4-0 Vicryl | ETHICON | W9443 | |
| 9-0 Vicryl | ETHICON | W2813 | |
| Antibiotic gentamicin (Septopal). | Septopal | 0409-1207-03 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | 5470 | |
| Citrate Buffer, ph6.0, 10X | Sigma | C9999 | |
| DAB PEROXIDASE SUBSTRATE KIT | VECTOR | SK4100 | |
| Desmin | Santa Cruz | sc-23879 | |
| Elastic stain kit | ScyTeK | ETS-1 | |
| Ethanol | Merck | 100983 | |
| Ethanol | Merck | 64-17-5 | |
| Fetal Bovine Serun (FBS) | Gibco | 16000-044 | |
| Glutaraldehyde | Sigma | 354400 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody | ThermoFisher | A-11001 | |
| Heparin cap | Hyupsung Medical | HS-T-05 | |
| hMSC (STEMPRO) / growth medium (MesenPRO RSTM) |
Invitrogen | R7788-110 | |
| Horseradish peroxidase-conjugated kit (Vectastain) | VECTOR | PK7800 | |
| Hydrogen peroxide | JUNSEI | 7722-84-1 | |
| Keratin13 | Novus | NBP1-97797 | |
| LIVE/DEAD Viability Assay Kit | Molecular Probes | L3224 | |
| Matrigel | Corning | 354262 | |
| N,N-dimethylformamide (DMF) | Sigma | 227056 | |
| Nonadherent 24-well tissue culture plates. |
Corning | 3738 | |
| OsO4 | Sigma | O5500 | |
| Petri dish | Eppendorf | 3072115 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 10010-023 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS), 10X | BIOSOLUTION | BP007a | |
| Polycaprolactone (PCL) polymer | Sigma | 440744 | |
| Polyurethane (PU+A2:A24) polymer | Lubrizol | 2363-80AE | |
| Power Supply | NanoNC | HV100 | |
| ProLong Gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P36931 | |
| Rumpun | Bayer | Q-0615-035 | |
| Silicone T-tube | Sewoon Medical | 2206-005 | |
| Terramycin Eye Ointment | Pfizer Pharmaceutical Korea | W01890011 | |
| Tiletamine/Zolazepam (Zoletil) | Virbac Laboratories | Q-0042-058 | |
| Trichrome stain kit | ScyTeK | TRM-1 | |
| von Willebrand Factor (vWF) | Santa Cruz | sc 14014 |
References
- Irino, T., et al. Long-term functional outcomes after replacement of the esophagus with gastric, colonic, or jejunal conduits: a systematic literature review. Diseases of the Esophagus. 30 (12), 1-11 (2017).
- Flanagan, J. C., et al. Esophagectomy and Gastric Pull-through Procedures: Surgical Techniques, Imaging Features, and Potential Complications. Radiographics. 36 (1), 107-121 (2016).
- Liu, J., Yang, Y., Zheng, C., Dong, R., Zheng, S. Surgical outcomes of different approaches to esophageal replacement in long-gap esophageal atresia: A systematic review. Medicine. (Baltimore). 96 (21), e6942 (2017).
- Luc, G., et al. Decellularized and matured esophageal scaffold for circumferential esophagus replacement: Proof of concept in a pig model. Biomaterials. 175, 1-18 (2018).
- Wang, F., Maeda, Y., Zachar, V., Ansari, T., Emmersen, J. Regeneration of the oesophageal muscle layer from oesophagus acellular matrix scaffold using adipose-derived stem cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 503 (1), 271-277 (2018).
- La Francesca, S., et al. Long-term regeneration and remodeling of the pig esophagus after circumferential resection using a retrievable synthetic scaffold carrying autologous cells. Scientific Reports. 8 (1), 4123 (2018).
- Ponten, J. E., et al. Early severe mediastinal bleeding after esophagectomy: a potentially lethal complication. Journal of Thoracic Disease. 5 (2), E58-E60 (2013).
- Catry, J., et al. Circumferential Esophageal Replacement by a Tissue-engineered Substitute Using Mesenchymal Stem Cells: An Experimental Study in Mini Pigs. Cell Transplant. 26 (12), 1831-1839 (2017).
- Lee, S. J., et al. Characterization and preparation of bio-tubular scaffolds for fabricating artificial vascular grafts by combining electrospinning and a 3D printing system. Physical Chemistry Chemical Physics. 17 (5), 2996-2999 (2015).
- Kim, I. G., et al. Tissue-Engineered Esophagus via Bioreactor Cultivation for Circumferential Esophageal Reconstruction. Tissue Engineering Part A. , (2019).
- Wu, Y., et al. Combinational effects of mechanical forces and substrate surface characteristics on esophageal epithelial differentiation. Journal of Biomedical Materials Research A. 107, 552-560 (2019).
- Jensen, T., et al. Polyurethane scaffolds seeded with autologous cells can regenerate long esophageal gaps: An esophageal atresia treatment model. Journal of Pediatric Surgery. 3468 (18), 30685-30687 (2018).
- Nakase, Y., et al. Intrathoracic esophageal replacement by in situ tissue-engineered esophagus. Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 136 (4), 850-859 (2008).
- Kwiatek, M. A., et al. Mechanical properties of the esophagus in eosinophilic esophagitis. Gastroenterology. 140 (1), 82-90 (2011).
- Anjum, F., et al. Biocomposite nanofiber matrices to support ECM remodeling by human dermal progenitors and enhanced wound closure. Scientific Reports. 7 (1), 10291 (2017).
- Kuppan, P., Sethuraman, S., Krishnan, U. M. PCL and PCL-gelatin nanofibers as esophageal tissue scaffolds: optimization, characterization and cell-matrix interactions. Journal of Biomedical Nanotechnology. 9 (9), 1540-1555 (2013).
