Summary
एसोफेगल पुनर्निर्माण एक चुनौतीपूर्ण प्रक्रिया है, और ऊतक-इंजीनियर घेघा का विकास जो एसोफेगल म्यूकोसा और मांसपेशियों के उत्थान को सक्षम बनाता है और इसे कृत्रिम भ्रष्टाचार के रूप में प्रत्यारोपित किया जा सकता है। यहां, हम पाड़ विनिर्माण, बायोरिएक्टर खेती, और विभिन्न शल्य चिकित्सा तकनीकों सहित एक कृत्रिम घेघा उत्पन्न करने के लिए अपना प्रोटोकॉल पेश करते हैं।
Abstract
परिचरण एसोफेजियल पुनर्निर्माण के लिए जैव संगत सामग्री का उपयोग चूहों में तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण कार्य है और पोषण सहायता के साथ एक इष्टतम प्रत्यारोपण तकनीक की आवश्यकता होती है। हाल ही में एसोफेगल टिश्यू इंजीनियरिंग में कई प्रयास हुए हैं, लेकिन पेरिसलसिस के विशेष वातावरण में जल्दी एपिथेलाइजेशन में कठिनाई के कारण सफलता दर सीमित हो गई है । यहां, हमने एक कृत्रिम घेघा विकसित किया है जो दो स्तरीय ट्यूबलर पाड़, एक मेसेंचिमल स्टेम सेल-आधारित बायोरिएक्टर प्रणाली और संशोधित के साथ बाईपास फीडिंग तकनीक के माध्यम से एसोफेगल म्यूकोसा और मांसपेशियों की परतों के उत्थान में सुधार कर सकता है Gastrostomy. पाड़ बाहरी दीवार के चारों ओर लिपटे तीन आयामी (3डी) मुद्रित पॉलीकैप्रोटैटोन स्ट्रैंड के साथ बेलनाकार आकार में पॉलीयूरेथेन (पीयू) नैनोफाइबर से बना है। प्रत्यारोपण से पहले, मानव-व्युत्पन्न मेसेनचिमल स्टेम कोशिकाओं को पाड़ के ल्यूमेन में वरीयता दी गई थी, और सेलुलर प्रतिक्रियाशीलता को बढ़ाने के लिए बायोरिएक्टर की खेती की गई थी। हमने सर्जिकल एनास्टोमोसिस लागू करके और थायराइड ग्रंथि फ्लैप के साथ प्रत्यारोपित कृत्रिम अंग को कवर करके भ्रष्टाचार के अस्तित्व की दर में सुधार किया, जिसके बाद अस्थायी नोओरल गैस्ट्रोस्टोमी फीडिंग हुई। ये ग्राफ्ट प्रत्यारोपित साइटों के आसपास प्रारंभिक एपिथेलियालाइजेशन और मांसपेशियों के उत्थान के निष्कर्षों को फिर से दोहराने में सक्षम थे, जैसा कि हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण द्वारा प्रदर्शित किया गया था। इसके अलावा, भ्रष्टाचार की परिधि में वृद्धि हुई इलास्टिन फाइबर और नियोवैस्कुलराइजेशन देखा गया। इसलिए, यह मॉडल परिचरणएय पुनर्निर्माण के लिए एक संभावित नई तकनीक प्रस्तुत करता है।
Introduction
जन्मजात विकृतियों और एसोफेगल कार्सिनोमा जैसे एसोफेगल विकारों का उपचार, घेघा के संरचनात्मक खंड हानि का कारण बन सकता है। ज्यादातर मामलों में, गैस्ट्रिक पुल-अप नाली या कोलन इंटरपोजिशन जैसे ऑटोलॉगस रिप्लेसमेंट ग्राफ्ट,1,2किए गए हैं। हालांकि, इन एसोफेगल प्रतिस्थापन में कई प्रकार की सर्जिकल जटिलताएं होती हैं और पुनर्संचालन जोखिम3होता है। इस प्रकार, देशी घेघा की नकल करने वाले ऊतक-इंजीनियरघे मचान का उपयोग अंततः खोए हुए ऊतकोंकोपुनर्जीवित करने के लिए एक आशाजनक वैकल्पिक रणनीति हो सकती है4,5,6।
हालांकि एक ऊतक इंजीनियर घेघा संभावित esophageal दोषों के वर्तमान उपचार के लिए एक विकल्प प्रदान करता है, वहां वीवो आवेदन में इसके लिए महत्वपूर्ण बाधाएं हैं । प्रत्यारोपित एसोफेगल पाड़ के पश्चात एनास्टोमोटिक रिसाव और परिगलन अनिवार्य रूप से आसपास के एसेप्टिक अंतरिक्ष के घातक संक्रमण का कारण बनते हैं, जैसे कि मध्यस्थ7। इसलिए, घाव और नासोगास्ट्रिक ट्यूब में भोजन या लार संदूषण को रोकना अत्यंत महत्वपूर्ण है। गैस्ट्रोस्टोमी या नसों में पोषण पर तब तक विचार किया जाना चाहिए जब तक प्राथमिक घाव उपचार पूरा नहीं हो जाता। आज तक, बड़े पशु मॉडलों में एसोफेगल ऊतक इंजीनियरिंग की गई है क्योंकि बड़े जानवरों को पाड़8के प्रत्यारोपण के बाद 2-4 सप्ताह के लिए नसों में हाइपरएलिमेंटेशन द्वारा ही खिलाया जा सकता है। हालांकि, छोटे जानवरों में एसोफेगल प्रत्यारोपण के बाद इस तरह के एक गैर-मौखिक भोजन मॉडल को जल्दी जीवित रहने के लिए स्थापित नहीं किया गया है। इसका कारण यह है कि जानवर बेहद सक्रिय और बेकाबू थे, इसलिए वे एक विस्तारित अवधि के लिए अपने पेट में खिला ट्यूब नहीं रख सकते थे। इस कारण से छोटे जानवरों में सफल एसोफेगल प्रत्यारोपण के कुछ मामले सामने आए हैं।
एसोफेगल टिश्यू इंजीनियरिंग की परिस्थितियों को देखते हुए, हमने इलेक्ट्रोस्पन नैनोफाइबर (आंतरिक परत) से मिलकर दो-परत ट्यूबलर पाड़ डिजाइन किया; चित्रा 1ए)और एक 3 डी मुद्रित कतरा (बाहरी परत; चित्रा 1बी)एक संशोधित गैस्ट्रोस्टोमी तकनीक सहित। आंतरिक नैनोफाइबर पीयू से बना है, जो एक गैर-डिग्रेडेबल बहुलक है, और भोजन और लार के रिसाव को रोकता है। बाहरी 3 डी मुद्रित किस्में बायोडिग्रेडेबल पॉलीकाप्रोलेक्टोन (पीसीएल) से बनी होती हैं, जो यांत्रिक लचीलापन प्रदान कर सकती हैं और पेरिस्टैटिक आंदोलन के अनुकूल हो सकती हैं। मानव आदिपोज़-व्युत्पन्न मेसेनचिमल स्टेम सेल (एचएडी-एमएससी) को पुनः अधिसंख्य को बढ़ावा देने के लिए पाड़ की आंतरिक परत पर वरीयता दी गई थी। नैनोफाइबर संरचना सेल माइग्रेशन के लिए एक संरचनात्मक बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) वातावरण प्रदान करके प्रारंभिक म्यूकोसल पुनर्जनन की सुविधा प्रदान कर सकती है।
हमने बायोरिएक्टर खेती के माध्यम से टीका लगाने वाली कोशिकाओं के जीवित रहने की दर और जैव गतिविधि में भी वृद्धि की है । प्रत्यारोपित पाड़ को थायराइड ग्रंथि फ्लैप से ढका गया था ताकि एसोफेगल म्यूकोसा और मांसपेशियों की परत के अधिक स्थिर उत्थान को सक्षम किया जा सके। इस रिपोर्ट में, हम पीपाड़ विनिर्माण, मेसेंचिमल स्टेम सेल आधारित बायोरिएक्टर खेती, संशोधित गैस्ट्रोस्टोमी के साथ एक बाईपास फीडिंग तकनीक, और एक संशोधित सर्जिकल सहित एसोफेगल ऊतक इंजीनियरिंग तकनीकों के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं चूहा मॉडल में परिस्थितिजन्य एसोफेगल पुनर्निर्माण के लिए एनास्टोमोसिस तकनीक।
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Protocol
यहां वर्णित सभी तरीकों को सियोल नेशनल यूनिवर्सिटी अस्पताल की संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (आईएसीयूसी नंबर 17-0164-S1A0) द्वारा अनुमोदित किया गया है ।
1. पाड़ विनिर्माण
नोट: इलेक्ट्रोस्पिनिंग और 3 डी प्रिंटिंग के संयोजन से दो स्तरित एसोफेगल मचान का निर्माण किया जाता है। ट्यूबलर पाड़ की आंतरिक झिल्ली इलेक्ट्रोस्पिनिंग पॉलीयूरेथेन (पीयू) द्वारा कलेक्टरों9के रूप में स्टेनलेस स्टील मैंड्रेल घुमाने के साथ बनाई गई थी।
- ट्यूबलर पीयू नैनोफाइबर तैयार करने के लिए, कमरे के तापमान पर 8 घंटे के लिए एन, एन-डाइमेथिलफॉर्ममाइड (डीएमएफ) में सरगर्मी करके पीयू बहुलक का 20% (w/v) समाधान तैयार करें।
- सिरिंज पर पीयू समाधान को कुंद धातु की सुई (22 जी) के साथ रखें, और सुई टिप और घूर्णन कलेक्टर के बीच 30 सेमी की दूरी पर स्टेनलेस स्टील मैंडल्स (व्यास = 2 मिमी) घुमाने पर इलेक्ट्रोस्पिन करें।
नोट: बिजली की आपूर्ति 15 केवी क्षमता के एक उच्च वोल्टेज प्रत्यक्ष वर्तमान के लिए सेट है । सिरिंज पंप का उपयोग करके समाधान की फीडिंग दर 0.5 मिली/घंटा तय की जाती है। - 3.14 मीटर/एस पर घूर्णन मेंड्रेल की सतह पर एक ट्यूबलर नैनोफाइबर परत बनाएं।
- अवशिष्ट सॉल्वेंट को पूरी तरह से हटाने के लिए पीयू नैनोफाइबर को रात भर वैक्यूम ओवन में 40 डिग्री सेल्सियस पर सुखा लें।
नोट: एसोफेगल पाड़ की 3 डी-मुद्रित बाहरी दीवार एक रैपिड प्रोटोटाइप सिस्टम का उपयोग करके तैयार की गई है। 3 डी प्रिंटिंग उपकरण में एक डिस्पेंसर, नोजल, संपीड़न/हीट कंट्रोलर, 3-एक्सिस रूपांतरण चरण और सॉफ्टवेयर सिस्टम शामिल हैं। - पीसीएल छर्रों को एक हीटिंग सिलेंडर में 100 डिग्री सेल्सियस पर भंग किया जाता है और फिर बायोप्लॉटिंग सिस्टम के नियंत्रण में उच्च दबाव (7 बार) पर नैनोफाइबर की सतह पर मुद्रित किया जाता है। नोजल का आकार 300 माइक्रोन है और स्ट्रैंड की दूरी 700 माइक्रोन है।
- मैंड्रेल से दो स्तरित पाड़ को हटाने के बाद, पराबैंगनी प्रकाश के तहत 70% इथेनॉल में भिगोने से बंध्याकरण करें।
नोट: पाड़ की अधिक विस्तृत विशेषताओं पिछले अध्ययनों में सूचित किया गया है10।
2. ग्राफ्ट और बायोरिएक्टर खेती पर सेल सीडिंग
नोट: किसी कंपनी से खरीदे गए मानव आदिवित मेसेंचिमल स्टेम सेल (एचएमएससी) का उपयोग बिना संशोधन के किया गया था।
- सेल प्रत्यारोपण से पहले, पराबैंगनी प्रकाश के तहत 1 घंटे के लिए 3 डी मुद्रित घेघा पाड़ को निष्फल करें, इसे इथेनॉल के साथ 10 सीन के लिए गीला करें, और इसे फॉस्फेट-बफर लवण (पीबीएस) के साथ 3x धोएं।
- विकास माध्यम (बेसल मीडियम/ग्रोथ सप्लीमेंट) में एचएमएससी की संस्कृति और विस्तार। दो स्तरित ट्यूबलर मचान ों को गैर-अअनुयायी 24 अच्छी तरह से ऊतक संस्कृति प्लेटों में स्थानांतरित किया गया था।
- पाड़ की भीतरी सतह पर कोशिकाओं को संलग्न करने के लिए, धीरे से 1 x 10 6 कोशिकाओं/तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स में 1 x 106 कोशिकाओं/mL के घनत्व पर hMSC निलंबन जोड़ें विकास माध्यम युक्त ।
- समान रूप से दो स्तरित ट्यूबलर पाड़ की आंतरिक सतह पर तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स निलंबन जमा।
- एक पल्सेटिक फ्लो बायोरिएक्टर सिस्टम का उपयोग करके बायोरिएक्टर के संस्कृति कक्ष में एक्रेलिक धारक को एचएमएससी-वरीयता प्राप्त ट्यूबलर पाड़ को मजबूती से ठीक करें।
नोट: कस्टम-डिज़ाइन किए गए बायोरिएक्टर सिस्टम में एक पंप, बबल ट्रैप, फ्लो चैंबर, प्रेशर गेज, कंट्रोलेबल वाल्व और मध्यम जलाशय शामिल हैं। संस्कृति कक्ष में कतरनी तनाव लागू करते समय, 1-2 मिन11के आराम के समय की अनुमति दें। - संस्कृति कक्ष में विकास माध्यम जोड़ें और 5% सीओ210युक्त आर्द्र वातावरण के तहत ०.१ dyne/सेमी2 प्रवाह प्रेरित कतरनी तनाव लागू करें ।
नोट: प्रवाह प्रेरित कतरनी तनाव के मूल्य की गणना पिछले अध्ययनों से मानव शरीर से प्राप्त एसोफेगल ऊतक के पेरिस्टलसिस का अनुकरण करके की गई थी10। - निर्माता के निर्देशों के अनुसार लाइव/डेड फिजिबिलिटी परख किट का उपयोग करके 5 दिनों के बाद बायोरिएक्टर खेती के बिना दो स्तरित ट्यूबलर मचानों की आंतरिक सतहों पर सेल प्रतिक्रियाओं का निर्धारण करें । जेड-स्टैक टूल का उपयोग करके कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी के माध्यम से छवियां प्राप्त करें।
- तीसरे दिन, एक स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (एसईएम) के माध्यम से एचएमएससी-वरीयता प्राप्त ट्यूबलर पाड़ की सतह आकृति विज्ञान का निरीक्षण करें।
- पाड़ को ठीक करें जो 2.5% ग्लूटाराल्डिहाइड और ओओ4 के साथ 24 घंटे के लिए एचएसएमएससी के साथ इनक्यूबेटेड था और इथेनॉल के साथ निर्जलित था।
- आर्गन वायुमंडलीय स्थितियों के तहत एक स्पंदन कोटर का उपयोग कर प्लेटिनम के साथ निश्चित hMSCs कोट और 25 केवी के एक त्वरित वोल्टेज पर एसईएम छवियों को प्राप्त करते हैं ।
3. पशु सर्जरी के लिए शल्य चिकित्सा की तैयारी
नोट: गैस्ट्रोस्टोमी और एसोफेगल प्रत्यारोपण दोनों से पहले सर्जिकल तैयारी लागू की जाती है।
- बाँझ सर्जिकल उपकरणों की स्थापना: स्केलपेल ब्लेड, Weitlaner reट्रैक्टर, माइक्रोनीडल धारक, माइक्रोसुचर संदंश, माइक्रोऊतक संदंश, माइक्रोकैंची, मेयो-हेगर सुई धारक, ऑपरेटिंग कैंची, आईरिस कैंची, ड्रेसिंग संदंश, ऊतक संदंश, किरच संदंश, आईरिस संदंश, 5 मिली सिरिंज (21 जी सुई), 10 मिली सिरिंज (22 जी सुई), 9-0 पॉलीमाइड सीवन, 4-0 पॉलीग्लैक्टिन सीवन।
- तिल्टामाइन/ज़ोलाज़ेपम (50 मिलीग्राम/जी खुराक) और 2% जाइलाज़ीन हाइड्रोक्लोराइड (2 मिलीग्राम/किलो खुराक) के इंट्रामस्कुलर इंजेक्शन वाले जानवर को एनेस्थेटिज़ करें।
नोट: वयस्क स्प्राग-डाबले (एसडी) 398-420 ग्राम वजनी चूहों का उपयोग एसोफेगल प्रत्यारोपण के लिए किया जाता था। - सर्जिकल ड्रेप में स्थानांतरित करने से पहले, संदंश के साथ पूंछ को चुटकी देकर जानवर की उचित संवेदनाकारक स्थिति की जांच करें।
- बाँझ कपड़े पर एक सुप्लिन स्थिति में जानवर रखें और गर्दन से बालों को हटाने के लिए कतरनी का उपयोग करें (एसोफेगल प्रत्यारोपण के लिए) या पेट (गैस्ट्रोस्टोमी के लिए)। इसके बाद सर्जिकल साइट को बीटाडीन और 70% इथेनॉल से स्क्रब करें।
- चीरा लगाने से पहले, दर्द से राहत के लिए एक एनाल्जेसिक जैसे बुप्रेनोर्फिन (0.05-0.1 मिलीग्राम/किलो) इंजेक्ट करें।
4. चूहों में टी-ट्यूब का उपयोग करके गैस्ट्रोस्टोमी सर्जरी
नोट: अस्थायी बाईपास नोओरल ट्यूब फीडिंग (एन = 5) की अनुमति देने के लिए सभी प्रयोगात्मक जानवरों में एक संशोधित गैस्ट्रोस्टोमी किया गया था।
- सर्जरी से पहले दिन चूहों को तेज करें। धारा 3 में के रूप में सर्जरी तैयार करें।
- त्वचा और एनेस्थेटाइज्ड चूहों की पेट की मांसपेशियों के मिडलाइन चीरा के माध्यम से पेट को बेनकाब करें।
- स्कैल्पेल ब्लेड के साथ पूर्वकाल गैस्ट्रिक दीवार में 3 मिमी छिद्र बनाएं।
- इसे पेट की दीवार पर ठीक करने के लिए डिफेक्ट साइट में सिलिकॉन टी-ट्यूब की नोक डालें।
- सीवन ठीक से ताकि टी-ट्यूब गैस्ट्रिक वॉल से अलग न हो।
- गर्दन के पीछे चमड़े के नीचे सुरंग के माध्यम से प्रत्यारोपित टी ट्यूब के डिस्टल अंत बाहर ले लो ।
- पेट की सामग्री को पीछे की ओर बहने से रोकने के लिए टी-ट्यूब के अंत तक हेपरिन कैप डालें।
नोट: हेपरिन कैप के साथ टी-ट्यूब के अंत को जोड़ने के लिए एंजियोथेटर का उपयोग करें। - 4-0 पॉलीग्लैक्टिन टांके का उपयोग करपेट की दीवार और त्वचा की सभी परतों को टांका।
- गैस्ट्रोस्टोमी पूरा होने के बाद सभी प्रयोगात्मक चूहों को मेटाबॉलिक पिंजरे में अलग रखें।
5. एसोफेगल प्रत्यारोपण
नोट: दो स्तरित ट्यूबलर पाड़ का एसोफेगल प्रत्यारोपण गैस्ट्रोस्टोमी (एन = 5) के 1 सप्ताह बाद किया जाता है। प्रत्यारोपण से पहले, इनोक्यूलेट एचएमएससी (सेल घनत्व: 1 x 106 कोशिकाओं/तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स में mL) प्रत्येक पाड़ की भीतरी दीवार में और बायोरिएक्टर प्रणाली में 3 दिनों के लिए इनक्यूबेट । सर्जिकल प्रक्रिया इस प्रकार है।
- मॉडल जानवरों की गर्दन के बालों को हटा दें और एसेप्टिक सर्जरी के लिए सर्जिकल साइट के मानक ड्रैपिंग करें।
नोट: जानवर पर एकसंवादी सर्जरी बनाए रखने के लिए एक बड़े शेविंग क्षेत्र बनाने की सिफारिश की जाती है। - गर्दन के पूर्वकाल औसत चीरा के बाद, पट्टा मांसपेशियों को अलग करें और श्वासनली संरचना को बेनकाब करें।
- स्पष्ट रूप से खंड को फिर से काटने से पहले घेघा से अस्पष्ट तंत्रिका को विच्छेदन करें, अन्यथा जानवर की सांस लेने से समझौता किया जाता है।
- आवर्धन के तहत, श्वासनली से घेघा के बाईं ओर को अलग करें और थायराइड ग्रंथि से ऊपरी हिस्से को सावधानीपूर्वक अलग करें।
- सर्जिकल कैंची का उपयोग करघे की सभी परतों वाले 5 मिमी लंबे पूर्ण परिस्थितिजन्य दोष बनाएं।
नोट: एसोफेगल प्रत्यारोपण से पहले, प्रत्यारोपण स्थल की लंबाई से मेल खाने के लिए सर्जिकल कैंची का उपयोग करतैयार मचान में कटौती करें। - एक माइक्रोस्कोप के नीचे, 9-0 सीवन धागे का उपयोग करके डिस्टल एसोफेजल दोष के दोनों सिरों पर माइक्रोएनास्टोमोसिस करें। ऊपरी घेघा अवशेष और पाड़ के सही अनुमान के बीच पहला सीवन रखें। ऊपरी घेघा अवशेष और पाड़ के बीच दाएं से बाएं तक सफ़ेद जारी रखें। Anastomose पाड़ कम घेघा अवशेष के ऊपरी मार्जिन के रूप में एक ही तरीके से ।
नोट: एसोफेगल प्रत्यारोपण के लिए नैदानिक सर्जरी में उपयोग किए जाने वाले माइक्रोवैस्कुलर एनास्टोमोसिस का प्रदर्शन करें। प्रत्यारोपण साइट के सटीक, निर्विवाद सुचरूप के लिए एक माइक्रोस्कोप के साथ काम करते हैं। - बाद में, ग्राफ्ट के स्थिर रखरखाव और संवहनी आपूर्ति सुनिश्चित करने के लिए प्रत्यारोपित साइट पर आसपास के थायराइड ग्रंथि फ्लैप रखना ।
- प्रत्यारोपण के बाद, चमड़े के नीचे की मांसपेशी और त्वचा के ऊतकों को 4-0 विरिल सीवन के साथ सिलाई करें।
- सभी प्रयोगात्मक चूहों को मेटाबोलिक पिंजरों में व्यक्तिगत रूप से रखें।
6. पोस्ट-ऑपरेटिव प्रक्रियाएं
नोट: पोस्टऑपरेटिव प्रक्रियाओं दोनों गैस्ट्रोस्टोमी और एसोफेगल प्रत्यारोपण के बाद किया जाता है।
- पेट के घाव को बंद करने के बाद, चूहों को व्यक्तिगत मेटाबोलिक पिंजरों में डाल दें और हाइपोथर्मिया को रोकने के लिए अवरक्त वार्मिंग उपकरणों पर पिंजरों को रखें।
- जानवरों की निगरानी तब तक करें जब तक वे स्टर्नल रीक्यूबेंसी को प्राप्त न करें और बनाए रखें (यानी, छाती पर सीधा झूठ बोलना)।
- सर्जिकल साइट पर सूजन को कम करने के लिए चूहों को रोजाना एंटीबायोटिक जेंटेमिकिन (20 मिलीग्राम/किलो) का प्रबंध करें ।
- अध्ययन के अंतिम बिंदु तक तीसरे पश्चात दिन पर मौखिक तरल भोजन शुरू करें। सर्जरी के बाद दिन की शुरुआत होने वाले हेपरिन कैप 3x प्रति दिन के माध्यम से पूरे पोषण सूत्र (20.6 ग्राम/100 मिलीलीटर [जी%)कार्बोहाइड्रेट, 3.8 ग्राम% प्रोटीन, 0.2 ग्राम वसा) की आपूर्ति करें।
- जानवरों की उपस्थिति और शरीर के वजन की दैनिक जांच करें। व्यवहार का प्रबंधन करने के लिए जांच करें, जैसे स्वयं को नुकसान पहुंचाने वाली चीरा साइट या ट्यूब के सेवन के प्रतिरोध, साथ ही विभिन्न सर्जिकल जटिलताओं। जब चूहे के मॉडल के शरीर का वजन 20% या उससे अधिक तेजी से कम हो जाता है, तो सीओ2 साँस लेना द्वारा इच्छामृत्यु का प्रदर्शन करें।
7. हिमेटोलॉजी और इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री
नोट: हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण के लिए, इच्छामृत्यु वाले जानवरों के सभी एसोफेगल ऊतक शल्य चिकित्सा कैंची का उपयोग करके निकाले जाते हैं। हेमैटोक्सिलिन और इओसिन धुंधला और मैसन की ट्राइक्रोम धुंधला मानक हिस्टोलॉजिकल तकनीकों का उपयोग करके किया गया था। इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री निम्नलिखित प्रोटोकॉल के अनुसार किया गया था।
- 4% पैराफॉर्मलडिहाइड में प्रत्यारोपित साइटों वाले पूरे घेघा को ठीक करें। एक पैराफिन ब्लॉक बनाएं और 4 माइक्रोन मोटी धाराओं में कटौती करें।
- ऊतक वर्गों को डिपराफिन करें और उन्हें इथेनॉल श्रृंखला में निर्जलित करें। माइक्रोवेव में 10 मीटर के लिए साइट्रेट बफर और गर्मी में ऊतक स्लाइड विसर्जित कर दें। 20 मिन के लिए ठंड पीबीएस के साथ कोशिकाओं को ठंडा करें। 6 मिन के लिए 3% हाइड्रोजन पेरोक्साइड में विसर्जित करें, और 10 मिन के लिए पीबीएस से धोएं।
- ऊतक वर्गों की गैर-विशिष्ट प्रतिक्रियाओं को अवरुद्ध करने के लिए कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए 3% गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए) में इनक्यूबेट।
- 5 मिन के लिए पीबीएस के साथ 3x धोएं। डेसमिन के खिलाफ प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेट (1:200 से पतला), केराटिन 13 (1:100 से पतला), और वॉन विल्लेब्रांड फैक्टर (vWF; पतला से 1:100) रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर ।
- 15 न्यूनतम के लिए पीबीएस के साथ 3x धोएं। कमरे के तापमान पर डेसमिन और केराटिन 13 के लिए 1:500 की एकाग्रता पर उपयुक्त माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेट। फिर, 10 मिन के लिए पीबीएस के साथ दो बार स्लाइड धोएं।
नोट: वीडब्ल्यूएफ के लिए ऊतक वर्गों को एक सहिजन पेरोक्सिडाइड किट (सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग करके इनक्यूबेटेड किया गया था और फिर 3,3'-डिमिनोबेंजिडीन (डीएबी) का उपयोग करके कल्पना की गई थी। - बढ़ते माध्यम वाले ग्लास कवरस्लिप और 4',6-डिमिडिनो-2-फेनोलिंडॉल (डीएपीआई) का उपयोग करके माउंट करें।
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Representative Results
चित्रा 1 पीयू-पीसीएल दो स्तरित ट्यूबलर पाड़ की विनिर्माण प्रक्रिया का एक योजनाबद्ध आरेख दिखाता है। पीयू समाधान 200 माइक्रोन की मोटाई के साथ एक बेलनाकार आंतरिक संरचना बनाने के लिए 18 जी सुई से इलेक्ट्रोस्पपन किया गया था। इसके बाद पिघला हुआ पीसीएल पीयू नैनोफाइबर की बाहरी दीवार पर नियमित अंतराल पर छपा। पूरा ट्यूबलर पाड़ की भीतरी और बाहरी दीवारों की सतह आकृति विज्ञान स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी छवियों में देखा जा सकता है।
चित्रा 2 बाहरी पोषक तत्वों की आपूर्ति के लिए चूहे में गैस्ट्रोस्टोमी ट्यूब डालने की प्रक्रिया को दर्शाता है(चित्रा 2ए)। टी के आकार की सिलिकॉन ट्यूब पेट की दीवार में डाला गया था और sutured(चित्रा 2बी)। ट्यूब तो चमड़े के नीचे सुरंग के माध्यम से गर्दन के पीछे करने के लिए ले जाया गया था और एक हेपरिन टोपी(चित्रा 2सी)के साथ जुड़ा हुआ है । ट्यूब तरल भोजन के इंजेक्शन की सुविधा प्रदान करता है। यह ट्यूबों के माध्यम से गैस्ट्रिक सामग्री के रिवर्स फ्लो को भी प्रतिबंधित करता है।
चित्रा 3 पाड़ की भीतरी दीवार, बायोरिएक्टर खेती, और एसोफेगल प्रत्यारोपण पर सेल टीका की प्रक्रिया को दर्शाता है। एचएमएससी-एम्बेडेड बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स इंजेक्शन(चित्रा 3ए)के माध्यम से पाड़ की भीतरी दीवार पर समान रूप से लागू किया गया था। एसईएम छवि कोशिका से जुड़ी आंतरिक सतह की आकृति विज्ञान दिखाती है। दो स्तरित ट्यूबलर पाड़ (चमकदार सतह) पर सेल व्यवहार्यता का विश्लेषण करने के लिए लाइव/डेड धुंधला ने संकेत दिया कि अधिकांश कोशिकाएं व्यवहार्य थीं, और वे 5 दिनों में नैनोफाइबर संरचना पर अच्छी तरह से फैल गईं । कोशिकाओं के साथ टीका लगापाड़ बायोरिएक्टर के लिए तय किया गया था, और कतरनी तनाव पंप(चित्रा 3बी)द्वारा लागू किया गया था । बायोरिएक्टर खेती सहित एचएमएससी-वरीयता प्राप्त ट्यूबलर मचान को माइक्रोसुचर तकनीकों के माध्यम से पूर्ण परिस्थितिजन्य एसोफेगल दोषों के साथ चूहों में प्रत्यारोपित किया गया था । भ्रष्टाचार स्थिर निर्धारण और प्रत्यारोपित साइट(चित्रा 3सी)की संवहनी आपूर्ति के लिए एक थायराइड ग्रंथि फ्लैप के साथ कवर किया गया था । प्रत्यारोपण के बाद चूहों का वजन परिवर्तन प्रयोग के अंत तक देखा गया। एसोफेगल प्रत्यारोपित चूहे 9वें दिन तक 340 ग्राम पर रहे, लेकिन फिर विभिन्न कारणों(चित्रा 3डी)के कारण वजन में तेजी से कमी आई। नतीजतन, 15 दिनों के भीतर अधिकांश जानवरों की मृत्यु हो गई।
चित्रा 4 भ्रष्टाचार प्रत्यारोपण के बाद एसोफेगल उत्थान से पता चलता है । यद्यपि अधिकांश चूहों ने हेयरबॉल के कारण नियोसोफेगल बाधा विकसित की, लेकिन फिस्टुला के साथ एनास्टोमोसिस रिसाव, सेरोमा संचय, फोड़ा गठन, या किसी भी प्रयोगात्मक चूहे में नरम ऊतक परिगलन के साथ एनास्तोमोसिस रिसाव का कोई सकल सबूत नहीं था। प्रत्यारोपण स्थल के पुनः अधिसंचलन की पुष्टि प्रतिरक्षण द्वारा केराटिन 13 के लिए धुंधला कर दिया गया था । कोलेजन परत और इलास्टिन फाइबर की आकृति विज्ञान को पुनर्जनन स्थल पर स्पष्ट रूप से पुष्टि की गई थी। प्रचुर मात्रा में इलास्टिन और कोलेजन फाइबर की उपस्थिति बेहतर यांत्रिक गुणों में योगदान दे सकती है। एसोफेगल मांसपेशियों की परत का पुनर्जनन डेस्मिन इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री द्वारा प्रदर्शित किया गया था, और इस साइट पर प्रचुर मात्रा में नियोवैस्कुलराइजेशन मनाया गया था।
चित्रा 1: 2 स्तरित ट्यूबलर मचान बनाने के लिए उपयोग की जाने वाली प्रक्रिया का योजनाबद्ध चित्रण। पीयू(ए)का उपयोग करके आंतरिक झिल्ली को निर्मित करने के बाद, ट्यूबलर पाड़ की संरचनात्मक ताकत को सॉल्वेंट(बी)के बिना 3 डी प्रिंटिंग सिस्टम का उपयोग करके झिल्ली की बाहरी सतह में किस्में जोड़कर मजबूत किया गया था। एसईएम छवि 2 स्तरित ट्यूबलर पाड़ की आंतरिक और बाहरी परतों की आकृति विज्ञान दिखाती है। (संक्षिप्त: पीयू = पॉलीयूरेथेन)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 2: गैस्ट्रोस्टोमी। (A)गैस्ट्रिक वॉल में टी-ट्यूब सम्मिलन के माध्यम से गैस्ट्रोस्टोमी तकनीक ों को दिखाने वाला एक योजनाबद्ध आरेख। (ख)फोरपेट के बीच में पंचर छेद बनाया जाता है, और टी-ट्यूब टिप को फोरपेट में डाला जाता है। (ग)टी-ट्यूब का इनलेट हिस्सा ओसिपुट के बीच में हेपरिन कैप के साथ स्थित है । नीचे दिया गया आंकड़ा विभिन्न घटकों के साथ एक टी-ट्यूब गैस्ट्रोस्टोमी उपकरण प्रस्तुत करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 3: एसोफेगल प्रत्यारोपण। (A)तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स में समझाया hMSCs दो स्तरित ट्यूबलर पाड़ की भीतरी परतों पर वरीयता प्राप्त थे । एसईएम छवि भीतरी दीवार पर एचएमसीएस की आकृति विज्ञान दिखाती है। टीका लगाने वाली कोशिकाओं की व्यवहार्यता की पुष्टि लाइव-डेड धुंधला (हरी = लाइव कोशिकाओं) द्वारा भी की गई थी। एचएमएससी-वरीयता प्राप्त मचानों को तुरंत बायोरिएक्टर प्रणाली(बी)में इनक्यूबेटेड किया गया था, और फिर ऊतक-इंजीनियर एसोफैगी को सर्वाइकल एसोफैगस(सी)में प्रत्यारोपित किया गया था। प्रत्यारोपित साइट स्थिर एसोफेगल पुनर्निर्माण (तीर) के लिए एक थायराइड ग्रंथि फ्लैप के साथ कवर किया गया था । (D)एसोफेगल प्रत्यारोपण के बाद वजन घटाने का अध्ययन। वजन घटाने चूहों के प्रारंभिक वजन से पूर्ण परिवर्तन के रूप में निर्धारित किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 4: ऑर्थोटोपिक पाड़ प्रत्यारोपण के 2 सप्ताह बाद पुनर्निर्मित घेघा की पूरी हिस्टोलॉजी। मैसन का ट्राइक्रोम धुंधला प्रत्यारोपित साइटों के आसपास कोलेजन जमाव दिखाता है। एसोफेगल मांसपेशियों और म्यूकस परतों के पुनर्जनन की पुष्टि क्रमशः डेसमिन (हरे) और केराटिन 13 (लाल) इम्यूनोस्टेनिंग द्वारा की गई थी। इसके अतिरिक्त, पुनर्जीवित म्यूकोसल परत के आसपास नियोवैस्कुलराइजेशन (तीर) स्पष्ट रूप से देखा गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
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Discussion
कृत्रिम एसोफैगी पर मौजूदा पशु अध्ययन अभी भी कई महत्वपूर्ण कारकों द्वारा सीमित हैं। आदर्श कृत्रिम एसोफेगल पाड़ जैव संगत होना चाहिए और उत्कृष्ट भौतिक गुण होना चाहिए। यह एनास्टोमोटिक रिसाव को रोकने के लिए प्रारंभिक पश्चात अवधि में म्यूकोसल एपिथेलियम को पुनर्जीवित करने में सक्षम होना चाहिए। आंतरिक परिपत्र और बाहरी देशीयमंडल की मांसपेशियों की परतों का पुनर्जनन कार्यात्मक पेरिस्टेलसिस12,13के लिए भी महत्वपूर्ण है ।
घेघा की यांत्रिक विशेषताएं आवश्यक हैं क्योंकि घेघा श्वसन के दौरान गिर जाता है और निगलने के दौरान खुलता है, एक हटना घटना14के साथ अधिकतम खींचके लिए लगातार जोखिम के साथ। प्रत्यारोपित पाड़ में इन यांत्रिक विशेषताओं के रूप में अच्छी तरह से होना चाहिए । प्रत्यारोपित घेघा की चिपचिपाहट घेघा के माध्यम से परिधीय आंदोलन के दोहराव रैंप-विश्राम के लिए पर्याप्त होना चाहिए। मचान जो बहुत कमजोर हैं, वे टूट सकते हैं या लीक हो सकते हैं और प्राप्तकर्ता में गंभीर स्थितियों (जैसे, मध्यस्थता) का कारण बन सकते हैं। इसके विपरीत, एक पाड़ जो बहुत कठोर है, एसोफेगल लुमेन में उभार सकता है और भोजन मार्ग को रोक सकता है। इलेक्ट्रोस्पन नैनोफाइबर में एसोफेगल पुनर्निर्माण के लिए बहुत अनुकूल भौतिक गुण होते हैं। ईसीएम की स्थलाकृतिक प्रकृति एसोफेगल परतों15में एपिथेलियल कोशिकाओं के प्रवास और भेदभाव के लिए अनुकूल वातावरण प्रदान करती है। इसमें नैनोपोर संरचना भी है जो लार और विभिन्न रोगजनकों के रिसावकोरोकती है । हालांकि, इलेक्ट्रोस्पॉनित नैनोफाइबर से बने मचान ों का उनके नरम यांत्रिक गुणों के कारण सीमित उपयोग होता है। इस समस्या को हल करने के लिए, हमने 3डी प्रिंटिंग तकनीक का उपयोग करके उनकी यांत्रिक ताकत में सुधार किया। नैनोफाइबर की बाहरी परत पर 3 डी मुद्रित स्ट्रैंड की चौड़ाई 780 माइक्रोन है, और आंतरिक पोर संरचना काफी चौड़ी है। यह आसपास के ऊतकों के उत्थान का मार्गदर्शन करने के बजाय esophageal हस्तक्षेप के लिए भौतिक समर्थन प्रदान करता है ।
इस अध्ययन में, 2 सप्ताह तक के लिए बायोरिएक्टर सुसंस्कृत ग्राफ्ट में परिधि एसोफेगल दोष पूरी तरह से ठीक हो गए थे, लेकिन सर्जरी के बाद 15 दिनों के भीतर सभी प्रायोगिक चूहों की मृत्यु हो गई। सबसे अधिक मौतें पेरिटोनाइटिस और कुपोषण के कारण भोजन और लार लीक समीपस्थ एनास्टोमोसिस साइट पर हुई । सभी जानवरों ने स्वतंत्र रूप से एक सप्ताह तक तरल आहार का सेवन किया, लेकिन जैसे ही घाव भरने की प्रगति हुई, हेयरबॉल निगलने के कारण पुनर्निर्मित घेघा में अनपेक्षित यांत्रिक बाधा हुई। इस घटना को प्रत्यारोपित गैर गतिशील मचान के भीतर पूरा पाचन विकार का कारण दिखाया गया है । इन तकनीकी मुद्दों को दूर करने के लिए कई विकल्प हैं। सबसे पहले, एक अत्यधिक लोचदार एसोफेगल प्रत्यारोपण का विकास जो एसोफेगल पेरिस्टेलसिस की नकल कर सकता है। दूसरा, पशु बालों को निगलने से रोकने के लिए बाल हीन चूहों का उपयोग अध्ययन। तीसरा, बिलियरी स्टेंट को पाड़ के साथ प्रत्यारोपण पतन और एनास्टोमोसिस क्षति को कम करने के लिए एक साथ लागू किया जा सकता है। इसके अलावा, लार के रिसाव को पूरी तरह से रोकने के लिए एसोफेगल पाड़ प्रत्यारोपण के लिए माइक्रोवैस्कुलर एनास्टोमोसिस का आवेदन महत्वपूर्ण है। नग्न आंखों का उपयोग कर पारंपरिक सीवन तकनीक चूहे के मॉडल में निर्विवाद बनाना बेहद मुश्किल है।
पुनर्जनन के शुरुआती दौर में पोषक तत्वों, विकास कारकों और ऑक्सीजन की आपूर्ति के लिए एक विश्वसनीय संवहनी वाहन आवश्यक है। थायराइड ग्रंथि घेघा के पास स्थित संवहनी ऊतक है। हमने चूहे के मॉडल में इसकी आसान पहुंच के कारण परिधि एसोफेजक्टोमी के बाद थायराइड ग्रंथि फ्लैप का उपयोग किया। निष्कर्ष में, हम चूहा मॉडल में एसोफेगल पुनर्निर्माण की कठिनाइयों को दूर करने के लिए विभिन्न प्रीक्लिनिकल तकनीकों का प्रस्ताव करते हैं। यह अध्ययन पारंपरिक छोटे पशु घेघा प्रत्यारोपण की सीमाओं को दूर करने के लिए एक अच्छा विकल्प प्रस्तुत करता है ।
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Disclosures
इस अध्ययन के लिए तैयार किए गए बायोरिएक्टर सिस्टम का व्यावसायीकरण किया गया है (मॉडल नंबर: एसीबीएफ-100)।
Acknowledgments
इस शोध को कोरिया स्वास्थ्य प्रौद्योगिकी अनुसंधान एवं विकास परियोजना द्वारा कोरिया स्वास्थ्य उद्योग विकास संस्थान (खिचड़ी) के माध्यम से समर्थन दिया गया था, जो स्वास्थ्य और कल्याण मंत्रालय द्वारा वित्त पोषित था, कोरिया गणराज्य (अनुदान संख्या: HI16C0362) और बुनियादी विज्ञान अनुसंधान शिक्षा मंत्रालय (2017R1C1B201132) द्वारा वित्त पोषित नेशनल रिसर्च फाउंडेशन ऑफ कोरिया (एनआरएफ) के माध्यम से कार्यक्रम। इस अध्ययन में इस्तेमाल किए गए बायोनमूज और डेटा कोरिया बायोबैंक नेटवर्क के सदस्य सियोल नेशनल यूनिवर्सिटी हॉस्पिटल के बायोबैंक द्वारा उपलब्ध कराए गए थे ।
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Metabolic cage | TEUNGDO BIO & PLANT | JD-C-66 | |
Zoletil (50 mg/g dose) | Virbac | 1000000188 | |
0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
1 mL Syringe | BD | 309659 | |
2% xylazine hydrochloride (Rumpun) | Byely | Q-0615-035 | |
4% paraformaldehyde | BIOSOLUTION | BP031 | |
4-0 Vicryl | ETHICON | W9443 | |
9-0 Vicryl | ETHICON | W2813 | |
Antibiotic gentamicin (Septopal). | Septopal | 0409-1207-03 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | 5470 | |
Citrate Buffer, ph6.0, 10X | Sigma | C9999 | |
DAB PEROXIDASE SUBSTRATE KIT | VECTOR | SK4100 | |
Desmin | Santa Cruz | sc-23879 | |
Elastic stain kit | ScyTeK | ETS-1 | |
Ethanol | Merck | 100983 | |
Ethanol | Merck | 64-17-5 | |
Fetal Bovine Serun (FBS) | Gibco | 16000-044 | |
Glutaraldehyde | Sigma | 354400 | |
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody | ThermoFisher | A-11001 | |
Heparin cap | Hyupsung Medical | HS-T-05 | |
hMSC (STEMPRO) / growth medium (MesenPRO RSTM) |
Invitrogen | R7788-110 | |
Horseradish peroxidase-conjugated kit (Vectastain) | VECTOR | PK7800 | |
Hydrogen peroxide | JUNSEI | 7722-84-1 | |
Keratin13 | Novus | NBP1-97797 | |
LIVE/DEAD Viability Assay Kit | Molecular Probes | L3224 | |
Matrigel | Corning | 354262 | |
N,N-dimethylformamide (DMF) | Sigma | 227056 | |
Nonadherent 24-well tissue culture plates. |
Corning | 3738 | |
OsO4 | Sigma | O5500 | |
Petri dish | Eppendorf | 3072115 | |
Phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 10010-023 | |
Phosphate-buffered saline (PBS), 10X | BIOSOLUTION | BP007a | |
Polycaprolactone (PCL) polymer | Sigma | 440744 | |
Polyurethane (PU+A2:A24) polymer | Lubrizol | 2363-80AE | |
Power Supply | NanoNC | HV100 | |
ProLong Gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P36931 | |
Rumpun | Bayer | Q-0615-035 | |
Silicone T-tube | Sewoon Medical | 2206-005 | |
Terramycin Eye Ointment | Pfizer Pharmaceutical Korea | W01890011 | |
Tiletamine/Zolazepam (Zoletil) | Virbac Laboratories | Q-0042-058 | |
Trichrome stain kit | ScyTeK | TRM-1 | |
von Willebrand Factor (vWF) | Santa Cruz | sc 14014 |
References
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