माइक्रोवेल संस्कृति का उपयोग करके टेस्टिस विशिष्ट वास्तुकला के साथ पोरसिन वृषण ऑर्गनॉइड्स का उत्पादन
Summary
यहाँ, हम व्यावसायिक रूप से उपलब्ध microwell संस्कृति प्रणाली का उपयोग वृषण विशिष्ट ऊतक वास्तुकला के साथ porcin वृषण organoids के reproduible पीढ़ी के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं.
Abstract
Organoids तीन आयामी कई प्रकार है कि ऊतक वास्तुकला और विवो में अंगों के कार्यों recapitulating करने में सक्षम हैं से बना संरचनाओं रहे हैं. ऑर्गेनोइड्स के गठन ने बुनियादी और अनुवाद अनुसंधान के विभिन्न रास्ते खोल दिए हैं। हाल के वर्षों में, वृषण organoids पुरुष प्रजनन जीव विज्ञान के क्षेत्र में रुचि बढ़ी है. वृषण organoids सेल सेल बातचीत के अध्ययन के लिए अनुमति देते हैं, ऊतक विकास, और रोगाणु सेल आला microenvironment और उच्च थ्रूपुट दवा और विषाक्तता स्क्रीनिंग की सुविधा. एक विधि मज़बूती से और reproducibly वृषण विशिष्ट ऊतक वास्तुकला के साथ वृषण organoids उत्पन्न करने के लिए आवश्यक है. माइक्रोवेल संस्कृति प्रणाली पिरामिड के आकार microwells के एक घने सरणी शामिल हैं. पूर्व-पबरताल वृषण से प्राप्त वृषण कोशिकाओं को इन माइक्रोवेल्स में centrifuged और वृषण-विशिष्ट ऊतक वास्तुकला और सेल संघों के साथ वृषण organoids उत्पन्न करने के लिए सुसंस्कृत कर रहे हैं। सजातीय organoids के हजारों इस प्रक्रिया के माध्यम से उत्पन्न किया जा सकता है. यहाँ रिपोर्ट प्रोटोकॉल पुरुष प्रजनन का अध्ययन शोधकर्ताओं के लिए व्यापक हित का हो जाएगा.
Introduction
हाल के वर्षों में, वहाँ तीन आयामी (3 डी) organoids में ब्याज की एक पुनरुत्थान किया गया है. विभिन्न अंगों जैसे आंत1, पेट2, अग्न्याशय3,4,यकृत5, और मस्तिष्क6 को सफलतापूर्वक 3 डी ऑर्गनॉइड सिस्टम में प्राप्त किया गया है। इन organoids vivo में अंगों के लिए वास्तु और कार्यात्मक समानताएं हैं और मोनोलेयर संस्कृति प्रणाली7की तुलना में ऊतक सूक्ष्म पर्यावरण के अध्ययन के लिए और अधिक जैविक रूप से प्रासंगिक हैं . इसके परिणामस्वरूप , वृषण अंगाभों ने भीरुचिजुटाना शुरू कर दिया है. अब तक सूचित अधिकांश विधियां जटिल, गैर उच्च थ्रूपुट10 हैं और इसके लिए ईसीएम प्रोटीन8,10के अलावा की आवश्यकता होती है . यह जटिलता भी reproducibility के साथ मुद्दों की ओर जाता है. एक सरल और reproduible विधि की जरूरत है कि सेल-एसोसिएशन कि विवो में वृषण की तरह हैं के साथ वृषण organoids की पीढ़ी के लिए अनुमति देता है.
हमने हाल ही में इन आवश्यकताओं को पूरा करने के लिए एक प्रणाली की सूचना दीहै. एक मॉडल के रूप में सुअर का उपयोग करना, हम microwell प्रणाली में एक केन्द्रापसारक मजबूर एकत्रीकरण दृष्टिकोण कार्यरत हैं. माइक्रोवेल प्रणाली में, प्रत्येक कुएं में बड़ी संख्या में समान छोटे माइक्रोवेल्स13होते हैं। यह एक समान आकार के कई गोलभों की पीढ़ी के लिए अनुमति देता है. माइक्रोवेल प्रणाली एक वृषण-विशिष्ट वास्तुकला के साथ एक समान organoids की बड़ी संख्या के उत्पादन में सक्षम. प्रणाली सरल है और ECM प्रोटीन के अलावा की आवश्यकता नहीं है.
Protocol
Representative Results
Discussion
हम एक सरल विधि है कि ऊतक वास्तुकला है कि vivo12में वृषण के समान है के साथ वृषण organoids की बड़ी संख्या के अनुरूप, repeatable पीढ़ी की अनुमति देता है की स्थापना की है. जबकि दृष्टिकोण porcin वृषण कोशिकाओं का उपयोग कर व?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस कार्य को NIH/NICHD HD091068-01 द्वारा डॉ इना डोब्रिन्स्की को समर्थित किया गया था।
Materials
| 100 mm ultra low attachment tissue culture dish | Corning | #CLS3262 | |
| 100 mm tissue culture dish | Corning | #353803 | |
| Aggrwell 400 | Stemcell Technologies | #34411 | |
| Anti-Adherence Rinsing Solution | Stemcell Technologies | #07010 | |
| Collagenase type IV from Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | #C5138 | referred as Collagenase IV S |
| Collagenase type IV Worthington | Worthington-Biochem | #LS004189 | referred as Collagenase IV W |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | #DN25 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/F12 | Gibco | #11330-032 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium – high glucose | Sigma-Aldrich | #D6429 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | #D8537 | |
| Epidermal Growth Factor | R&D Systems | #236-EG | |
| Falcon Cell Strainers 70 µm | FisherScientific | #352350 | |
| Falcon Cell Strainers 40 µm | FisherScientific | #352340 | |
| Fetal Bovine Serum | ThermoFisher Scientific | #12483-020 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium | Gibco | #41400-045 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | #P4333 | |
| Porcine testicular tissue | Sunterra Farms Ltd (Alberta, Canada) | ||
| Steriflip-GP Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit | Millipore | #SCGP00525 | |
| Trypsin-EDTA | Sigma | #T4049 |
References
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