在这里,我们提出了一个协议,用于使用市售的微孔培养系统,用睾丸特定组织架构的可重复生成猪睾丸器官。
有机体是由多种细胞类型组成的三维结构,能够概括组织结构和体内器官的功能。有机物的形成开辟了基础研究和转化研究的不同途径。近年来,睾丸器官在男性生殖生物学领域引起了兴趣。睾丸类有机物允许研究细胞-细胞相互作用、组织发育和生殖细胞利基微环境,并促进高通量药物和毒性筛选。需要一种方法,以可靠和可重复地生成睾丸器官与睾丸特定的组织结构。微井培养系统包含密集的金字塔形微井阵列。从青春期前睾丸中提取的睾丸细胞被离心到这些微孔中,并培养成具有睾丸特异性组织架构和细胞关联的睾丸器官。通过这一过程可以产生数千个均质有机体。这里报道的协议将引起研究男性生殖的研究人员的广泛兴趣。
近年来,人们对三维(3D)有机体的兴趣重新抬头。不同的器官,如肠1,胃2,胰腺3,4,肝脏5,和大脑6已经成功地衍生成3D器官系统。与单层培养系统7相比,这些有机物与体内器官具有建筑和功能上的相似性,在研究组织微环境方面更具生物学相关性。结果,睾丸类物开始引起兴趣,以及8,9,10,11,12。迄今报告的大多数方法都是复杂的,非高通量10,并且需要添加ECM蛋白8,10。这种复杂性还会导致重现性问题。需要一种简单且可重复的方法,允许生成具有细胞关联(类似于体内睾丸)的睾丸器官。
我们最近报告有一个系统,以解决这些问题的要求12。以猪为模型,我们在微井系统中采用了离心强制聚集方法。在微井系统中,每口井都含有大量相同的小微井13。这允许生成大量均匀大小的球体。微井系统能够生成大量具有睾号特异性架构的均匀有机体。该系统简单,不需要添加ECM蛋白。
我们已经建立了一个简单的方法,允许一致,可重复地生成大量的睾丸器官与组织结构,类似于睾丸在体内12。该方法是利用猪睾细胞开发的,但更广泛地适用于小鼠、非人类灵长类动物和人类睾人。已报告生产睾丸类有机物8、9、10、11的多种不同方法。Baert等人通…
The authors have nothing to disclose.
这项工作得到了NIH/NICHD HD091068-01对伊娜·多布林斯基博士的支持。
100 mm ultra low attachment tissue culture dish | Corning | #CLS3262 | |
100 mm tissue culture dish | Corning | #353803 | |
Aggrwell 400 | Stemcell Technologies | #34411 | |
Anti-Adherence Rinsing Solution | Stemcell Technologies | #07010 | |
Collagenase type IV from Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | #C5138 | referred as Collagenase IV S |
Collagenase type IV Worthington | Worthington-Biochem | #LS004189 | referred as Collagenase IV W |
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | #DN25 | |
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/F12 | Gibco | #11330-032 | |
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium – high glucose | Sigma-Aldrich | #D6429 | |
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | #D8537 | |
Epidermal Growth Factor | R&D Systems | #236-EG | |
Falcon Cell Strainers 70 µm | FisherScientific | #352350 | |
Falcon Cell Strainers 40 µm | FisherScientific | #352340 | |
Fetal Bovine Serum | ThermoFisher Scientific | #12483-020 | |
Insulin-Transferrin-Selenium | Gibco | #41400-045 | |
Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | #P4333 | |
Porcine testicular tissue | Sunterra Farms Ltd (Alberta, Canada) | ||
Steriflip-GP Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit | Millipore | #SCGP00525 | |
Trypsin-EDTA | Sigma | #T4049 |