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Medicine

使用微孔培养法生成具有睾丸特定结构的猪睾丸组织

Published: October 3, 2019 doi: 10.3791/60387

Summary

在这里,我们提出了一个协议,用于使用市售的微孔培养系统,用睾丸特定组织架构的可重复生成猪睾丸器官。

Abstract

有机体是由多种细胞类型组成的三维结构,能够概括组织结构和体内器官的功能。有机物的形成开辟了基础研究和转化研究的不同途径。近年来,睾丸器官在男性生殖生物学领域引起了兴趣。睾丸类有机物允许研究细胞-细胞相互作用、组织发育和生殖细胞利基微环境,并促进高通量药物和毒性筛选。需要一种方法,以可靠和可重复地生成睾丸器官与睾丸特定的组织结构。微井培养系统包含密集的金字塔形微井阵列。从青春期前睾丸中提取的睾丸细胞被离心到这些微孔中,并培养成具有睾丸特异性组织架构和细胞关联的睾丸器官。通过这一过程可以产生数千个均质有机体。这里报道的协议将引起研究男性生殖的研究人员的广泛兴趣。

Introduction

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近年来,人们对三维(3D)有机体的兴趣重新抬头。不同的器官,如肠1,胃2,腺3,4,肝脏5,大脑6已经成功地衍生成3D器官系统。与单层培养系统7相比,这些有机物与体内器官具有建筑和功能上的相似性,在研究组织微环境方面更具生物学相关性。结果,睾丸类物开始引起兴趣,以及8,9,10,11,12。迄今报告的大多数方法都是复杂的,非高通量10,并且需要添加ECM蛋白8,10。这种复杂性还会导致重现性问题。需要一种简单且可重复的方法,允许生成具有细胞关联(类似于体内睾丸)的睾丸器官。

我们最近报告有一个系统,以解决这些问题的要求12。以猪为模型,我们在微井系统中采用了离心强制聚集方法。在微井系统中,每口井都含有大量相同的小微井13。这允许生成大量均匀大小的球体。微井系统能够生成大量具有睾号特异性架构的均匀有机体。该系统简单,不需要添加ECM蛋白。

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Protocol

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注:从1周大的小猪身上获得睾号,作为商业猪的副产品。卡尔加里大学动物护理委员会批准了睾兽的采购。

1. 组织消化酶溶液的制备

注:需要三种不同的酶溶液,包括两种不同的胶原酶IV溶液(溶液A,B)和脱氧核糖核酸酶I(DNase I)溶液。

  1. 要制备溶液A,在25mL的高葡萄糖Dulbeco的改性鹰中分部(DMEM)中溶解20毫克胶原酶IV S(材料表)和40毫克胶原酶IV W(材料表)。然后用0.22 μm过滤器进行过滤灭菌。将0.4 mL的胎儿牛血清(FBS)加入溶液A,以抑制胰蛋白酶活性。
  2. 制备溶液B时,将80毫克胶原酶IV W(材料表)溶解在40 mL的DMEM中。然后用0.22 μm过滤器进行过滤灭菌。
  3. 要制备DNase I溶液(7毫克/mL),在10mL的DMEM中溶解70毫克DNase I。然后用0.22 μm过滤器进行过滤灭菌。
    注:此处概述的胶原酶IV溶液的酶浓度与原第14条所述的浓度(2mg/mL)不同。目前的协议产生具有略高生存能力的细胞。然而,两种协议分离的细胞产生具有相同组织结构的器官。

2. 睾度组织酶消化

  1. 将睾片收集到无菌烧杯中,用含有1%青霉素/链霉素(P/S)的磷酸盐缓冲盐水(PBS)清洗。洗涤后,将睾丸转移到含有1%P/S的PBS的100毫米组织培养皿中,并使用高压灭菌剪刀和钳子去除阴道和表皮。将分离的睾剂转移到新的 100 mm 盘中,用含有 1% P/S 的 PBS 彻底清洗。
  2. 为了保持无菌性,使用另一套无菌剪刀和钳子将睾丸皮瘤从图尼卡albuginea中剥离出来。沿着垂直轴直接切割睾号。然后用两个钳子将睾胎从图尼卡剥离出来,放入含有 1 mL DMEM 的 1 mL DMEM 的 100 mm 新盘中,并带有 1% P/S。
  3. 用无菌剪刀将去皮的睾丸切成1-2毫米的组织片。切碎后,使用无菌钳去除结缔组织的白色碎片。
  4. 将切碎的组织件转移到溶液A中,用DMEM将其顶入50 mL,以获得胶原酶IV S(材料表)的0.4mg/mL浓度和胶原酶IV W(材料表)的0.8mg/mL浓度。将含有组织碎片的溶液A放入37°C水浴中30分钟,每5分钟轻轻倒置管,并目视检查DNA的释放情况。
    1. 如果观察到自由浮动DNA,则加入500μL的DNase I。30分钟后,在25°C下用制动器将管在90 x g下离心1.5分钟,然后丢弃上清液。
      注:DNA会显示为一种浑浊的物质。当管子被摇动时,组织碎片稳定下来,而DNA会保持漂浮。
  5. 将溶液B添加到管中,用DMEM加到50 mL,以获得1.2mg/mL的胶原酶IV W(材料表)的浓度。将管放入37°C水浴30分钟,每5分钟轻轻倒置管。如果观察到自由浮动DNA,则加入500μL的DNase I。
  6. 30分钟后,在25°C下用制动器将管在90 x g下离心1.5分钟。之后丢弃上清液,用 1% P/S 的 PBS 洗涤一次。
    注:溶液A和B中丢弃的上生物将主要包含间质细胞。
  7. 用 PBS 将管充值至 50 mL。小心地从顶部收集小管,并放入新的 50 mL 管中。
    注:大未消化的组织碎片迅速沉降在底部,而消化的小管将留在悬浮状态。不应收集大组织碎片。此过程可以重复几次,直到原始管中的溶液几乎清晰,仅剩下未消化的组织片段,可以进行处置。
  8. 将小管在 90 x g下离心,在 25°C 下踩下制动器 1.5 分钟,然后丢弃上清液。再次添加新鲜的PBS和离心机。重复此洗涤步骤两次。
  9. 上次 PBS 洗涤后,去除上清液,在 PBS 的 5 mL 中重新悬浮小管。然后向小管中加入15 mL的0.25%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(EDTA)。将管子放入 37°C 水浴中,每 2 分钟轻轻倒置一次。如果观察到大量自由浮动的DNA,在5mL的DMEM中加入500μL的DNase I。
  10. 在显微镜下评估小管的酶消化到单个细胞(先在5分钟后,然后每2分钟一次)。如果可以检测到大多数单个细胞,则停止使用 5 mL FBS 的反应,并通过 70 μm 网格进行过滤,然后通过 40 μm 网格进行过滤。
    注意:应注意,用于消化的50 mL管(溶液A、B和0.25%胰蛋白酶-EDTA)的盖子应正确拧紧。如果水浴中的污染是一个问题,石蜡薄膜可以包裹在盖子上,以确保不育。
  11. 在500 x g下将单细胞在25°C下踩下5分钟,在浓缩培养基(Dulbeco改性鹰介质F/12(DMEM/F12)中重新悬浮,含有5%的FBS和1%的P/S),并计算活细胞的数量。这是起始细胞群。修复100 x 103细胞,并执行免疫细胞化学的生殖细胞标记UCHL1(泛素C-终端水酸酶L1)如描述12,并确定生殖细胞在此起始细胞群的百分比。
    注:生殖细胞标记原细胞白血病锌指蛋白(PLZF)15也可用作UCHL1的合适替代品。在起始细胞群中,预期细胞产量约为700-800 x 109/g组织。生殖细胞在此细胞群中的百分比应为4-5%。
  12. 将大约 20 x 106的起始细胞群放入两个超低附件 100 mm 培养皿(10 x 106个细胞,悬浮在 10 mL 的 DMEM/F12 中,每盘含有 1% P/S)在组织培养箱中等待 2 天(37 °C,5%CO 2,21% 氧气)。用剩余的细胞进行生殖细胞浓缩。
    注:为确保最佳活力和细胞质量,在生殖细胞富集和随后定量时,起始细胞群在超低附着组织培养皿中放置2天。

3. 生殖细胞富集

注:上述程序主要产生血清素细胞和生殖细胞。不同的粘附特性允许通过差分电镀分离Sertoli细胞和生殖细胞。

  1. 种子 20-25 x 106细胞起始细胞群每 100 毫米组织培养盘的总体积为 8 mL 的浓缩介质 (DMEM/F12 与 5% FBS 和 1% P/S) 差分电镀。将细胞放入培养箱(37°C,5%CO2,21%O2)和1.5小时后,确保大多数Sertoli细胞附着在板上。
  2. 收集并组合2个板的上清液(主要包含生殖细胞)到一个新的100毫米板,并将其放回培养箱。1 小时后,再次将 2 个板的上清液组合到新的 100 mm 板中。将盘子放回孵化器中过夜。
    注:组合的上生子将主要包含生殖细胞。与板块一起被丢弃的粘附细胞主要是睾丸体细胞,如Sertoli和前管状体细胞。
  3. 收集富集的生殖细胞成两部分如下。
    注:富集生殖细胞粘附不同,非附着分数和微附粘度部分。这两个分数一起形成富集的生殖细胞群
    1. 非附着分数:收集上清液。
    2. 微粘度分数:用PBS轻轻清洗板,在室温下用2mL的1:20稀释0.25%胰蛋白酶-EDTA5分钟,停止反应,用2mL的浓缩介质,并收集在同一管作为非粘附分数。
      注:0.25%胰蛋白酶-EDTA需要用PBS稀释,以产生1:20胰蛋白酶溶液。
  4. 使用细胞计数器计算细胞总数,修复 100 x 103细胞,并像描述12一样对生殖细胞标记 UCHL1 进行免疫细胞化学,并确定此富集细胞群中生殖细胞的百分比。
    注:该细胞群中生殖细胞的百分比应至少为60-70%。由于定量的免疫细胞化学需要1天,浓缩细胞应放置在超低附着100毫米培养皿中,DMEM/F12在持续时间内辅以1%的P/S,以确保最佳的细胞质量和活力。

4. 准备用于播种的细胞

  1. 要收获起始细胞制剂,从超低附件100 mm的培养皿中收集50 mL管中的上清液。用PBS大力清洗板,收集粘附细胞。无需酶消化。
    注:一些睾丸细胞,主要是Sertoli细胞,可以稍微粘附在超低附着板上。
  2. 结合起始细胞制备和富集生殖细胞,获得含有25%生殖细胞的工作细胞制剂。在500 x g下,在25°C下用制动器离心5分钟,丢弃上清液,在有机体形成培养基中重新悬浮细胞(DMEM/F12补充胰岛素10微克/mL,转移蛋白5.5微克/mL,硒6.7纳克/mL,20纳克/mL表皮生长因子,1% P/S)。将细胞密度调整到 2.4 x 106每 mL。
    注:本议定书中使用的孔板中每个孔包含1,200个微孔。
  3. 使用下面的公式计算每个单元格数,如下所述。
    每口井的细胞数 = 每个有机体要聚类的微井数 x 细胞数。
  4. 要从每个细胞中生成1000个细胞,每个细胞的种子(每个1,200 x 1,000个细胞+)1.2 x 106个细胞。调整细胞悬浮液中的细胞密度,使细胞在0.5 mL的培养量中播种。对于由1,000个细胞组成的有机体,使用每mL2.4 x106个细胞的密度(0.5 mL中的1.2 x 106个细胞)。

5. 制备微井以接收细胞

注:为确保细胞不粘附在微井表面,请使用制造商可购买的表面活性剂注解溶液处理。

  1. 在每个井中加入0.5 mL的浸解溶液。确保井中没有气泡。要去除气泡(如果有),请用 25°C 的制动器在 2,000 x g下离心板 2 分钟。
  2. 在低放大倍率倒置显微镜下观察板,以验证气泡是否从微孔中去除。如果观察到被困气泡,在 25°C 下用制动器在 2,000 x g下再次离心 2 分钟,以清除任何剩余的气泡。
  3. 用盖子盖住盘子,在室温下孵育30分钟。治疗完成后,取出冲洗溶液,并立即用无菌水或PBS清洗盘子。使用洗面溶液处理后,确保盘子不会干涸。

6. 睾丸器官的生成

  1. 在每个井中加入0.5 mL的有机体形成介质(不含任何细胞),并在2000 x g下以25°C的制动器离心2分钟,以清除任何被困的气泡。在低放大倍率倒置显微镜下观察油井,以确认气泡已消除。如果观察到被困气泡,在 25°C 下用制动器在 2,000 x g下再次离心 2 分钟,以清除任何剩余的气泡。
  2. 加入0.5 mL的工作细胞悬架,通过上下移液轻轻混合。在500 x g下,在25°C下用制动器离心5分钟。使用倒置显微镜验证细胞是否聚集在微井内。
  3. 将板转移到细胞培养箱和培养5天。每隔一天更换一半的介质。
    1. 要在不丢失任何有机物的情况下更换介质,请触摸井壁上的移液器尖端,轻轻降低以触摸半月板并缓慢绘制介质。一定要跟随半月板,因为它下降。要添加新鲜的介质,请触摸与中拉回水一侧的井壁上的移液器尖端,并在井壁上轻轻添加新鲜的介质,使其缓慢地流下墙壁。
  4. 要回收有机物,使用宽口移液器轻轻上下移液。这将允许有机物从微井中出来。
  5. 收集有机物,用PBS清洗,修复并执行生殖细胞标记(UCH-L1)、血清细胞标记物(GATA结合蛋白4-GATA4)、管状肌体细胞标记(β-平滑肌蛋白-SMA)和莱迪格细胞标记(细胞色素)的免疫细胞化学P450-CYP450)如描述12,并在共聚焦显微镜下可视化。

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Representative Results

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从微孔中自组织成球体的1周老猪睾的分离细胞(图1A,图2),具有划定和独特的外部(显性上皮)和内部隔间(插曲) (图 1B,图 2).两个隔间由胶原蛋白 IV+ve基底膜隔开。UCH-L1+ve生殖细胞和GATA4+saSertoli细胞位于地下室膜的外部隔间内(图1B,图2)。β-SMAμve膜状体细胞沿基底膜内部进行局部化,而细胞色素 P450_ve Leydig 细胞位于间质中心(图 1B,图 2)。这种结构(图2)与原位条件相似(图1C),其中莱迪格细胞、膜外体类细胞位于间质间间间;和生殖细胞,塞尔托利细胞位于前皮上皮。

Figure 1
图1:微井衍生的睾丸类化合物表现出具有倒置地形的睾丸特异性组织结构。A) 在0、3和5天的微孔培养中,猪睾丸细胞。(B) 睾丸器官的免疫荧光图像,识别特定细胞类型:血清素细胞(GATA4),基底膜(Collagen IV);生殖细胞(UCH-L1);管状细胞(β-SMA);莱迪格细胞(CYP450)。(C) 1周大猪睾神组织外观(H&E)和原理图表示。特定单元格类型用相应的箭头表示。刻度条 = 50 μm。这个数字已由Sakib等人12修改。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 2
图2:有机体形成的原理表示。分离的单睾丸细胞在微井中播种和培养5天,以产生睾丸器官。这个数字已由Sakib等人12修改。请点击此处查看此图的较大版本。

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Discussion

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我们已经建立了一个简单的方法,允许一致,可重复地生成大量的睾丸器官与组织结构,类似于睾丸在体内12。该方法是利用猪睾细胞开发的,但更广泛地适用于小鼠、非人类灵长类动物和人类睾人。已报告生产睾丸类有机物8、9、10、11的多种不同方法。Baert等人通过培养具有额外细胞基质(ECM)的睾丸细胞,通过成人睾丸的去细胞化11,从成人和青春期前样本中产生人类睾丸器官。虽然这个模型没有明显的睾丸形态,有机体可以分泌睾丸激素和细胞因子11。彭德格拉夫等人利用一种吊滴培养方法,利用溶解的睾丸ECM蛋白和有机物可以产生睾丸激素8。"阿尔维斯-洛佩斯等人使用独特的三层基底膜基质(例如,Matrigel)梯度系统,从大鼠10生成睾丸器官。这个系统中的细胞产生具有血睾屏障的管状结构。这些小管状结构中的生殖细胞对视黄酸刺激也有反应10。所有这些方法对于高通量测定来说都有些复杂和具有挑战性。相比之下,微井系统简单、可重复,可生成有机体睾丸类化合物,可用于高通量药物和毒性检测。

虽然在这里概述的方法,我们已经使用了细胞密度1,000细胞/微孔(1,000细胞/有机体),这种方法可用于产生器官,只要125个细胞/微孔12。在试验有限的样本时,这可能特别有用。

如果离心期间板不能正确平衡,细胞分布不均匀可能导致产生大小和形状可变的有机物。应注意正确平衡微孔板。一旦细胞被播种,在介质变化时应注意处理板。当把盘子从培养箱中拿出来或在介质变化时产生湍流时,晃动板太多会导致一些有机物从微孔中出来,并与其他13个有机体融合。

哺乳动物生殖细胞利基是复杂和多细胞的。睾孔中不同的细胞,如Sertoli细胞,膜外体细胞,莱迪格细胞都有助于生殖细胞的维持和命运16,17。我们的有机体系统可用于操作特定细胞类型的不同信号通路。感兴趣的基因可以在生殖细胞或其他睾丸体细胞(如管状体细胞、Sertoli 细胞)中向上或向下调节。然后,这些经过修饰的细胞可以与其他睾丸细胞结合,生成经过修饰的睾丸器官,然后可用于研究编辑对ECM沉积、形态形成、细胞信号和精子发生的影响。这种修改也可以执行,以产生特定的疾病表型为药物筛选。与其他方法生成球形有机体,如培养在吊滴或超低附件U底板8,使用微孔系统允许睾丸有机体模型更容易访问,并允许修改。例如,生殖细胞可以进行基因改造或利用实验因子进行处理,并通过简单的离心进行预先制作的野生型有机体,并观察其下游效应。

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Disclosures

作为发明家,Ungrin博士在AggreWell技术方面有着经济利益。

Acknowledgments

这项工作得到了NIH/NICHD HD091068-01对伊娜·多布林斯基博士的支持。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 mm ultra low attachment tissue culture dish Corning #CLS3262
100 mm tissue culture dish Corning #353803
Aggrwell 400 Stemcell Technologies #34411
Anti-Adherence Rinsing Solution Stemcell Technologies #07010
Collagenase type IV from Clostridium histolyticum Sigma-Aldrich #C5138 referred as Collagenase IV S
Collagenase type IV Worthington Worthington-Biochem #LS004189 referred as Collagenase IV W
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas Sigma-Aldrich #DN25
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/F12 Gibco #11330-032
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium - high glucose Sigma-Aldrich #D6429
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Sigma-Aldrich #D8537
Epidermal Growth Factor R&D Systems #236-EG
Falcon Cell Strainers 70 µm FisherScientific #352350
Falcon Cell Strainers 40 µm FisherScientific #352340
Fetal Bovine Serum ThermoFisher Scientific #12483-020
Insulin-Transferrin-Selenium Gibco #41400-045
Penicillin-Streptomycin Sigma-Aldrich #P4333
Porcine testicular tissue Sunterra Farms Ltd (Alberta, Canada)
Steriflip-GP Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit Millipore #SCGP00525
Trypsin-EDTA Sigma #T4049

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References

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Sakib, S., Yu, Y., Voigt, A., Ungrin, M., Dobrinski, I. Generation of Porcine Testicular Organoids with Testis Specific Architecture using Microwell Culture. J. Vis. Exp. (152), e60387, doi:10.3791/60387 (2019).More

Sakib, S., Yu, Y., Voigt, A., Ungrin, M., Dobrinski, I. Generation of Porcine Testicular Organoids with Testis Specific Architecture using Microwell Culture. J. Vis. Exp. (152), e60387, doi:10.3791/60387 (2019).

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