Generasjon av svin testikkel Organoids med testikkel spesifikk arkitekturen benytter Mikrotiterplateleser kulturen
Summary
Her presenterer vi en protokoll for reproduserbar generering av svin testikkel organoids med testikkel bestemt vevs arkitektur ved hjelp av det kommersielt tilgjengelige mikrotiterplateleser kultur systemet.
Abstract
Organoids er tredimensjonale strukturer sammensatt av flere celletyper som er i stand til recapitulating vev arkitektur og funksjoner av organer in vivo. Dannelse av organoids har åpnet opp ulike muligheter for grunnleggende og translational forskning. I de senere årene har testikkel organoids fått interesse innen mannlig reproduksjons biologi. Testicular organoids tillate for studiet av celle-celle interaksjoner, vev utvikling, og bakteriecellen nisje mikromiljøet og tilrettelegge for høy gjennomstrømming narkotika og toksisitet screening. En metode er nødvendig for å pålitelig og reproduserbar generere testicular organoids med testikkel bestemt vev arkitektur. Mikrotiterplateleser kultur system inneholder et tett utvalg av pyramide-formede microwells. Testicular celler avledet fra pre-pubertale testiklene er sentrifugert inn i disse microwells og kultivert å generere testicular organoids med testikkel-spesifikke vev arkitektur og celle foreninger. Tusenvis av homogene organoids kan genereres via denne prosessen. Protokollen som rapporteres her vil være av bred interesse for forskere som studerer mannlig reproduksjon.
Introduction
I de senere årene har det vært en renessanse av interesse i tredimensjonale (3D) organoids. Forskjellige organer som tarmen1, mage2, bukspyttkjertel3,4, Liver5, og Brain6 er vellykket avledet til 3D organoid systemer. Disse organoids har arkitektoniske og funksjonelle likheter med organene i vivo og er mer biologisk relevante for studier av vev mikromiljøet enn monolag kultur systemer7. Som et resultat, testicular organoids har begynt å samle renter så vel8,9,10,11,12. De fleste metodene som rapporteres så langt er komplekse, ikke-høy gjennomstrømming10 og krever tillegg av ECM proteiner8,10. Denne kompleksiteten fører også til problemer med reproduserbarhet. En enkel og reproduserbar metode er nødvendig som gjør det mulig for generering av testicular organoids med celle-assosiasjoner som er som testikkel in vivo.
Vi har nylig rapportert et system for å løse disse kravene12. Ved hjelp av grisen som modell, brukte vi en sentrifugal tvungen aggregering tilnærming i mikrotiterplateleser systemet. I mikrotiterplateleser-systemet inneholder hver brønn et stort antall identiske mindre microwells13. Dette gir mulighet for generering av mange spheroids av uniform størrelse. Den mikrotiterplateleser system aktiverte generasjonen av et stort antall ensartede organoids med en testikkel-spesifikk arkitektur. Systemet er enkelt og krever ikke tillegg av ECM-proteiner.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi har etablert en enkel metode som tillater konsekvent, repeterbar generering av et stort antall testikkel organoids med vevs arkitektur som ligner testikkel in vivo12. Mens tilnærmingen ble utviklet ved hjelp svin testikkel celler, er det mer generelt gjelder også for mus, ikke-menneskelige primater og menneskelig testikkel12. En rekke ulike metoder har blitt rapportert for å produsere testicular organoids8,9<s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av NIH/NICHD HD091068-01 til Dr. Ina Dobrinski.
Materials
| 100 mm ultra low attachment tissue culture dish | Corning | #CLS3262 | |
| 100 mm tissue culture dish | Corning | #353803 | |
| Aggrwell 400 | Stemcell Technologies | #34411 | |
| Anti-Adherence Rinsing Solution | Stemcell Technologies | #07010 | |
| Collagenase type IV from Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | #C5138 | referred as Collagenase IV S |
| Collagenase type IV Worthington | Worthington-Biochem | #LS004189 | referred as Collagenase IV W |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | #DN25 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/F12 | Gibco | #11330-032 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium – high glucose | Sigma-Aldrich | #D6429 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | #D8537 | |
| Epidermal Growth Factor | R&D Systems | #236-EG | |
| Falcon Cell Strainers 70 µm | FisherScientific | #352350 | |
| Falcon Cell Strainers 40 µm | FisherScientific | #352340 | |
| Fetal Bovine Serum | ThermoFisher Scientific | #12483-020 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium | Gibco | #41400-045 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | #P4333 | |
| Porcine testicular tissue | Sunterra Farms Ltd (Alberta, Canada) | ||
| Steriflip-GP Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit | Millipore | #SCGP00525 | |
| Trypsin-EDTA | Sigma | #T4049 |
References
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Barker, N., et al. Lgr5(+ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro. Cell Stem Cell. 6 (1), 25-36 (2010).
- Huch, M., et al. Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis. Embo Journal. 32 (20), 2708-2721 (2013).
- Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
- Takebe, T., et al. Vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant. Nature. 499 (7459), 481-484 (2013).
- Quadrato, G., et al. Cell diversity and network dynamics in photosensitive human brain organoids. Nature. 545 (7652), 48-53 (2017).
- Abbott, A. Cell culture: biology’s new dimension. Nature. 424 (6951), 870-872 (2003).
- Pendergraft, S. S., Sadri-Ardekani, H., Atala, A., Bishop, C. E. Three-dimensional testicular organoid: a novel tool for the study of human spermatogenesis and gonadotoxicity in vitrodagger. Biology of Reproduction. 96 (3), 720-732 (2017).
- Strange, D. P., et al. Human testicular organoid system as a novel tool to study Zika virus pathogenesis. Emerging Microbes & Infections. 7 (1), 82-82 (2018).
- Alves-Lopes, J. P., Soder, O., Stukenborg, J. B. Testicular organoid generation by a novel in vitro three-layer gradient system. Biomaterials. 130, 76-89 (2017).
- Baert, Y., et al. Primary Human Testicular Cells Self-Organize into Organoids with Testicular Properties. Stem Cell Reports. 8 (1), 30-38 (2017).
- Sakib, S., et al. Formation of organotypic testicular organoids in microwell culture. Biology of Reproduction. , (2019).
- Razian, G., Yu, Y., Ungrin, M. Production of Large Numbers of Size-controlled Tumor Spheroids Using Microwell Plates. Journal of Visualized Experiments. (81), 50665 (2013).
- Sakib, S., et al. Formation of organotypic testicular organoids in microwell culture. Biology of Reproduction. 100 (6), 1648-1660 (2019).
- González, R., Dobrinski, I. Beyond the Mouse Monopoly: Studying the Male Germ Line in Domestic Animal Models. ILAR Journal. 56 (1), 83-98 (2015).
- Oatley, J. M., Brinster, R. L. The germline stem cell niche unit in mammalian testes. Physiological Reviews. 92 (2), 577-595 (2012).
- Chen, L. Y., Willis, W. D., Eddy, E. M. Targeting the Gdnf Gene in peritubular myoid cells disrupts undifferentiated spermatogonial cell development. Proceedings of the National Academy of Science USA. 113 (7), 1829-1834 (2016).
