Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

Generasjon av svin testikkel Organoids med testikkel spesifikk arkitekturen benytter Mikrotiterplateleser kulturen

Published: October 3, 2019 doi: 10.3791/60387

Summary

Her presenterer vi en protokoll for reproduserbar generering av svin testikkel organoids med testikkel bestemt vevs arkitektur ved hjelp av det kommersielt tilgjengelige mikrotiterplateleser kultur systemet.

Abstract

Organoids er tredimensjonale strukturer sammensatt av flere celletyper som er i stand til recapitulating vev arkitektur og funksjoner av organer in vivo. Dannelse av organoids har åpnet opp ulike muligheter for grunnleggende og translational forskning. I de senere årene har testikkel organoids fått interesse innen mannlig reproduksjons biologi. Testicular organoids tillate for studiet av celle-celle interaksjoner, vev utvikling, og bakteriecellen nisje mikromiljøet og tilrettelegge for høy gjennomstrømming narkotika og toksisitet screening. En metode er nødvendig for å pålitelig og reproduserbar generere testicular organoids med testikkel bestemt vev arkitektur. Mikrotiterplateleser kultur system inneholder et tett utvalg av pyramide-formede microwells. Testicular celler avledet fra pre-pubertale testiklene er sentrifugert inn i disse microwells og kultivert å generere testicular organoids med testikkel-spesifikke vev arkitektur og celle foreninger. Tusenvis av homogene organoids kan genereres via denne prosessen. Protokollen som rapporteres her vil være av bred interesse for forskere som studerer mannlig reproduksjon.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

I de senere årene har det vært en renessanse av interesse i tredimensjonale (3D) organoids. Forskjellige organer som tarmen1, mage2, bukspyttkjertel3,4, Liver5, og Brain6 er vellykket avledet til 3D organoid systemer. Disse organoids har arkitektoniske og funksjonelle likheter med organene i vivo og er mer biologisk relevante for studier av vev mikromiljøet enn monolag kultur systemer7. Som et resultat, testicular organoids har begynt å samle renter så vel8,9,10,11,12. De fleste metodene som rapporteres så langt er komplekse, ikke-høy gjennomstrømming10 og krever tillegg av ECM proteiner8,10. Denne kompleksiteten fører også til problemer med reproduserbarhet. En enkel og reproduserbar metode er nødvendig som gjør det mulig for generering av testicular organoids med celle-assosiasjoner som er som testikkel in vivo.

Vi har nylig rapportert et system for å løse disse kravene12. Ved hjelp av grisen som modell, brukte vi en sentrifugal tvungen aggregering tilnærming i mikrotiterplateleser systemet. I mikrotiterplateleser-systemet inneholder hver brønn et stort antall identiske mindre microwells13. Dette gir mulighet for generering av mange spheroids av uniform størrelse. Den mikrotiterplateleser system aktiverte generasjonen av et stort antall ensartede organoids med en testikkel-spesifikk arkitektur. Systemet er enkelt og krever ikke tillegg av ECM-proteiner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Merk: testiklene fra 1-uke-gamle grisunger ble innhentet fra en kommersiell gris gård som biprodukt fra kastrering av kommersielle griser. Sourcing av testiklene ble godkjent av Animal Care Committee ved University of Calgary.

1. utarbeidelse av enzym løsninger for fordøyelsen av vev

Merk: tre ulike enzymatisk løsninger er nødvendig, som inkluderer to forskjellige kollagenase IV løsninger (løsning A, B) og en deoxyribonuclease I (DNase I) løsning.

  1. For å forberede løsning A, oppløse 20 mg kollagenase IV S (tabell av materialer) og 40 mg Kollagenase IV W (tabell over materialer) i 25 ml høy glukose Dulbecco ' s modifisert Eagle ' s medium (DMEM). Deretter filtrerer du sterilisere med et 0,22 μm-filter. Tilsett 0,4 mL av Foster storfe serum (FBS) til løsning A for å hemme Trypsin aktivitet.
  2. For å forberede løsning B, oppløse 80 mg kollagenase IV W (tabell av materialer) i 40 ml av DMEM. Deretter filtrerer du sterilisere med et 0,22 μm-filter.
  3. For å forberede DNase jeg løsning (7 mg/mL), oppløse 70 mg av DNase jeg i 10 mL DMEM. Deretter filtrerer du sterilisere med et 0,22 μm-filter.
    Merk: enzym konsentrasjonen for kollagenase IV-løsninger skissert her, varierer fra konsentrasjonene (2 mg/mL) som er angitt i den opprinnelige artikkel14. Den nåværende protokollen gir celler med litt høyere levedyktighet. Celler som er isolert av begge protokollene, produserer imidlertid organoids med identisk vevs arkitektur.

2. testikkel vev enzymatisk fordøyelse

  1. Samle testiklene i et sterilt beger og vask med fosfat bufret saltvann (PBS) som inneholder 1% penicillin/Streptomycin (P/S). Etter vask, overføre testiklene til en 100 mm vev kultur rett med PBS inneholder 1% P/S og fjerne tunika vaginalis og bitestikkel bruker autoklaveres saks og tang. Overfør de isolerte testiklene til en ny 100 mm rett og vask grundig med PBS som inneholder 1% P/S.
  2. For å opprettholde sterilitet, bruk et annet sett av sterile saks og tang for å skrelle testicular parenchyma ut av tunika albuginea. Skjær testiklene langs langsgående aksen direkte under tunika. Deretter skrelle testiklene ut av tunika ved hjelp av to pinsett og plasser i en ny 100 mm rett som inneholder 1 mL DMEM med 1% P/S.
  3. Hakke den skrelles testiklene med steril saks i 1-2 mm vev stykker. Etter hakking, bruk steril tang for å fjerne hvite fragmenter av bindevev.
  4. Overfør hakket vevs bitene til løsning A og topp det opp til 50 mL med DMEM for å oppnå en konsentrasjon på 0,4 mg/mL for kollagenase IV S (tabell over materialer) og en konsentrasjon på 0,8 mg/ml for Kollagenase IV W (tabell over materialer). Sted løsning A som inneholder vevet brikkene inn i en 37 ° c vannbad i 30 min, forsiktig invertere rørene hver 5 min og sjekk visuelt for utgivelsen av DNA.
    1. Tilsett 500 μL av DNase I om fritt flytende DNA er observert. Etter 30 min, sentrifuger røret ved 90 x g med bremser ved 25 ° c for 1,5 min og kast supernatanten.
      Merk: DNA vil fremstå som en uklar substans. Når rørene er ristet, det vevet stykker bosette seg mens DNA ville bli flytende.
  5. Legg til løsning B i røret og topp opp til 50 mL med DMEM for å oppnå en konsentrasjon på 1,2 mg/mL kollagenase IV W (tabell over materialer). Plasser røret inn i 37 ° c vannbad i 30 min og forsiktig invertere røret hver 5 min. Tilsett 500 μL av DNase I Hvis fritt flytende DNA er observert.
  6. Etter 30 min, sentrifuger røret ved 90 x g med bremser ved 25 ° c for 1,5 min. Etter det forkaste supernatanten og vask en gang med PBS med 1% P/S.
    Merk: de kasserte supernatanter fra både løsning A og B vil primært inneholde interstitiell celler.
  7. Topp opp røret med PBS opp til 50 mL. Samle tubuli fra toppen og plasser den i et nytt 50 mL rør.
    Merk: den store ufordøyd vev fragmenter raskt bosette seg på bunnen, mens fordøyd sæd tubuli vil forbli i suspensjon. Ingen store vev fragmenter skal samles. Denne prosedyren kan gjentas flere ganger til løsningen i det opprinnelige røret er nesten klar og bare ufordøyd vev fragmenter er igjen, som kan kastes.
  8. Sentrifuger tubuli ved 90 x g med bremser ved 25 ° c for 1,5 min og kast supernatanten. Legg frisk PBS og sentrifuger igjen. Gjenta dette vaske trinnet to ganger.
  9. Etter siste PBS vask, Fjern supernatanten og resuspend sæd tubuli i 5 mL PBS. Legg deretter til 15 mL 0,25% Trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) til tubuli. Plasser røret i 37 ° c vannbad og Vend forsiktig hver 2 min. Hvis det observeres mye fritt flytende DNA, tilsett 500 μL av DNase I med 5 mL DMEM.
  10. Evaluer enzymatisk fordøyelse av tubuli til enkeltceller under mikroskopet (først etter 5 min, deretter hver 2 min). Hvis det meste enkeltceller kan oppdages, stoppe reaksjonen med 5 mL FBS og filtrere gjennom en 70 μm mesh og deretter gjennom en 40 μm mesh.
    Merk: Pass på at dekslene på 50 mL rørene som brukes til digestions (løsning A, B og 0,25% Trypsin-EDTA) er strammet riktig. Hvis forurensning i vannbad er en bekymring, kan parafin film være viklet rundt hetten for å sikre sterilitet.
  11. Sentrifuger enkeltcellene ved 500 x g med bremser ved 25 ° c i 5 min, resuspend i berikelse medium (Dulbecco modifisert Eagle medium F/12 (DMEM/F12) som inneholder 5% FBS og 1% P/S) og telle antall levedyktige celler. Dette er start celle populasjonen. Fix 100 x 103 celler og utføre immuncytokjemi for bakterie celle markør UCHL1 (Ubiquitin C-terminal Hydrolase L1) som beskrevet12 og bestemme prosentandelen av bakterieceller i denne startcellen befolkningen.
    Merk: bakterie celle markør Promyelocytic leukemi sink finger protein (PLZF)15 kan også brukes som et egnet alternativ for UCHL1. I Start celle populasjonen er den forventede celle avkastningen rundt 700-800 x 109/g vev. Prosentandelen av bakterieceller i denne celle populasjonen bør være 4-5%.
  12. Plasser rundt 20 x 106 av denne startcellen befolkning i to ultra lav vedlegg 100 mm Petri retter (10 x 106 celler SUSPENDERT i 10 ml DMEM/F12 inneholder 1% P/S i hver tallerken) for 2 dager i en vev kultur inkubator (37 ° c , 5% CO2, 21% oksygen). Utfør bakteriecellen berikelse med de resterende cellene.
    Merk: for å sikre optimal levedyktighet og celle kvalitet, mens bakteriecellen berikelse og påfølgende kvantifisering finner sted, er startcellen befolkningen plassert i kultur i ultra lav vedlegg vev kultur retter for 2 dager.

tredje bakterie celle berikelse

Merk: prosedyren beskrevet ovenfor gir primært Sertoli celler og bakterieceller. Ulike vedheft egenskaper tillater separasjon av Sertoli celler og bakterieceller via differensial plating.

  1. Seed 20-25 x 106 celler av startcellen befolkning per 100 mm vev kultur parabolen i et samlet volum på 8 ml av berikelse medium (DMEM/F12 med 5% FBS og 1% P/S) for differensial plating. Plasser cellene i en inkubator (37 ° c, 5% CO2, 21% O2) og etter 1,5 h, sørg for at flertallet av Sertoli celler festes til platen.
  2. Samle og kombinere supernatanten (hovedsakelig inneholder bakterieceller) av 2 plater til en ny 100 mm plate og legg den tilbake i inkubator. Etter 1 h, igjen kombinere supernatanten av 2 plater til en ny 100 mm plate. Plasser platene tilbake i inkubator for natten.
    Merk: supernatanter kombinert vil primært inneholde bakterieceller. De overholdt celler som kastes sammen med platene er primært testicular somatiske celler som Sertoli og peritubular myoid celler.
  3. Samle de beriket Bakteriecellene i to fraksjoner som følger.
    Merk: beriket bakterieceller følge annerledes, ikke tilhenger brøkdel og litt overholdt brøk. Begge disse fraksjoner sammen danner beriket bakterie celle befolkningen
    1. Non tilhenger brøkdel: samle supernatanten.
    2. Litt tilhenger brøkdel: vask platene forsiktig med PBS, behandle med 2 mL 1:20 fortynning av 0,25% Trypsin-EDTA i 5 min ved romtemperatur, stoppe reaksjonen med 2 mL berikelse medium og samle i samme rør som ikke tilhenger brøkdel.
      Merk: 0,25% Trypsin-EDTA må fortynnes med PBS å produsere en 1:20 Trypsin løsning.
  4. Telle totalt antall celler ved hjelp av en celle teller, fikse 100 x 103 -celler og utføre immuncytokjemi for bakterie celle markør UCHL1 som beskrevet12 og bestemme prosentandelen av bakterieceller i denne beriket celle populasjonen.
    Merk: prosentandelen av bakterieceller i denne celle populasjonen bør være minst 60-70%. Siden immuncytokjemi for kvantifisering ville kreve 1 dag, beriket cellene bør plasseres i en ultra lav vedlegg 100 mm Petri parabolen med DMEM/F12 supplert med 1% P/S for varigheten for å sikre optimal celle kvalitet og levedyktighet.

4. utarbeidelse av celler for seeding

  1. For å høste Start celle forberedelsen, samle supernatanten i et 50 mL rør fra den ultra lave feste 100 mm retter. Vask platene kraftig med PBS å samle de overholdt cellene. Ingen enzymatisk fordøyelsen er nødvendig.
    Merk: noen av testicular cellene, primært Sertoli celler, kan litt holde seg til de ultra lave feste platene.
  2. Kombiner Start celle forberedelsen og beriket bakterieceller for å få en fungerende celle forberedelse som inneholder 25% bakterieceller. Sentrifuger ved 500 x g med bremser ved 25 ° c i 5 min, kast supernatanten og resuspend cellene i organoid dannelse medium (DMEM/F12 supplert med insulin 10 μg/ml, transferrin 5,5 μg/ml, selen 6,7 ng/ml, 20 ng/ml epidermal vekstfaktor , 1% P/S). Juster celle tettheten til 2,4 x 106 per ml.
    Merk: hver brønn i mikrotiterplateleser platene som brukes13 i denne protokollen inneholdt 1 200 microwells.
  3. Bruk formelen nedenfor til å beregne antall celler per brønn som beskrevet nedenfor.
    Antall celler per brønn = antall microwells x antall celler som skal grupperes for hver organoid.
  4. For å generere organoids fra 1, 000 celler hver, frø hver med (1 200 x 1 000 celler hver =) 1,2 x 106 celler. Juster celle tettheten i celle fjæringen på en måte som cellene er sådd i et volum på 0,5 mL medium. For organoids dannet fra 1 000 celler hver, bruk en tetthet på 2,4 x 106 celler per mL (1,2 x 106 celler i 0,5 ml).

5. utarbeidelse av microwells for å motta celler

Merk: for å sikre at cellene ikke overholder den mikrotiterplateleser overflaten, kan du behandle med en skylle løsning som er tilgjengelig for kjøp av produsenten.

  1. Tilsett 0,5 mL skyllemiddel til hver brønn. Sørg for at ingen luftbobler er fanget i brønnen. For å fjerne luftbobler, hvis noen, sentrifuger platen ved 2 000 x g med bremser ved 25 ° c i 2 min.
  2. Observere platen under en lav forstørrelse invertert mikroskop, for å kontrollere at boblene har blitt fjernet fra microwells. Hvis det blir observert fanget bobler, sentrifuge igjen ved 2 000 x g med bremser ved 25 ° c i 2 min for å fjerne eventuelle gjenværende bobler.
  3. Dekkplaten med lokket og ruge i 30 minutter ved romtemperatur. Etter at behandlingen er fullført, fjerner du skylle løsningen og vasker platen umiddelbart med sterilt vann eller PBS. Pass på at platen ikke tørker ut etter behandling med skylle løsningen.

6. generering av testikkel organoids

  1. Tilsett 0,5 mL organoid dannelse medium (uten noen celler) til hver brønn og sentrifuger ved 2 000 x g med bremser ved 25 ° c i 2 min for å fjerne eventuelle innestengte luftbobler. Observer brønnen under en lav forstørrelse invertert mikroskop for å kontrollere at luftbobler har blitt fjernet. Hvis det blir observert fanget bobler, sentrifuge igjen ved 2 000 x g med bremser ved 25 ° c i 2 min for å fjerne eventuelle gjenværende bobler.
  2. Tilsett 0,5 mL av arbeidscelle fjæringen og bland forsiktig ved å pipettering opp og ned. Sentrifuger på 500 x g med bremser ved 25 ° c i 5 min. Bruk et omvendt mikroskop for å kontrollere at cellene har gruppert i microwells.
  3. Overfør platen til en cellekultur inkubator og kultur i 5 dager. Endre halvparten av mediet annenhver dag.
    1. For å endre medium uten å miste noen organoids, Berør pipette spissen til veggen av brønnen og senk forsiktig for å berøre menisk og langsomt trekke mediet. Pass på å følge menisk når den faller ned. For å legge til friskt medium, Berør pipette spissen til veggen av brønnen på samme side som medium uttak og legge friskt medium forsiktig mot brønnen veggen, slik at det å sakte strømme ned veggen.
  4. For å gjenopprette organoids, kan du forsiktig pipette mediet opp og ned ved hjelp av et bredt munn pipette. Dette ville tillate organoids å komme ut av microwells.
  5. Samle organoids, vask med PBS, fikse og utføre immuncytokjemi for bakterie celle markør (UCH-L1), Sertoli celle markør (GATA bindende protein 4-GATA4), peritubular myoid celle markør (α-glatt Muscle utgangen-αSMA) og Leydig celle markør (Cytokrom P450-CYP450) som beskrevet12 og visualisere under et konfokalmikroskopi mikroskop.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Isolerte celler fra 1-ukers gamle svin testiklene som ble kultivert i microwells selv-organisert i spheroids (figur 1A, figur 2), med avgrenset og distinkt utvendig (sæd epitel) og innvendige rom ( interstitium) (figur 1B, figur 2). De to seksjonene ble separert av en kollagen IV+ har kjeller membran. UCH-L1+ ve bakterieceller og GATA4+ ve Sertoli celler var i det utvendige rommet på kjeller membranen (figur 1B, figur 2). α-SMA+ ve peritubular myoid celler ble lokalisert langs innsiden av kjelleren membranen mens cytokrom P450+ ve Leydig celler var i sentrum av interstitium (figur 1B, figur 2). Denne strukturen (figur 2) er lik in situ forhold (figur 1C), der Leydig celler, peritubular myoid celler er plassert i interstitium i interstitiell kupé; og bakterieceller, Sertoli celler er plassert på sæd epitel.

Figure 1
Figur 1: mikrotiterplateleser-avledet testikkel organoids utviser testikkel-spesifikk vevs arkitektur med en omvendt topografi. (A) svin testikkel celler ved 0, 3 og 5 dager med mikrotiterplateleser kultur. (B) Immunofluorescence bilder av testicular organoids identifisere spesifikke celletyper: Sertoli celler (GATA4), kjeller membran (kollagen IV); bakterieceller (UCH-L1); peritubular myoid celler (α-SMA); Leydig celler (CYP450). (C) histologiske utseende (H & E) og skjematisk representasjon av 1-ukers-gamle gris testikkel. Bestemte celletyper angis med tilsvarende piler. Skala stolper = 50 μm. Dette tallet har blitt modifisert fra Sakib et al.12. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: skjematisk fremstilling av organoid formasjon. Isolerte enkelt testikkel celler er sådd og kultivert i microwells i 5 dager for å produsere testikkel organoids. Dette tallet har blitt modifisert fra Sakib et al.12. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Vi har etablert en enkel metode som tillater konsekvent, repeterbar generering av et stort antall testikkel organoids med vevs arkitektur som ligner testikkel in vivo12. Mens tilnærmingen ble utviklet ved hjelp svin testikkel celler, er det mer generelt gjelder også for mus, ikke-menneskelige primater og menneskelig testikkel12. En rekke ulike metoder har blitt rapportert for å produsere testicular organoids8,9,10,11. Baert et al. genererte menneskelige testicular organoids fra voksen og pre-pubertale prøver av dyrking testicular celler med ekstracellulær matrise (ECM) innhentet av decellularization av voksne menneskelige testiklene11. Selv om denne modellen ikke har distinkte testicular morfologi, organoids kunne skille ut testosteron og cytokiner11. En annen menneskelig organoid modell ble rapportert av Pendergraft et al. ved hjelp av en hengende dråpe kultur metode som benyttes solubilized testicular ECM proteiner og organoids kunne produsere testosteron8. Alves-Lopes et al. brukt en unik tre-lags kjeller membran matrise (f. eks Matrigel) gradient system for å generere testicular organoids fra rotter10. Cellene i dette systemet genererte rørformede strukturer som hadde en blod testiklene barriere. Bakteriecellene i disse tubule strukturene var også responsive til retinoic yre stimulering10. Alle disse metodene er noe komplekst og utfordrende å bruke for høy gjennomstrømming analyser. I kontrast er mikrotiterplateleser systemet enkelt, reproduserbar, kan generere organotypic testicular organoids og kan brukes til høy gjennomstrømming narkotika og toksisitet analyser.

Selv i metoden skissert her har vi brukt en celle tetthet 1 000 celler/mikrotiterplateleser (1 000 celler/organoid), kan denne metoden brukes til å generere organoids med så lite som 125 celler/mikrotiterplateleser12. Dette kan være spesielt bruk ved eksperimentering med begrensede prøver.

Hvis platen ikke er riktig balansert under sentrifugering, kan ujevn fordeling av cellene forårsake generering av organoids med variabel størrelse og form. Forsiktighet bør utvises for å balansere mikrotiterplateleser plate riktig. Når cellene har blitt sådd, bør oppmerksomheten rettes til håndtering av platen under Media endringer. Risting platen for mye når du tar den ut av inkubator eller skape turbulens under Media endringer kan føre til at noen av organoids å komme ut av microwells og sikring med andre13.

Den pattedyr bakteriecellen nisje er kompleks og flercellede. De forskjellige cellene i testikkel som Sertoli celler, peritubular myoid celler, Leydig celler bidrar alle til bakterie celle vedlikehold og skjebne16,17. Vår organoid systemet kan brukes til å manipulere ulike signalering veier i bestemte celletyper. Et gen av interesse kan være opp eller downregulated i bakterieceller eller andre testicular somatiske celler som peritubular myoid celler, Sertoli celler. Disse modifiserte celler kan deretter kombineres med andre testikkel celler for å generere modifiserte testicular organoids, som deretter kan brukes til å studere virkningene av redigering på ECM deponering, morphogenesis, celle-celle signalering, og spermatogenesis. Slike modifikasjoner kan også utføres for å generere spesifikke sykdoms fenotyper for legemiddel screenings. Sammenlignet med andre metoder for generering av spheroidal organoids som kultur i hengende dråper eller ultra lav vedlegg U-Bottom plater8, bruke mikrotiterplateleser systemet har tillatt for en testikkel organoid modell som er mer tilgjengelig og gir mulighet for Endringer. For eksempel kan bakterieceller være genetisk modifisert eller behandlet med eksperimentelle faktorer og plassert på en forhåndslagde vill type organoid av enkle sentrifugering og observert for nedstrøms effekter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Dr. Ungrin har en finansiell interesse i AggreWell teknologi som oppfinner.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av NIH/NICHD HD091068-01 til Dr. Ina Dobrinski.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 mm ultra low attachment tissue culture dish Corning #CLS3262
100 mm tissue culture dish Corning #353803
Aggrwell 400 Stemcell Technologies #34411
Anti-Adherence Rinsing Solution Stemcell Technologies #07010
Collagenase type IV from Clostridium histolyticum Sigma-Aldrich #C5138 referred as Collagenase IV S
Collagenase type IV Worthington Worthington-Biochem #LS004189 referred as Collagenase IV W
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas Sigma-Aldrich #DN25
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/F12 Gibco #11330-032
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium - high glucose Sigma-Aldrich #D6429
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Sigma-Aldrich #D8537
Epidermal Growth Factor R&D Systems #236-EG
Falcon Cell Strainers 70 µm FisherScientific #352350
Falcon Cell Strainers 40 µm FisherScientific #352340
Fetal Bovine Serum ThermoFisher Scientific #12483-020
Insulin-Transferrin-Selenium Gibco #41400-045
Penicillin-Streptomycin Sigma-Aldrich #P4333
Porcine testicular tissue Sunterra Farms Ltd (Alberta, Canada)
Steriflip-GP Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit Millipore #SCGP00525
Trypsin-EDTA Sigma #T4049

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459, (7244), 262-265 (2009).
  2. Barker, N., et al. Lgr5(+ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro. Cell Stem Cell. 6, (1), 25-36 (2010).
  3. Huch, M., et al. Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis. Embo Journal. 32, (20), 2708-2721 (2013).
  4. Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160, (1-2), 324-338 (2015).
  5. Takebe, T., et al. Vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant. Nature. 499, (7459), 481-484 (2013).
  6. Quadrato, G., et al. Cell diversity and network dynamics in photosensitive human brain organoids. Nature. 545, (7652), 48-53 (2017).
  7. Abbott, A. Cell culture: biology's new dimension. Nature. 424, (6951), 870-872 (2003).
  8. Pendergraft, S. S., Sadri-Ardekani, H., Atala, A., Bishop, C. E. Three-dimensional testicular organoid: a novel tool for the study of human spermatogenesis and gonadotoxicity in vitrodagger. Biology of Reproduction. 96, (3), 720-732 (2017).
  9. Strange, D. P., et al. Human testicular organoid system as a novel tool to study Zika virus pathogenesis. Emerging Microbes & Infections. 7, (1), 82-82 (2018).
  10. Alves-Lopes, J. P., Soder, O., Stukenborg, J. B. Testicular organoid generation by a novel in vitro three-layer gradient system. Biomaterials. 130, 76-89 (2017).
  11. Baert, Y., et al. Primary Human Testicular Cells Self-Organize into Organoids with Testicular Properties. Stem Cell Reports. 8, (1), 30-38 (2017).
  12. Sakib, S., et al. Formation of organotypic testicular organoids in microwell culture. Biology of Reproduction. (2019).
  13. Razian, G., Yu, Y., Ungrin, M. Production of Large Numbers of Size-controlled Tumor Spheroids Using Microwell Plates. Journal of Visualized Experiments. (81), 50665 (2013).
  14. Sakib, S., et al. Formation of organotypic testicular organoids in microwell culture. Biology of Reproduction. 100, (6), 1648-1660 (2019).
  15. González, R., Dobrinski, I. Beyond the Mouse Monopoly: Studying the Male Germ Line in Domestic Animal Models. ILAR Journal. 56, (1), 83-98 (2015).
  16. Oatley, J. M., Brinster, R. L. The germline stem cell niche unit in mammalian testes. Physiological Reviews. 92, (2), 577-595 (2012).
  17. Chen, L. Y., Willis, W. D., Eddy, E. M. Targeting the Gdnf Gene in peritubular myoid cells disrupts undifferentiated spermatogonial cell development. Proceedings of the National Academy of Science USA. 113, (7), 1829-1834 (2016).
Generasjon av svin testikkel Organoids med testikkel spesifikk arkitekturen benytter Mikrotiterplateleser kulturen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sakib, S., Yu, Y., Voigt, A., Ungrin, M., Dobrinski, I. Generation of Porcine Testicular Organoids with Testis Specific Architecture using Microwell Culture. J. Vis. Exp. (152), e60387, doi:10.3791/60387 (2019).More

Sakib, S., Yu, Y., Voigt, A., Ungrin, M., Dobrinski, I. Generation of Porcine Testicular Organoids with Testis Specific Architecture using Microwell Culture. J. Vis. Exp. (152), e60387, doi:10.3791/60387 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter