هنا ، نقدم بروتوكولًا لتنفيذ عزل وتوسيع خلايا الدم الطرفية أحادية النواة المشتقة من السيتوكين CD3+CD56+ الخلايا القاتلة وتوضيح تأثيرها على السمية السيتومية ضد الخلايا السرطانية الدموية والصلبة باستخدام نظام التدفق الخلوي للتشخيص المختبري.
يركز العلاج المناعي الخلوي بالتبني على استعادة التعرف على السرطان عبر الجهاز المناعي ويحسن القتل الفعال للخلايا السرطانية. وقد أفيد القاتل الناجم عن السيتوكين (CIK) T العلاج بالخلايا لممارسة آثار كبيرة السامة للخلايا ضد الخلايا السرطانية والحد من الآثار السلبية للجراحة, الإشعاع, والعلاج الكيميائي في علاجات السرطان. يمكن اشتقاق CIK من الخلايا أحادية النواة في الدم المحيطية (PBMCs) ونخاع العظام ودم الحبل السري. خلايا CIK هي مجموعة فرعية غير متجانسة من الخلايا التائية مع CD3+CD56+ والخصائص الطبيعية للقاتل (NK) التي تشمل مجمع التوافق الأنسجة الرئيسي (MHC) – نشاط مضاد للورم غير المقيد. تصف هذه الدراسة طريقة مؤهلة وقابلة للتطبيق سريرياً وقائمة على التدفق الخلوي للقياس الكمي للقدرة الخلويلة لخلايا CIK المشتقة من PBMC ضد الخلايا السرطانية الدموية والصلبة. في الاستئصال الخلوي، تشارك خلايا CIK في احتضان بنسب مختلفة مع الخلايا السرطانية المستهدفة الملطخة مسبقا. بعد فترة الحضانة ، يتم تحديد عدد الخلايا المستهدفة بواسطة بقعة ملزمة للحمض النووي للكشف عن الخلايا الميتة. تنطبق هذه الطريقة على كل من تطبيقات البحث والتشخيص. تمتلك خلايا CIK سمية سيتومية قوية يمكن استكشافها كاستراتيجية بديلة لعلاج السرطان عند تقييمها قبل السريري من خلال إعداد وتتبع مقياس الخلايا (CS & T) نظام قياس الخلايا القائم على.
الخلايا اللمفاوية T السامة للخلايا هي مجموعة خلايا ذات تأثير مناعي محددة تتوسط الاستجابات المناعية ضد السرطان. تم تطوير العديد من مجموعات الخلايا الضارة بما في ذلك الخلايا القاتلة المنشطة من اللمفوكين (LAK) ، والخلايا الليمفاوية المتسللة للورم (TILs) ، والخلايا القاتلة الطبيعية (NK) ، والخلايا T ، والخلايا القاتلة الناجمة عن السيتوكين (CIK) لأغراض العلاج بالخلايا التائية بالتبني (ACT)1. هناك اهتمام متزايد في خلايا CIK ، لأنها تمثل مزيجًا من مجموعات الخلايا السامة للخلايا الناجمة عن السيتوكين التي توسعت من الخلايا أحادية نووية الدم المحيطية الذاتية (PMBCs)2.
يؤدي النمو غير المنضبط لخلايا السلف اللمفاوية والمايلوبلاست والأورام اللمفاوية إلى ثلاثة أنواع رئيسية من سرطان الدم (أي سرطان الدم وسرطان الغدد الليمفاوية والمايلوما) والأورام الصلبة ، بما في ذلك السرطانات (على سبيل المثال ، سرطان الرئة ، سرطان المعدة ، سرطان عنق الرحم) ، والساركومات ، من بين أنواع أخرى من السرطانات3. خلايا CIK هي مزيج من مجموعات الخلايا التي تحمل مجموعة واسعة من مجمع التوافق الهيستيك الرئيسي (MHC) – نشاط مضاد للورم غير المقيد وبالتالي تحمل الوعد لعلاج الأورام الدموية والمتقدمة4،5،6،7. خلايا CIK تتألف من مزيج من الخلايا، بما في ذلك الخلايا التائية (CD3+CD56−)، NK-T الخلايا (CD3+CD56+)، وخلايا NK (CD3–CD56+). التحسين من بروتوكول التعريفي CIK باستخدام جدول زمني ثابت بالإضافة إلى IFN-ο، الأجسام المضادة CD3، وIL-2، يؤدي إلى توسيع خلايا CIK8. القدرة السامة للخلايا CIK ضد الخلايا السرطانية يعتمد أساسا على مشاركة NK المجموعة 2 عضو D (عضو في الأسرة مستقبلات C-نوع ليكتين مثل) لغاند NKG2D على الخلايا السرطانية, وعلى مسارات perforin بوساطة9. وكشفت نتائج دراسة ما قبل السريرية أن IL-15-حفز خلايا CIK تسبب السمية الخلوية قوية ضد خطوط خلايا سرطان الدم النخاعي الأولية والحادة في المختبر وأظهرت انخفاض alloreactivity ضد PBMCs العاديوالخلايا الليفية9. في الآونة الأخيرة ، تم نشر نتيجة CIK المشتقة من المتبرع الصحي لمرة واحدة (1 × 108/ كجم CD3+ الخلايا) التسريب كدمج بعد زرع الخلايا الجينية غير النخاعية لعلاج الأورام النخاعية في دراسة سريرية المرحلة الثانية10.
في هذه الدراسة ، قمنا بتطوير صيغة زراعة الخلايا المحسنة المكونة من IFN-ο ، IL-1α ، الأجسام المضادة CD3 ، وIL-2 المضافة إلى وسط الخلية المكونة للدم لزيادة إنتاج CIK ، وحقق تأثير الخلايا السامة للخلايا ضد الإنسان المزمن سرطان الدم النخاعي (K562) الخلايا وسرطان المبيض (OC-3) الخلايا.
الطريقة الموصوفة هي بروتوكول سريع ومريح وموثوق به لعزل وتوسيع الخلايا القاتلة الناجمة عن السيتوكين (CIK) من عينات الدم الكاملة للمتبرعين الأصحاء. كما أنه يظهر تأثير السمية للخلايا من CIK ضد سرطان الدم (K562) وخلايا سرطان المبيض (OC-3) باستخدام تدفق الإعداد الخلوي وتتبع النظام (CS & T). يمكن حث خلايا CI…
The authors have nothing to disclose.
تم دعم هذه الدراسة من قبل مستشفى الجامعة الطبية الصينية (DMR-Cell-1809).
7-Amino Actinomycin D | BD | 559925 | ||
APC Mouse Anti-Human CD56 antibody | BD | 555518 | B159 | |
APC Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD | 555751 | MOPC-21 | |
BD FACSCanto II Flow Cytometer | BD | 338962 | SN: R33896202856 | |
Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) | BD | 565082 | Reconstritution of CFSE dye (500 mg) with 90 mL of DMSO | |
D-(+)-Glucose solution | SIGMA | G8644 | For K562 cell culture. Add 12.5 mL to 500 mL of complete medium | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium/F12 | HyClone | SH30023.02 | Basal medium for OC-3 cell culture | |
Fetal bovine serum | HyClone | SH30084.03 | For K562 and OC-3 cell culture. Complete medium contains 10% of FBS | |
Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare Life Sciences | 71101700-EK | Density gradient solution | |
FITC Mouse Anti-Human CD3 antibody | BD | 555332 | UCHT1 | |
FITC Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD | 555748 | MOPC-21 | |
Human anti-CD3 mAb | TaKaRa | T210 | OKT3 | Add 2.5 mL of stock (1 mg/1 mL) to 50 mL of Induction medium. Storage stock at -80 °C |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | Add 5 mL of stock (10,000 U/mL) to 500 mL of complete medium. Storage stock at 4 °C. | |
Proleukin | NOVARTIS | Reconstitution of Proleukin Powder (22×106 IU) with 1.2 mL of sterile water and add 2.7 mL to 50 mL of Induction medium. Storage stock at -20 °C | ||
Recombinant Human Interferon-gamma | CellGenix | 1425-050 | Reconstitution of rh IFN-g (5×105 IU/50 µg) with 200 µL of sterile water and add 20 mL to 50 mL of Induction medium. Storage stock at -20 °C | |
Recombinant Human Interleukin-1 alpha | PEPROTECH | 200-01A | Reconstitution rh IL-1α (10 µg) with 1 mL of sterile water and add 5 mL to 50 mL of Induction medium. Storage stock at -20 °C | |
RPMI1640 medium | Gibco | 11875-085 | Basal medium for K562 cell culture. Storage stock at 4 °C | |
Sigma 3-18K Centrifuge | Sigma | 10295 | ||
TrypLE Express Enzyme | Gibco | 12605028 | Cell dissociation enzyme; For deattachment of adheren cells. Storage at room temperature | |
X-VIVO 15 medium | Lonza | 04-418Q | Basal medium for PBMC and CIK cells. Storage at 4 °C |