Summary

Aislamiento y expansión de células T asesinas inducidas por citoquinas citotóxicas para el tratamiento del cáncer

Published: January 24, 2020
doi:

Summary

Aquí, presentamos un protocolo para realizar el aislamiento y expansión de células mononucleares de sangre periférica-inducidas por citoquinas CD3+CD56+ células asesinas e ilustrar su efecto de citotoxicidad contra las células cancerosas hematológicas y sólidas mediante el uso de un sistema de citometría de flujo de diagnóstico in vitro.

Abstract

La inmunoterapia celular adoptiva se centra en restaurar el reconocimiento del cáncer a través del sistema inmunitario y mejora la matanza efectiva de células tumorales. Se ha informado que la terapia con células T por el asesino de citoquinas (CIK) ejerce efectos citotóxicos significativos contra las células cancerosas y reduce los efectos adversos de la cirugía, la radiación y la quimioterapia en los tratamientos oncológicos. El CIK se puede derivar de células mononucleares de sangre periférica (PPBM), médula ósea y sangre del cordón umbilical. Las células CIK son una subpoblación heterogénea de células T con CD3+CD56+ y características fenotípicas de asesino natural (NK) que incluyen actividad antitumoral no restringida del complejo de histocompatibilidad principal (MHC). Este estudio describe un método calificado, clínicamente aplicable, basado en citometría de flujo para la cuantificación de la capacidad citolítica de las células CIK derivadas de PBMC contra células cancerosas hematológicas y sólidas. En el ensayo citolítico, las células CIK se entrenan en diferentes proporciones con células tumorales diana prestadas. Después del período de incubación, el número de células diana se determina mediante una mancha de unión a ácido nucleico para detectar células muertas. Este método es aplicable tanto a aplicaciones de investigación como de diagnóstico. Las células CIK poseen una potente citotoxicidad que podría ser explorada como una estrategia alternativa para el tratamiento del cáncer tras su evaluación preclínica mediante una configuración y seguimiento del citometro (cS y T) sistema de citometría de flujo basado.

Introduction

Los linfocitos T citotóxicos son una población específica de células efectogenitas inmunes que media respuestas inmunitarias contra el cáncer. Varias poblaciones de células efectoras, incluidas las células asesinas activadas por linfina (LAK), los linfocitos infiltrantes tumorales (TIL), las células asesinas naturales (NK), las células T y las células asesinas inducidas por citoquinas (CIK), se han desarrollado con fines de terapia adoptiva de células T (ACT)1. Existe un creciente interés en las células CIK, ya que representan una mezcla de poblaciones de células citotóxicas inducidas por citoquinas expandidas a partir de células mononucleares de sangre periférica autóloga (PMBC)2.

El crecimiento incontrolado de células progenitoras linfoides, mieloblastos y linfoblastos conduce a tres tipos principales de cánceres de sangre (es decir, leucemia, linfoma y mieloma), tumores sólidos, incluyendo carcinomas (por ejemplo, cáncer de pulmón, cáncer gástrico, cáncer de cuello uterino) y sarcomas, entre otros cánceres3. Las células CIK son una mezcla de poblaciones celulares que presentan una amplia gama de actividad antitumoral no restringida del complejo de histocompatibilidad (MHC) y, por lo tanto, son prometedoras para el tratamiento de tumores hematológicos y avanzados4,5,6,7. Las células CIK comprenden una combinación de células, incluyendo células T (CD3+CD56), celdas NK-T (CD3+CD56+), y celdas NK (CD3CD56+). La optimización del protocolo de inducción CIK mediante el uso de un cronograma fijo para la adición de anticuerpos IFN-o, anti-CD3 e IL-2, da como resultado la expansión de las células CIK8. La capacidad citotóxica de las células CIK contra las células cancerosas depende principalmente de la participación del grupo NK 2 miembro D (un miembro de la familia de receptores similares a la lectina de tipo C) ligandos NKG2D en las células tumorales, y en las vías mediadas por perforina9. Los resultados de un estudio preclínico revelaron que las células CIK estimuladas por IL-15 indujeron citotoxicidad potente contra las líneas celulares de leucemia mieloide primaria sin efecto sin vitro y mostraron una menor aleeactividad contra los PBMU normales y los fibroblastos9. Recientemente, se publicó el resultado de la perfusión de CIK de un donante sano (1 x 108/kg CD3+ células) como consolidación tras el trasplante alogénico no mieloablativo para el tratamiento de neoplasias mieloides en un estudio clínico de fase II10.

En el presente estudio, desarrollamos una fórmula de cultivo celular optimizada compuesta por IFN-, IL-1, anticuerpo anti-CD3 e IL-2 añadido al medio celular hematopoyético para aumentar la producción de CIK, e investigamos el efecto citotóxico de las células CIK contra la crónica humana leucemia mieloide (K562) y células de cáncer de ovario (OC-3).

Protocol

El protocolo clínico se realizó y aprobó de acuerdo con las directrices de la Junta de Revisión Institucional del Comité de ética de la Universidad Médica y de Investigación Hospitalaria de China. Los especímenes de sangre periférica fueron cosechados de voluntarios sanos con su consentimiento informado. 1. Preparación de materiales Almacene reactivos, anticuerpos y productos químicos como se muestra en la Ficha de datos de seguridad de materiales (MSDS). Disolver los fá…

Representative Results

El propósito del presente protocolo es aislar y expandir las células T asesinas inducidas por citoquinas (CIK) de los monocitos sanguíneos periféricos y evaluar el efecto citotóxico de la CIK contra la neoplasia maligna hematológica y las células cancerosas sólidas, respectivamente. La inducción de CIK fue identificada por el reconocimiento CD3/CD56. La Figura 1A muestra el protocolo para la inducción y expansión de CIK. Los resultados representativos de la estrat…

Discussion

El método descrito es un protocolo rápido, conveniente y confiable para el aislamiento y expansión de células T asesinas de citoquinas (CIK) inducidas por citoquinas (CIK) de muestras de sangre entera de donantes sanos. También muestra el efecto citotóxico de CIK contra la leucemia (K562) y las células cancerosas de ovario (OC-3) utilizando un sistema de configuración y seguimiento de citometría de flujo (CS & T). Las células CIK pueden ser inducidas y ampliadas en buenas prácticas de fabricación (GMP) median…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este estudio fue apoyado por el Hospital Universitario Médico de China (DMR-Cell-1809).

Materials

7-Amino Actinomycin D BD 559925
APC Mouse Anti-Human CD56 antibody BD 555518 B159
APC Mouse IgG1, κ Isotype Control BD 555751 MOPC-21
BD FACSCanto II Flow Cytometer BD 338962 SN: R33896202856
Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) BD 565082 Reconstritution of CFSE dye (500 mg) with 90 mL of DMSO
D-(+)-Glucose solution SIGMA G8644 For K562 cell culture. Add 12.5 mL to 500 mL of complete medium
Dulbecco's Modified Eagle Medium/F12 HyClone SH30023.02 Basal medium for OC-3 cell culture
Fetal bovine serum HyClone SH30084.03 For K562 and OC-3 cell culture. Complete medium contains 10% of FBS
Ficoll-Paque Plus GE Healthcare Life Sciences 71101700-EK Density gradient solution
FITC Mouse Anti-Human CD3 antibody BD 555332 UCHT1
FITC Mouse IgG1, κ Isotype Control BD 555748 MOPC-21
Human anti-CD3 mAb TaKaRa T210 OKT3 Add 2.5 mL of stock (1 mg/1 mL) to 50 mL of Induction medium. Storage stock at -80 °C
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140122 Add 5 mL of stock (10,000 U/mL) to 500 mL of complete medium. Storage stock at 4 °C.
Proleukin NOVARTIS Reconstitution of Proleukin Powder (22×106 IU) with 1.2 mL of sterile water and add 2.7 mL to 50 mL of Induction medium. Storage stock at -20 °C
Recombinant Human Interferon-gamma CellGenix 1425-050 Reconstitution of rh IFN-g (5×105 IU/50 µg) with 200 µL of sterile water and add 20 mL to 50 mL of Induction medium. Storage stock at -20 °C
Recombinant Human Interleukin-1 alpha PEPROTECH 200-01A Reconstitution rh IL-1α (10 µg) with 1 mL of sterile water and add 5 mL to 50 mL of Induction medium. Storage stock at -20 °C
RPMI1640 medium Gibco 11875-085 Basal medium for K562 cell culture. Storage stock at 4 °C
Sigma 3-18K Centrifuge Sigma 10295
TrypLE Express Enzyme Gibco 12605028 Cell dissociation enzyme; For deattachment of adheren cells. Storage at room temperature
X-VIVO 15 medium Lonza 04-418Q Basal medium for PBMC and CIK cells. Storage at 4 °C

References

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Cite This Article
Hsiao, C., Chiu, Y., Chiu, S., Cho, D., Lee, L., Wen, Y., Li, J., Shih, P. Isolation and Expansion of Cytotoxic Cytokine-induced Killer T Cells for Cancer Treatment. J. Vis. Exp. (155), e60420, doi:10.3791/60420 (2020).

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