Summary
在这里，我们提出一个协议，以执行外周血单核细胞衍生细胞诱导CD3 + CD56+杀伤细胞的分离和膨胀，并说明其细胞毒性对血液和固体癌细胞的影响，通过使用体外诊断流细胞测定系统。
Abstract
采用的细胞免疫疗法侧重于通过免疫系统恢复癌症识别，并改善有效的肿瘤细胞杀灭。据报道，细胞因子诱导杀手（CIK）T细胞疗法对癌细胞产生显著的细胞毒性作用，并减少手术、放疗和化疗在癌症治疗中的不利影响。CIK可以从外周血单核细胞（PBMC）、骨髓和脐带血中提取。CIK细胞是具有CD3+CD56+和天然杀伤性（NK）型型特征的T细胞的异构亚群，包括主要组织相容性复合物（MHC）-无限制抗肿瘤活性。本研究描述了一种合格的、临床上适用的流式细胞学方法，用于定量PBMC衍生CIK细胞的细胞解解能力，对抗血液学和固体癌细胞。在细胞解物测定中，CIK细胞与预染色靶肿瘤细胞以不同比例共同孵育。潜伏期后，目标细胞的数量由核酸结合染色确定，以检测死细胞。该方法适用于研究和诊断应用。CIK 细胞具有强效细胞毒性，通过基于 CS 和 T 的流式细胞测定系统进行临床前评估后，可探索为癌症治疗的替代策略。
Introduction
细胞毒性T淋巴细胞是一种特定的免疫效应细胞群，用于调节对癌症的免疫反应。包括淋巴素激活杀伤性（LAK）细胞、肿瘤渗透淋巴细胞（TLL）、自然杀伤细胞（NK）细胞、βT细胞和细胞因子诱导杀伤细胞（CIK）细胞在内的几种效应细胞群已开发用于采用T细胞治疗（ACT）目的1。人们对CIK细胞的兴趣日益浓厚，因为它们代表了细胞因子引起的细胞毒性细胞群的混合物，这些细胞群从自体外周血单核细胞（PMBC）2中扩展。
淋巴原细胞、骨髓细胞和淋巴细胞的无控制生长导致三种主要类型的血癌（即白血病、淋巴瘤和骨髓瘤）、实体肿瘤，包括癌瘤（如肺癌、胃癌、宫颈癌）和肉瘤等癌症3。CIK细胞是细胞群的混合物，表现出广泛的主要组织相容性复合物（MHC）-不受限制的抗肿瘤活性，从而有望治疗血液学和晚期肿瘤4，5，6，7。CIK细胞包括细胞的组合，包括T细胞（CD3+CD56+）、NK-T细胞（CD3+CD56+）和NK细胞（CD3+CD56+）。通过使用固定的时间表来添加IFN-α、抗CD3抗体和IL-2，优化CIK诱导协议，导致CIK细胞8的膨胀。CIK细胞对癌细胞的细胞毒性主要取决于NK组2成员D（C型叶酸样受体家族成员）对肿瘤细胞的NKG2D配体和穿孔素介导途径9的活性。临床前研究结果表明，IL-15刺激CIK细胞在体外诱导强效细胞毒性对原发性及急性骨髓性白血病细胞系，对正常PBMC和成纤维细胞9表现出较低的感化活性。最近，在II期临床研究中，一次性健康供体衍生CIK（1 x 108/kgCD3+细胞）输注作为骨髓异体肿瘤治疗非骨髓异体移植的合并结果发表于10。
在本研究中，我们开发了由IFN-α、IL-1+、抗CD3抗体和IL-2添加到造血细胞培养基中增加CIK产量的优化细胞培养公式，并研究了CIK细胞对人体慢性的细胞毒性作用骨髓性白血病（K562）细胞和卵巢癌（OC-3）细胞。
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Protocol
临床规程按照中国医科大学机构审查委员会和医院研究伦理委员会的指导方针进行和批准。外周血标本是在健康志愿者知情同意后采集的。
1. 材料准备
- 储存试剂、抗体和化学品，如材料安全数据表 （MSDS） 所示。将药物或细胞因子溶解在溶剂中作为库存溶液，然后等分储存在-20°C或-80°C。
注：材料准备的详细信息见材料表。
2. PBMC 隔离
- 使用前，将密度梯度溶液（材料表）加热至18~20°C。多次反转溶液瓶，以确保彻底混合。
- 在肝化小瓶中收集3~5 mL的人类静脉血样，通过轻轻倒置管几次，混合均匀。
- 在 15 mL 无菌管中制备 4 mL 的密度梯度溶液。
- 小心地将血样1 mL层到密度梯度溶液上。
- 在 400 x g下在 18~20 °C 下离心 30 分钟（关闭断裂）。
- 小心并立即吸出单核细胞（约1 mL）的布漆层（约1 mL），以避免使用1 mL无菌移液器将层干扰到无菌的15 mL管中。
- 在离心管中的松脂涂层中加入至少 3 卷（约 3 mL）的磷酸盐缓冲盐 （PBS）。用无菌移液器轻轻上下移液，将细胞悬浮在3倍处。
- 在400 x g下在18~20°C下离心10分钟。吸气上清液。
- 用5 mL的基底培养基（材料表）悬浮细胞颗粒，并转移到烧瓶中。在37°C和5%CO2的细胞培养箱中培养细胞。
3. CIK 感应和扩展
- 在第0天，在含有1000IU/mL的IFN-α的新鲜基底介质中培养PBMC（1 x 106），在37°C和5%CO2的加湿细胞培养箱中培养24小时。
- 在第1天，用含有50纳克/mL的抗CD3抗体、1纳克/mL的rh IL-1+和1，000 U/mL的rh IL-2的新鲜基础介质刷新该介质。每 3 天刷新一次媒体。
- 在第7天，用含有1，000 U/mL rh IL-2的新鲜基础介质刷新介质。每 3 天刷新一次介质，直到细胞扩张结束（第 14 天）。
4. 用于评估CIK细胞的免疫分泌
- 用10 mL无菌PBS清洗CIK细胞。在300 x g和18-20°C下离心10分钟，吸出上清液，用10 mL的PBS重新悬浮细胞。使用锥蓝色排除测定计算细胞数和测试细胞的生存能力。
- 以±5~10 x 105细胞/mL PBS的密度将CIK细胞与6个无菌1.5 mL管中分离。标签和治疗如下：管1，空白（无抗体）;管2，加入20μL等型IgG1-FITC;管 3，添加 20 μL 等型 IgG1-APC mAbs;管4，加入20μL的CD3-FITC;管 5，加入 20 μL CD56-APC mAbs;和管6，加入20μL的CD3-FITC和20μL的CD56-APC mAbs。
- 用1mL无菌移液器轻轻上下移液，将CIK细胞与抗体轻轻混合，然后在室温下在黑暗中孵育30分钟。
- 在 300 x g和 18-20 °C 下使管离心 10 分钟。吸出上清液，用1mL的PBS悬浮细胞颗粒一次。用 1 mL 无菌移液器轻轻上下移液至少 3 倍。
- 重复步骤 4.4。
- 在流动细胞分析之前，将管子留在黑暗中。
5. CD 标记识别
- 通过轻轻移液，将细胞悬浮液转移到无菌的 5 mL 聚苯乙烯圆形底管中，该管带有细胞滤帽（100 μm 网格）。将管子按顺序放在旋转木马上。
- 打开流式细胞测定分析软件并创建一个实验文件夹。单击"新建标本"按钮，将试样和试管添加到实验中，并将管命名为：管 1，空白;管 2，等型 IgG1-CD3;管 3，等型 IgG1-CD56;管 4，CD3;管 5，CD56;管 6，CD3CD56。
- 为 CIK 细胞群创建散射门控系统 （图 2A）。
- 选择管 1（空白）并单击"点图"按钮以创建 FSC-A/SSC-A 图。使用 FSC-A 阈值 >5 x 104在整个单元总体上绘制一个矩形门，以排除细胞碎片。
- 为新点图选择SSC-A/SSC-H参数，并在所有单个单元格周围绘制多边形门。分别为新直方图图选择计数/FITC （CD3）和计数/APC （CD56）参数。为新点图选择FITC （CD3）/APC （CD56）参数，并绘制一个四象限门来定义四个子种群。
- 记录每个标本中20，000个单个细胞的数据。单击"加载示例"按钮首先分析空白控件示例。使用 CD56 和 CD3 通道参数确定整个 CIK 细胞群。
- 重复步骤 5.3，以调查所有试样。
- 打开包含单个样本统计值的文件，分析 CIK 细胞群并将其重新打印到分析文件中。
6. 人类慢性骨髓性白血病K562细胞和卵巢癌OC-3细胞的培养和染色
- K562 单元格
- 培养K562细胞在完整的培养基（RPMI基底培养基含有10%胎儿牛血清[FBS]和50U/mL抗生素，并在0.5×1 x 106细胞/mL的密度下将葡萄糖调节到4.5g/L），并在37°C和5%CO2的加湿培养箱中孵育。
- 将含有K562细胞的培养基培养基转移到50 mL无菌管中，并在实验当天的18~20°C以300 x g粒粒细胞10分钟。
- 吸出上清液，将细胞重新悬浮在5 mL无菌PBS中，并轻轻混合。
- 在300 x g下将细胞颗粒10分钟。吸出上清液，重新悬浮PBS中的细胞，并将K562细胞调整到0.5-1 x 106细胞/mL的浓度。
- 在15 mL无菌管中，在15 mL无菌管中向1mL的K562细胞悬浮液中加入0.5 μL的CFSE染料，最终浓度为5 μM。通过上下移液至少3次轻轻混合悬架。
- 将管子留在细胞培养箱中，温度为37°C，CO2为5%，为期10-15分钟。
- 将9 mL的PBS加入管中，在300 x g下颗粒细胞10分钟。将上清液分光，然后将细胞颗粒悬浮在10 mL的完整介质中。将细胞悬浮液转移到细胞培养瓶中，并放置在培养箱中。
- OC-3 细胞
- 培养OC-3细胞在完整的介质（DMEM/F12培养基含有10%FBS和50U/mL抗生素）在密度为0.5×1 x 106细胞在细胞培养瓶在37°C和5%CO2的密度。
- 在实验前1天，用PBS吸出培养培养液，用PBS清洗细胞。
- 通过加入1 mL细胞解散酶溶液（材料表）分离细胞，并在37°C孵育5分钟。
- 加入 5 mL 的 PBS，悬浮细胞，轻轻混合。在300 x g下将细胞颗粒10分钟，然后吸出上清液。在PBS中重新悬浮细胞，并将细胞调整到0.5~1 x 106细胞/mL的浓度。
- 在15 mL无菌管中，在15 mL无菌管中将0.5 μL的CFSE染料加入1 mL的OC-3细胞悬浮液中，最终浓度为5 μM。通过上下移液至少3次轻轻混合悬架。
- 将管子留在细胞培养箱中，温度为37°C，CO2为5%，为期10-15分钟。
- 将9 mL的PBS加入管中，在300 x g下颗粒细胞10分钟。将上清液分光，然后用完整的介质悬浮细胞颗粒。种子5 x 105细胞/孔进入6孔板，并在37°C和5%CO2的加湿培养箱中孵育过夜。
7. 细胞毒性测定
- CIK 和 K562 细胞的共培养 （CIK-K562）
- 从步骤6.1.7中计算K562细胞，并通过锥蓝色排除测定测试细胞的生存能力。以5 x 105/mL的密度，在6孔板中向每口孔中加入1 mL的K562电池。
- 从步骤 3.4 到步骤 7.1.1 到 6 孔板添加 1 mL 的基底介质，无论是否具有 CIK 细胞，如下所示：井 1 = 空白，K562 细胞（5 x 105）;Well 2 = 仅使用 CFSE 染色的 K562 细胞（5 x 105）;well 3 = CIK 细胞 （E [效应器]， 25 x 105） = CFSE 染色 K562 细胞 （T [目标]， 5 x 105）;井 4 = CIK 细胞 （E， 50 x 105） = CFSE 染色 K562 细胞 （T， 5 x 105）。
- 通过轻轻上下移液至少3次，混合细胞悬浮液。将盘子放在培养箱中 24 小时。
- CIK 和 OC-3 单元的共培养 （CIK-OC-3）
- 从步骤 3.4 到步骤 6.2.7 到 6 孔板添加 1 mL 的基底介质，无论是否具有 CIK 细胞，如下所示：井 1 = 空白，仅 OC-3 细胞（5 x 105）;Well 2 = 仅 CFSE 染色 OC-3 细胞（5 x 105）;well 3 = CIK 细胞 （E， 25 x 105） = CFSE 染色 OC-3 细胞 （T， 5 x 105）;井 4 = CIK 细胞 （E， 50 x 105） + CFSE 染色 OC-3 细胞 （T， 5 x 105）。
- 通过轻轻上下移液至少3次，混合细胞悬浮液。将盘子放入培养箱24小时。
- 7-氨基霉素D（7-AAD）染料染色
- 从步骤 7.1.3 直接将 CIK-K562 细胞悬浮液收获到 15 mL 无菌管中。
- 从步骤7.2.2中收获CIK-OC-3组的悬浮细胞和粘附细胞。
- 将细胞悬浮液转移到15 mL无菌管中。用1 mL无菌PBS清洗井，收集PBS，并添加到管中。加入0.5 mL细胞解脱酶溶液，在37°C下孵育5分钟。
- 将1 mL的溶液从同一管加入相应的井中，用1 mL无菌移液器上下移液，轻轻混合细胞。收集同一管中的所有细胞。
- 在300 x g下离心10分钟，吸出上清液，并将细胞重新悬浮在1 mL无菌PBS中。在300 x g下将细胞颗粒10分钟，吸出上清液，并在100μL无菌PBS中重新悬浮细胞。
- 在细胞悬浮液中加入5μL的7-AAD染料（50纳克/μL库存）。用1 mL无菌移液器上下移液，轻轻混合细胞。孵育10分钟，在分析前在黑暗中离开。
- 细胞解解能力测定
- 将步骤 7.3.4 中的细胞悬架混合，并重复步骤 5.1 和 5.2 一次。
- 单击"新建标本"按钮，将试样和试管添加到实验中，并将管命名为：仅管 1、K562（或 OC-3）细胞;管 2，CFSE 染色 K562 （或 OC-3） 电池仅;管 3，E：T = 5：1;管 4，E：T = 10：1。
- 为细胞解计算创建散射门系统（图3A）。
- 选择管 1 并单击"点图"按钮以创建 FSC-A/SSC-A 图。使用 FSC-A 阈值 >5 x 104在所有事件上绘制一个矩形门，以排除单元格碎片。
- 为新点图选择SSC-A/CFSE参数。为新点图选择7-AAD/CFSE参数，并绘制四象限门以定义四个子种群。
- 单击"加载示例"按钮首先分析空白控制样本。
- 调整 SSC-A 和 FSC-A 的电压。使用 CFSE 和 7-AAD 通道参数识别死细胞群。记录每个标本中来自 >20，000 CFSE+细胞的数据。
- 重复第7.4.6节，以调查所有标本。
- 打开包含每个样本的统计值的文件，分析不可行的细胞群，并将数据导出到分析文件中。
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Representative Results
本方案的目的是从外周血单核细胞中分离和扩大细胞因子诱导杀伤性（CIK）T细胞，并分别评估CIK对血液恶性肿瘤和固体癌细胞的细胞毒性作用。CD3/CD56 识别确定了 CIK 的归纳。图 1A显示了 CIK 感应和扩展的协议。图1B显示了分析来自健康捐赠者的CD3+CD56+T细胞亚群的门控策略的代表性结果。图1C显示了三个人的CIK比例的统计分析。
图2A显示，CD3+CD56+细胞比例（原PBMC为0.65%，左下面板，27.4%，在第14天收获的CIK细胞，右下面板）在14天的扩展后显著增加。在我们的培养系统中，与原始数量的PBMC相比，CIK细胞产生约半百倍的变化（图2B）。
图3显示了CIK对人类慢性骨髓性白血病K562细胞和人类卵巢癌OC-3细胞的细胞毒性作用。K562或OC-3细胞（靶，T）被非荧光染料（CFSE）染色，这种染料在活细胞内被细胞内酯酶切成，然后成为高度荧光染料。在细胞毒性共培养研究中，CFSE染色的K562或OC-3细胞与CIK细胞共处理24小时。在孵育结束时，总细胞被收获并沾染7-AAD染料，这是一种核酸结合染料，用作死细胞排除的活化探针。CIK和CFSE+细胞的大小和粒度如图3A所示。CFSE染色的K562细胞（靶细胞，T）与CIK细胞（效应细胞，E）以E/T = 0：1、5：1和10：1的比例共同处理。对CFSE+K562细胞的7-AAD+细胞进行了评估。统计结果来自三个独立的实验。基底性莱沙是指在没有效应细胞的情况下细胞死亡的百分比（E：T = 0：1）。图3B显示了CIK对OC-3细胞（E：T = 10：1）在孵育24小时后的明显细胞毒性。
图1：细胞因子诱导杀伤细胞诱导和膨胀的流程图。（A） 同意的健康捐赠者的 PBMC 最初接触 rhIFN-+（第 0 天），随后是 rhIL-2、rhIL-1+ 和抗 CD3 mAb（第 1 天）每 3 天（第 4 天）。随后，该培养基每3天用含rhIL-2的培养基刷新一次，并在第14天收获细胞。（B） 在诱导7天期间CIK细胞的形态。CIK细胞的激活和扩展如协议所述进行。分别在第1天、5天和第7天在光学显微镜下观察细胞（放大率=40倍，刻度柱=200μm）。（C） 细胞计数每周进行一次。请点击此处查看此图的较大版本。
图2：CD3+ CD56+ T细胞的比例来自代表性的PBMC样本。（A） 淋巴细胞通过特定的大小和粒度得到识别.选择单细胞群，以便按流式细胞测定进行分析。（B） 使用 t 检验法（*，p < 0.01） 对三个健康捐赠者的 CIK 扩张功效进行了统计分析。请点击此处查看此图的较大版本。
图3：CIK细胞对人体慢性骨髓性白血病K562和人卵巢癌OC-3细胞的细胞毒性作用。（A） 与CIK细胞共培养24小时后，K562靶细胞根据CFSE染料的染色被识别和封闭。所选7-AAD/CFSE参数下总细胞群的象限图示和CIK细胞在指示的E：T比率下的累积细胞毒性。（B） CIK细胞对OC-3细胞的细胞毒性作用，在E：T = 10：1的比例。请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
所述方法是一种快速、方便、可靠的方案，用于从健康献血者全血样本中分离和扩增细胞毒性细胞因子（CIK）T细胞。它还显示了CIK对白血病（K562）和卵巢癌细胞（OC-3）的细胞毒性作用，使用流式细胞仪设置和跟踪（CS & T）系统。CIK细胞可以通过GMP级细胞因子和无血清培养基在良好的生产实践（GMP）条件下诱导和扩大，以进一步临床输注11。然而，CIK诱导和扩张的功效表现出个体差异12，13，14。此外，安全性是向患者源性 CIK 细胞注入用于癌细胞治疗的优势。据报道，CIK细胞对上皮固体癌细胞的细胞解解作用大多以NKG2D依赖性的方式发生。在血液学癌细胞中，用特异性抗体阻断NKG2D可显著抑制CIK诱导的细胞毒性对NKG2D-低K562细胞;然而，这种治疗对缺乏NKG2D15的HL-60细胞没有任何影响。此外，与CD8+CIK细胞16相比，CIK细胞对K562细胞的杀细胞活性较低。在这项研究中，我们发现与白血病K562细胞相比，CIK对卵巢癌OC-3细胞表现出更大的细胞毒性潜力。这些数据表明，CIK效应器杀死肿瘤细胞的确切分子机制尚不明确。
跟踪靶细胞的生存能力，利用流式细胞测定法评价效应细胞的细胞毒性潜能，已成为临床检查的标准和常规方法。有人建议，观察到对细胞活力和活化标记表达的负面影响，如CD3+在CFSE染色淋巴细胞与流细胞测定18，19的群。因此，染色靶癌细胞是评估原发CIK细胞细胞毒性效应的更有效策略。IFN-*、OKT3和IL-2是CIK分化和增殖的主要细胞因子或刺激剂。此外，其他因素，如胸腺蛋白，IL-1+，IL-10，IL-15，也是刺激因素。目前，人类血清，富含血小板的血浆，甚至胎儿牛血清被用作促进CIK细胞增殖的介质补充剂。虽然血清或血浆富含营养和生长因子，但异体动物产物的添加呈现来源、批次和批次变化，导致实验变异，并不可避免地使具有培养细胞治疗效果的研究感到不安。在这项研究中，我们使用市售的无血清、无白蛋白和异种GMP级培养基，辅以临床级细胞因子，成功培养CIK细胞。使用无异种或无异体素补充剂的缺点是，它们降低了细胞增殖的功效。
协议中提供的双色细胞跟踪方法独立计算了直接细胞毒性测定中的活或死效应细胞靶细胞。在我们的浇注策略中，CFSE+靶细胞可以明显与CIK效应细胞区分（图3）。最重要的是，CIK 的感应和扩展过程必须合格，并且表现出高可行性。对于进一步的多剂量输注，冷冻保存的条件，以及解冻后的生存能力和细胞毒性，是其他关键挑战。特定莱沙的实际比率等于 100 x （%样本莱沙 - %巴沙莱沙）/（100 -%巴沙莱沙）的比例。与其他研究18，20不同，建议对所有靶细胞进行调查，以揭示CIK细胞的确切和实际细胞毒性。
总之，本研究中描述的方案旨在增加来自健康捐赠者的PBMC衍生CIK细胞的数量，并利用双色光活化探针评估其细胞毒性对癌细胞的作用，以便选择性地跟踪通过带体外诊断 （IVD） 系统的流式细胞测定靶向细胞。
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Disclosures
作者声明没有相互竞争的经济利益冲突。
Acknowledgments
这项研究得到了中国医科大学附属医院（DMR-Cell-1809）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 7-Amino Actinomycin D | BD | 559925 | |
| APC Mouse Anti-Human CD56 antibody | BD | 555518 | B159 |
| APC Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD | 555751 | MOPC-21 |
| BD FACSCanto II Flow Cytometer | BD | 338962 | |
| Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) | BD | 565082 | |
| D-(+)-Glucose solution | SIGMA | G8644 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium/F12 | HyClone | SH30023.02 | |
| Fetal bovine serum | HyClone | SH30084.03 | |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare Life Sciences | 71101700-EK | |
| FITC Mouse Anti-Human CD3 antibody | BD | 555332 | UCHT1 |
| FITC Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD | 555748 | MOPC-21 |
| Human anti-CD3 mAb | TaKaRa | T210 | OKT3 |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Proleukin | NOVARTIS | ||
| Recombinant Human Interferon-gamma | CellGenix | 1425-050 | |
| Recombinant Human Interleukin-1 alpha | PEPROTECH | 200-01A | |
| RPMI1640 medium | Gibco | 11875-085 | |
| Sigma 3-18K Centrifuge | Sigma | 10295 | |
| TrypLE Express Enzyme | Gibco | 12605028 | |
| X-VIVO 15 medium | Lonza | 04-418Q |
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