Aqui, apresentamos um protocolo para realizar o isolamento e expansão de células mononucleares derivadas de citocinas derivadas de citocinas derivadas de citocinas induzidas por citocinas por cdinénsiainduzidas porcitocinas + CD56+ células assassinas e ilustrar seu efeito de citotoxicidade contra células cancerígenas hematológicas e sólidas usando um sistema de citometria de fluxo de diagnóstico in vitro.
A imunoterapia celular adotiva se concentra na restauração do reconhecimento do câncer através do sistema imunológico e melhora a efetiva matança de células tumorais. A terapia celular T do assassino induzido por citocinas (CIK) tem sido relatada para exercer efeitos citotóxicos significativos contra células cancerosas e reduzir os efeitos adversos da cirurgia, radiação e quimioterapia em tratamentos de câncer. A CIK pode ser derivada de células mononucleares sanguíneas periféricas (PBMCs), medula óssea e sangue do cordão umbilical. As células CIK são uma subpopulação heterogênea de células T com CD3+CD56+ e características fenotimétricas do assassino natural (NK) que incluem grande complexo de histocompatibilidade (MHC) atividade antitumorarestrita. Este estudo descreve um método qualificado, clinicamente aplicável, baseado em citometria de fluxo para a quantificação da capacidade citolítica das células CIK derivadas do PBMC contra células cancerígenas hematológicas e sólidas. No ensaio citolítico, as células CIK são co-incubadas em diferentes proporções com células tumorais alvo prestained. Após o período de incubação, o número de células-alvo são determinados por uma mancha de ligação com ácido nucleico para detectar células mortas. Este método é aplicável tanto a pesquisas quanto às aplicações diagnósticas. As células CIK possuem citotoxicidade potente que poderia ser explorada como uma estratégia alternativa para o tratamento do câncer após sua avaliação pré-clínica por um sistema de citometria e rastreamento baseado em cítometro (CS & T) sistema de citometria de fluxo baseado em CS & T.
Linfócitos T citotóxicos são uma população específica de células de efeito imunológico que media as respostas imunes contra o câncer. Várias populações de células effectoras, incluindo células assassinas ativadas por linfokina (LAK), linfócitos infiltrados em tumores (TILs), células assassinas naturais (NK), células γδ T e células assassinas induzidas por citocina (CIK) foram desenvolvidas para fins adotados de terapia celular T (ACT)1. Há um crescente interesse em células CIK, porque elas representam uma mistura de populações de células citotóxicas induzidas por citocinas expandidas a partir de células mononucleares sanguíneas autologos periféricas (PMBCs)2.
O crescimento descontrolado de células progenitoras linfoides, mieloblastos e linfoblastos leva a três tipos principais de câncer de sangue (ou seja, leucemia, linfoma e mieloma), tumores sólidos, incluindo cancerígenos (por exemplo, câncer de pulmão, câncer gástrico, câncer cervical) e sarcomas, entre outros cânceres3. As células CIK são uma mistura de populações celulares que exibem uma ampla gama de grandes atividades antitumorais (MHC)-irrestritas e, portanto, mantêm a promessa para o tratamento de tumores hematológicos e avançados4,5,6,7. As células CIK compreendem uma combinação de células, incluindo células T (CD3+CD56−), células NK-T (CD3+CD56+) e células NK (CD3–CD56+). A otimização do protocolo de indução CIK usando um cronograma fixo para aadição de anticorpo IFN-γ, anti-CD3 e IL-2, resulta na expansão das células CIK8. A capacidade citotóxica das células CIK contra células cancerígenas depende principalmente do engajamento do membro do grupo NK D (um membro da família receptora tipo C) ligands NKG2D em células tumorais, e em caminhos mediados por perforina9. Os resultados de um estudo pré-clínico revelaram que as células CIK estimuladas pelo IL-15 induziram citotoxicidade potente contra linhas de leucemia mielóide primária e aguda in vitro e apresentaram menor aloreatividade contra PBMCs normais e fibroblastos9. Recentemente, foipublicadoa infusão do resultado da infusão de CIK derivado de doadores saudáveis (1 x 108/kg de CD3+ células) como consolidação após transplante aloloablativo não mieloiático para tratamento de neoplasias mielóides em um estudo clínico de fase II .
No presente estudo, desenvolvemos uma fórmula de cultura celular otimizada composta por IFN-γ, IL-1α, anti-CD3 e IL-2 adicionadoao meio de células hematopoiéticas para aumentar a produção de CIK, e investigou o efeito citotóxico das células CIK contra a crônica humana células de leucemia mielóide (K562) e células cancerígenas de ovário (OC-3).
O método descrito é um protocolo rápido, conveniente e confiável para o isolamento e expansão de células T de cifras tóxicas induzidas por citocina (CIK) de amostras de sangue inteiro de doadores saudáveis. Também mostra o efeito citotóxico do CIK contra leucemia (K562) e células cancerígenas ovarianas (OC-3) usando um sistema de configuração e rastreamento de citometria de fluxo (CS & T). As células CIK podem ser induzidas e expandidas em boas condições de práticas manufactory (GMP) usando citocinas de…
The authors have nothing to disclose.
Este estudo foi apoiado pelo China Medical University Hospital (DMR-Cell-1809).
7-Amino Actinomycin D | BD | 559925 | ||
APC Mouse Anti-Human CD56 antibody | BD | 555518 | B159 | |
APC Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD | 555751 | MOPC-21 | |
BD FACSCanto II Flow Cytometer | BD | 338962 | SN: R33896202856 | |
Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) | BD | 565082 | Reconstritution of CFSE dye (500 mg) with 90 mL of DMSO | |
D-(+)-Glucose solution | SIGMA | G8644 | For K562 cell culture. Add 12.5 mL to 500 mL of complete medium | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium/F12 | HyClone | SH30023.02 | Basal medium for OC-3 cell culture | |
Fetal bovine serum | HyClone | SH30084.03 | For K562 and OC-3 cell culture. Complete medium contains 10% of FBS | |
Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare Life Sciences | 71101700-EK | Density gradient solution | |
FITC Mouse Anti-Human CD3 antibody | BD | 555332 | UCHT1 | |
FITC Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD | 555748 | MOPC-21 | |
Human anti-CD3 mAb | TaKaRa | T210 | OKT3 | Add 2.5 mL of stock (1 mg/1 mL) to 50 mL of Induction medium. Storage stock at -80 °C |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | Add 5 mL of stock (10,000 U/mL) to 500 mL of complete medium. Storage stock at 4 °C. | |
Proleukin | NOVARTIS | Reconstitution of Proleukin Powder (22×106 IU) with 1.2 mL of sterile water and add 2.7 mL to 50 mL of Induction medium. Storage stock at -20 °C | ||
Recombinant Human Interferon-gamma | CellGenix | 1425-050 | Reconstitution of rh IFN-g (5×105 IU/50 µg) with 200 µL of sterile water and add 20 mL to 50 mL of Induction medium. Storage stock at -20 °C | |
Recombinant Human Interleukin-1 alpha | PEPROTECH | 200-01A | Reconstitution rh IL-1α (10 µg) with 1 mL of sterile water and add 5 mL to 50 mL of Induction medium. Storage stock at -20 °C | |
RPMI1640 medium | Gibco | 11875-085 | Basal medium for K562 cell culture. Storage stock at 4 °C | |
Sigma 3-18K Centrifuge | Sigma | 10295 | ||
TrypLE Express Enzyme | Gibco | 12605028 | Cell dissociation enzyme; For deattachment of adheren cells. Storage at room temperature | |
X-VIVO 15 medium | Lonza | 04-418Q | Basal medium for PBMC and CIK cells. Storage at 4 °C |