Isolierung und Erweiterung zytotoxischer Cytokin-induzierter Killer-T-Zellen zur Krebsbehandlung

Summary

Hier stellen wir ein Protokoll zur Isolierung und Ausdehnung von peripheren mononukleären Blutzellen dar, die von Zytokin-induzierten CD3⁺CD56⁺ Killerzellen abgeleitet wurden, und ihre Zytotoxizitätswirkung gegen hämatologische und feste Krebszellen anhand eines in vitro-diagnosebasierten Durchflusszytometriesystems zu veranschaulichen.

Abstract

Die Adoptivzellimmuntherapie konzentriert sich auf die Wiederherstellung der Krebserkennung über das Immunsystem und verbessert die effektive Tötung von Tumorzellen. Zytokin-induzierte Killer (CIK) T-Zell-Therapie wurde berichtet, um erhebliche zytotoxische Wirkungen gegen Krebszellen ausüben und die Nebenwirkungen von Chirurgie, Bestrahlung, und Chemotherapie in Krebsbehandlungen zu reduzieren. CIK kann aus peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs), Knochenmark und Nabelschnurblut gewonnen werden. KIK-Zellen sind eine heterogene Subpopulation von T-Zellen mit CD3⁺CD56⁺ und natürlichen Killer (NK) phänotypic Eigenschaften, die großen Histokompatibilitätskomplex (MHC) -unbeschränkte Antitumoraktivität enthalten. Diese Studie beschreibt eine qualifizierte, klinisch anwendbare, strömungszytometriebasierte Methode zur Quantifizierung der zytolytischen Fähigkeit von PBMC-abgeleiteten CIK-Zellen gegen hämatologische und feste Krebszellen. Im zytolytischen Assay werden KIK-Zellen in unterschiedlichen Verhältnissen mit vorgefärbten Zieltumorzellen kokubiert. Nach der Inkubationszeit wird die Anzahl der Zielzellen durch einen Nukleinsäure-bindenden Fleck bestimmt, um abgestorbene Zellen zu erkennen. Diese Methode ist sowohl für Forschungs- als auch für Diagnoseanwendungen anwendbar. KIK-Zellen besitzen eine starke Zytotoxizität, die als alternative Strategie für die Krebsbehandlung nach ihrer präklinischen Bewertung durch ein Zytometer-Setup- und Tracking-basiertes Durchflusszytometriesystem (CS & T) untersucht werden könnte.

Introduction

Zytotoxische T-Lymphozyten sind eine spezifische Immuneffektor-Zellpopulation, die Immunreaktionen gegen Krebs vermittelt. Mehrere Effektorzellpopulationen, einschließlich Lymphokin-aktivierte Killerzellen (LAK), tumorinfiltrierende Lymphozyten (TILs), natürliche Killerzellen (NK), T-Zellen und Zytokin-induzierte Killerzellen (CIK) wurden für die Adoptiv-T-Zelltherapie (ACT) entwickelt¹. Das Interesse an KIK-Zellen wächst, da sie eine Mischung aus zytokininduzierten zytotoxischen Zellpopulationen darstellen, die aus autologen peripheren mononukleären Blutzellen (PMBCs)²erweitert werden.

Das unkontrollierte Wachstum von lymphoiden Vorläuferzellen, Myeloblasten und Lymphoblasten führt zu drei Haupttypen von Blutkrebs (z. B. Leukämie, Lymphom und Myelom), soliden Tumoren, einschließlich Karzinome (z. B. Lungenkrebs, Magenkrebs, Gebärmutterhalskrebs) und Sarkome, unter anderem^Krebs3. KIK-Zellen sind eine Mischung von Zellpopulationen, die eine breite Palette von großen Histokompatibilitätskomplex (MHC) -unbeschränkte Antitumor-Aktivität aufweisen und damit Versprechen für die Behandlung von hämatologischen und fortgeschrittenen Tumoren^4,5,6,7. KIK-Zellen bestehen aus einer Kombination von Zellen, einschließlich T-Zellen (CD3⁺CD56^),NK-T-Zellen (CD3⁺CD56⁺), und NK-Zellen (CD3^–CD56⁺). Die Optimierung des CIK-Induktionsprotokolls durch Verwendung eines festen Zeitplans für die Zugabe von IFN-, Anti-CD3-Antikörpern und IL-2 führt zur Erweiterung der CIK-Zellen⁸. Die zytotoxische Fähigkeit von CIK-Zellen gegen Krebszellen hängt hauptsächlich von der Beteiligung von NK-Gruppe 2-Mitglied D (ein Mitglied der C-Typ-Lektin-ähnlichen Rezeptorfamilie) NKG2D Liganden auf Tumorzellen und von Perforin-vermittelten Bahnen⁹ab. Die Ergebnisse einer präklinischen Studie zeigten, dass IL-15-stimulierte CIK-Zellen eine starke Zytotoxizität gegen primäre und akute myeloische Leukämie-Zelllinien in vitro induzierten und eine geringere Alloreaktivität gegen normale PBMCs und Fibroblasten⁹zeigten. Kürzlich wurde das Ergebnis einer einmaligen gesunden, von Spendern abgeleiteten CIK (1 x 10⁸/kg CD3⁺ Zellen) ineiner Infusion als Konsolidierung nach nichtmyeloablativer allogener Transplantation zur Behandlung myeloider Neoplasmen in einer klinischen Phase-II-Studie veröffentlicht¹⁰.

In der vorliegenden Studie entwickelten wir eine optimierte Zellkulturformel, die aus IFN-, IL-1,, Anti-CD3-Antikörpern und IL-2 besteht, die dem hämatopoetischen Zellmedium hinzugefügt wurden, um die KIK-Produktion zu erhöhen, und untersuchten die zytotoxische Wirkung von CIK-Zellen gegen menschliche chronische myeloische Leukämie (K562) und Eierstockkrebs (OC-3).

Protocol

Das klinische Protokoll wurde in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Institutional Review Board der China Medical University and Hospital Research Ethics Committee durchgeführt und genehmigt. Periphere Blutproben wurden von gesunden Probanden mit ihrer informierten Zustimmung geerntet. 1. Herstellung von Materialien Bewahren Sie Reagenzien, Antikörper und Chemikalien auf, wie im Sicherheitsdatenblatt (MSDS) dargestellt. Die Medikamente oder Zytokine in Lösungsmitteln als Stof…

Representative Results

Ziel dieses Protokolls ist es, Zytokin-induzierte Killerzellen (CIK) t-Zellen aus peripheren Blutmonozyten zu isolieren und zu erweitern und die zytotoxische Wirkung von CIK gegen hämatologische Malignität bzw. feste Krebszellen zu bewerten. Die Induktion von CIK wurde durch die CD3/CD56-Erkennung identifiziert. Abbildung 1A zeigt das Protokoll für DIE CIK-Induktion und -Erweiterung. Die repräsentativen Ergebnisse der Gating-Strategie zur Analyse der Teilpopulation von C…

Discussion

Die beschriebene Methode ist ein schnelles, bequemes und zuverlässiges Protokoll zur Isolierung und Ausdehnung von zytotoxischen Zytokin-induzierten Killer-T-Zellen aus Vollblutproben gesunder Spender. Es zeigt auch die zytotoxische Wirkung von CIK gegen Leukämie (K562) und Eierstockkrebszellen (OC-3) mit einem Flow-Zytometrie-Setup und Tracking-System (CS & T). KIK-Zellen können unter guten manufakturen Praktiken (GMP) induziert und erweitert werden, indem GMP-Grade-Zytokine und serumfreies Medium für weitere klinis…

Materials

7-Amino Actinomycin D	BD	559925
APC Mouse Anti-Human CD56 antibody	BD	555518	B159
APC Mouse IgG1, κ Isotype Control	BD	555751	MOPC-21
BD FACSCanto II Flow Cytometer	BD	338962		SN: R33896202856
Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE)	BD	565082		Reconstritution of CFSE dye (500 mg) with 90 mL of DMSO
D-(+)-Glucose solution	SIGMA	G8644		For K562 cell culture. Add 12.5 mL to 500 mL of complete medium
Dulbecco's Modified Eagle Medium/F12	HyClone	SH30023.02		Basal medium for OC-3 cell culture
Fetal bovine serum	HyClone	SH30084.03		For K562 and OC-3 cell culture. Complete medium contains 10% of FBS
Ficoll-Paque Plus	GE Healthcare Life Sciences	71101700-EK		Density gradient solution
FITC Mouse Anti-Human CD3 antibody	BD	555332	UCHT1
FITC Mouse IgG1, κ Isotype Control	BD	555748	MOPC-21
Human anti-CD3 mAb	TaKaRa	T210	OKT3	Add 2.5 mL of stock (1 mg/1 mL) to 50 mL of Induction medium. Storage stock at -80 °C
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122		Add 5 mL of stock (10,000 U/mL) to 500 mL of complete medium. Storage stock at 4 °C.
Proleukin	NOVARTIS			Reconstitution of Proleukin Powder (22×106 IU) with 1.2 mL of sterile water and add 2.7 mL to 50 mL of Induction medium. Storage stock at -20 °C
Recombinant Human Interferon-gamma	CellGenix	1425-050		Reconstitution of rh IFN-g (5×105 IU/50 µg) with 200 µL of sterile water and add 20 mL to 50 mL of Induction medium. Storage stock at -20 °C
Recombinant Human Interleukin-1 alpha	PEPROTECH	200-01A		Reconstitution rh IL-1α (10 µg) with 1 mL of sterile water and add 5 mL to 50 mL of Induction medium. Storage stock at -20 °C
RPMI1640 medium	Gibco	11875-085		Basal medium for K562 cell culture. Storage stock at 4 °C
Sigma 3-18K Centrifuge	Sigma	10295
TrypLE Express Enzyme	Gibco	12605028		Cell dissociation enzyme; For deattachment of adheren cells. Storage at room temperature
X-VIVO 15 medium	Lonza	04-418Q		Basal medium for PBMC and CIK cells. Storage at 4 °C