Summary

स्मॉल-स्केल सेल प्रोसेसिंग के लिए ऑटोमेटेड काउंटरफ्लो सेंट्रलाइजसिस्टम

Published: December 12, 2019
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Summary

स्वचालन सेल विनिर्माण में अपस्केलिंग और लागत प्रबंधन के लिए महत्वपूर्ण है। यह पांडुलिपि छोटे पैमाने पर बायोप्रोसेसिंग के लिए बफर एक्सचेंज और सेल एकाग्रता चरणों को स्वचालित करने के लिए एक काउंटरफ्लो अपकेंद्रित्र सेल प्रोसेसिंग डिवाइस के उपयोग का वर्णन करती है।

Abstract

जीन और सेल आधारित चिकित्सा के सफल व्यावसायीकरण के लिए विनिर्माण प्रक्रियाओं की आवश्यकता होती है जो लागत प्रभावी और स्केलेबल हैं। बफर एक्सचेंज और उत्पाद एकाग्रता अधिकांश विनिर्माण प्रक्रियाओं के लिए आवश्यक घटक हैं। हालांकि, उत्पाद विकास के शुरुआती चरणों में, इन चरणों को अक्सर मैन्युअल रूप से किया जाता है। बफर एक्सचेंज के लिए मैनुअल डेड-एंड सेंट्रलाइजेशन श्रम-गहन, महंगा और स्केलेबल नहीं है। एक बंद स्वचालित प्रणाली प्रभावी ढंग से इस श्रमसाध्य कदम को खत्म कर सकते हैं, लेकिन कार्यान्वयन चुनौतीपूर्ण हो सकता है । यहां, हम एक नए विकसित सेल प्रोसेसिंग डिवाइस का वर्णन करते हैं जो छोटे से मध्यम पैमाने पर सेल प्रसंस्करण के लिए उपयुक्त है और इसका उद्देश्य मैनुअल प्रसंस्करण और बड़े पैमाने पर स्वचालन के बीच की खाई को पाटना है। इस प्रोटोकॉल को प्रवाह दर और केंद्रीकरण गति को संशोधित करके विभिन्न सेल प्रकारों और प्रक्रियाओं पर आसानी से लागू किया जा सकता है। हमारे प्रोटोकॉल ने मैनुअल प्रक्रिया की तुलना में कम प्रसंस्करण समय के साथ उच्च सेल वसूली का प्रदर्शन किया। स्वचालित प्रक्रिया से बरामद कोशिकाओं ने भी अपनी प्रसार दरों को बनाए रखा । डिवाइस को बफर एक्सचेंज, सेल फॉर्मूलेशन और क्रायोप्रिजर्वेशन जैसे चरणों को समायोजित करने के लिए एक बंद विनिर्माण प्रक्रिया में मॉड्यूलर घटक के रूप में लागू किया जा सकता है।

Introduction

आधुनिक चिकित्सा के परिदृश्य जीन और सेल आधारित चिकित्सा (जीसीटी) में हाल की घटनाओं के माध्यम से तेजी से बदल गया है । ट्रांसलेशनल रिसर्च में सबसे तेजी से बढ़ते क्षेत्रों में से एक के रूप में, जीसीटी क्षेत्र को भी अद्वितीय और अभूतपूर्व चुनौतियों का सामना करना पड़ता है । मजबूत नैदानिक परिणामों के अलावा, जीसीटी की वाणिज्यिक सफलता के लिए कुशल और लागत प्रभावी विनिर्माण प्रक्रियाएं आवश्यक हैं, जो विशेष रूप से छोटे पैमाने पर विनिर्माण1में प्राप्त करना मुश्किल है। समय, श्रम और गुणवत्ता आश्वासन की लागत बढ़ाया जाता है जब कोशिकाओं के प्रत्येक बैच केवल सैकड़ों या हजारों के बजाय एक मरीज के लिए कुछ खुराक पैदा करता है । एलोजेनिक सेल उपचारों के विपरीत जिसमें विनिर्माण प्रक्रियाएं एंटीबॉडी और पुनः संयोजन प्रोटीन के उत्पादन के समान हैं, ऑटोलोगस सेल उपचार आमतौर पर छोटे पैमाने पर संचालन1के रूप में उत्पादित होते हैं। बायोफार्माविनिर्माण2में अपेक्षाकृत नई घटना के रूप में, छोटे पैमाने पर सेल प्रसंस्करण के लिए विकल्प वर्तमान में काफी सीमित हैं।

बफर एक्सचेंज सेल विनिर्माण के लिए आवश्यक है। यह डाउनस्ट्रीम प्रक्रियाओं में से एक है जहां कोशिकाओं को संस्कृति मीडिया से हटा दिया जाता है और क्रायोप्रिजर्वेशन या जलसेक के लिए केंद्रित किया जाता है। वर्तमान में, छोटे पैमाने पर सेल विनिर्माण अक्सर अकादमिक अनुसंधान सेटिंग में उन लोगों के समान प्रक्रियाओं को लागू करता है और 3बंध्यताबनाए रखने के लिए विशेष स्वच्छ कमरे पर निर्भर करता है । मैनुअल डाउनस्ट्रीम प्रक्रियाएं अक्सर वॉल्यूम डिडक्शन और बफर एक्सचेंज के लिए पैलेट और रिस्ट्रेन सेल के लिए बेंचटॉप अपकेंद्री का उपयोग करती हैं। ये खुली प्रक्रियाएं महंगी (यानी, श्रम और स्वच्छ कमरे मेंटेनेंस) हैं और इसमें सीमित विनिर्माण क्षमता है, जो वाणिज्यिक उत्पादन2,3के लिए आदर्श नहीं हैं।

विनिर्माण दक्षता में सुधार और वाणिज्यिक पैमाने पर प्रस्तुतियोंकोप्राप्त करने के समाधान के रूप में स्वचालन को लागू करने का प्रस्ताव किया गया है । गामा विकिरण या टर्मिनल एंड फिल्ट्रेशन जैसे जीवविज्ञान के लिए उपयोग किए जाने वाले पारंपरिक तरीकों के माध्यम से सेल-आधारित उत्पादों में स्टर्लिटी हासिल नहीं की जा सकती है। इसके बजाय, एक स्वचालित बंद प्रणाली संदूषण के जोखिम को कम करने के लिए तैनात किया जाता है और ऑपरेटरों को निष्फलबनाएरखने के लिए स्वच्छ कमरे पर निर्भर 4 । प्रोसेस ऑटोमेशन या तो समानांतर (स्केल-आउट) में चलने वाले कई सिस्टम होने या किसी व्यक्तिगत डिवाइस (स्केल-अप) की प्रसंस्करण क्षमता को बढ़ाकर स्केलेबिलिटी के मुद्दे को भी संबोधित करता है, जो बदले में ऑपरेटरों के बीच परिवर्तनशीलता को कम करता है । इसके अलावा, ऑटोलोगस उपचारों के लागत मॉडलिंग विश्लेषण से पता चलता है कि स्वचालन से विनिर्माण की लागत5,6कम हो सकती है। हालांकि, एक ऑटोलॉगस स्टेम सेल नैदानिक परीक्षण में कोई लागत लाभ नहीं मिला, जहां एक स्वचालित विनिर्माण मंच का उपयोग7किया गया था, यह सुझाव देते हुए कि स्वचालन का लागत लाभ व्यक्तिगत विनिर्माण प्रक्रिया पर निर्भर हो सकता है।

विभिन्न रणनीतियां हैं जिनमें स्वचालन को मौजूदा विनिर्माण प्रक्रिया में पेश किया जा सकता है। यह या तो पूरी तरह से एकीकृत मंच या मॉड्यूलर आधारित प्रसंस्करण श्रृंखला को लागू करके प्राप्त किया जा सकता है। ऑटोलॉगस सेल मैन्युफैक्चरिंग के लिए व्यावसायिक रूप से कई पूरी तरह से एकीकृत प्लेटफॉर्म उपलब्ध हैं, जैसे क्लिनिमैक्स कौतुक (मिल्टेनी बायोटेक), कोकून (ऑक्टेन बायोटेक), और क्वांटम (टेरुमो बीसीटी)। इन एकीकृत प्लेटफार्मों, जिन्हें अक्सर “जीएमपी-इन-ए-बॉक्स” के रूप में वर्णित किया जाता है, बुनियादी ढांचे पर कम मांग रखते हैं और काम करना आसान होता है। हालांकि, पूरी तरह से एकीकृत सेटअप की विनिर्माण क्षमता प्रणाली से जुड़े इनक्यूबेटर द्वारा प्रतिबंधित की जा सकती है। उदाहरण के लिए, कौतुक की कुल क्षमता अपने 400 मीटर चैंबर8 तक सीमित है और क्वांटम कारतूस में एक सीमित सतह क्षेत्र है जो 2.1 मीटर2 (120 टी175 फ्लास्क के बराबर)7है, जो उच्च कोशिका खुराक9,10की आवश्यकता वाले रोगियों के लिए पर्याप्त नहीं हो सकता है। इसके अतिरिक्त, कौतुक और क्वांटम में एक आम विशेषता है जो उनके उपयोग को सीमित करती है: परिचालन इकाई को सेल विस्तार अवधि में कोशिकाओं के एक बैच द्वारा कब्जा कर लिया जाता है, इस प्रकार प्रत्येक इकाई11द्वारा निर्मित किए जा सकने वाले बैचों की संख्या को सीमित करता है। स्वचालन के प्रति मॉड्यूलर दृष्टिकोण कई मॉड्यूलर इकाइयों के साथ एक विनिर्माण श्रृंखला बनाना है जो वाणिज्यिक विनिर्माण प्रक्रिया12,13का अनुकरण करता है । यह दृष्टिकोण, जो संस्कृति डिवाइस को सेल वाशिंग डिवाइस से अलग करता है, जिससे विनिर्माण दक्षता को अधिकतम किया जा सकता है। एक आदर्श प्रसंस्करण उपकरण वह होगा जो विनिर्माण के लिए अनुकूलनीय और स्केलेबल है12की आवश्यकता है ।

काउंटरफ्लो सेंट्रलियूगेशन (सीएफसी) तकनीक, जो 1970 के दशक में वापस आ गई है, सेल प्रोसेसिंग14में एक लंबा इतिहास रहा है । यह एक प्रतिप्रवाह बल के साथ अपकेंद्रित्र बल संतुलन द्वारा सेल एकाग्रता और जुदाई प्राप्त करता है। आमतौर पर, एक सेल निलंबन एक निरंतर प्रवाह दर के तहत एक सेल कक्ष के संकीर्ण अंत से प्रवेश करता है, जबकि एक अपकेंद्रित्र बल(चित्रा 1ए)के अधीन है। तरल पदार्थ का प्रवाह विपरीत दिशा में अपकेंद्रित्र बल में लगाया जाता है। इसे काउंटरफ्लो फोर्स के रूप में जाना जाता है, जो सेल चैंबर के भीतर एक ढाल बनाता है। इसके बाद काउंटरफ्लो फोर्स कम हो जाती है क्योंकि सेल चैंबर शंकु के आकार के सेल चैंबर की नोक से दूर हो जाता है । उच्च घनत्व और बड़े व्यास वाली कोशिकाओं में उच्च तलछट दर होती है, और इस प्रकार वे शंकु के आकार के सेल कक्ष की नोक की ओर बल संतुलन तक पहुंचते हैं। छोटे कण कक्ष के आधार की ओर संतुलन तक पहुंच सकते हैं या कक्ष में बनाए रखने के लिए बहुत छोटे हो सकते हैं और धोया जाएगा। सीएफसी तकनीक ज्यादातर रक्त एपेरेसिस उत्पादों को संसाधित करने में अपने आवेदन के लिए जानी जाती है, जैसे कि डेंड्रिटिक सेल उपचारों के लिए मोनोसाइट्स को अलग करना15,16। बफर एक्सचेंज के संदर्भ में, सीएफसी प्रौद्योगिकी केवल बड़े पैमाने पर विनिर्माण17 में लागू किया गया है और अभी तक ऑटोलोगस सेल चिकित्सा के छोटे पैमाने पर विनिर्माण के लिए इस्तेमाल किया जाना है ।

छोटे पैमाने पर सेल विनिर्माण के लिए एक उपयुक्त डिवाइस की आवश्यकता को संबोधित करने के लिए, एक स्वचालित सीएफसी डिवाइस (सामग्री की तालिकादेखें), हाल ही में18विकसित किया गया था । स्वचालित सेल प्रोसेसिंग डिवाइस सेल मलबे को हटाने और बफर एक्सचेंज की सुविधा के लिए काउंटरफ्लो सेंट्रलियूजेशन तकनीक का उपयोग करता है। डिवाइस एक एकल उपयोग किट के साथ बफर एक्सचेंज करता है जिसे सेल ट्रांसफर बैग से बाँझ-कनेक्ट किया जा सकता है, जो कोशिकाओं को बाँझ, संलग्न प्रणाली के भीतर संसाधित करने की अनुमति देता है। यहां, हम स्वचालित प्रोटोकॉल में स्तनधारी कोशिका संस्कृतियों में बफर एक्सचेंज करने के लिए एक प्रतिप्रवाह अपकेंद्री उपकरण के उपयोग की जांच करते हैं। इस अध्ययन में, हमने क्रमशः गैर-अनुयायी और अनुयायी सेल प्रकारों को मॉडल करने के लिए जुरकैट कोशिकाओं और मेसेंचिमल स्ट्रोमल कोशिकाओं (एमएससी) का उपयोग करके बफर एक्सचेंज प्रोटोकॉल का परीक्षण किया। जुरकैट कोशिकाओं को अमर कर दिया जाता है टी कोशिकाएं अक्सर तीव्र टी सेल ल्यूकेमिया19,20के अध्ययन के लिए उपयोग की जाती हैं । एमएससी वयस्क स्टेम सेल हैं जिनका अध्ययन मानव नैदानिक परीक्षणों में विभिन्न प्रकार की बीमारियों के लिए किया गया है9.

Protocol

1. बफर एक्सचेंज के लिए अभिकर्मकों और कोशिकाओं की तैयारी एक वर्ग 2 लैमिनार प्रवाह हुड में बफ़र्स (सामग्री की तालिकादेखें) तैयार करें। एक सिरिंज और सुई विधानसभा का उपयोग करना, एक 500 मिलील खारा बैग ?…

Representative Results

इस प्रोटोकॉल में, हमने स्वचालित बफर एक्सचेंज प्रक्रिया को प्रदर्शित करने के लिए प्रतिनिधि उदाहरण के रूप में जुरकैट कोशिकाओं और एमएससी का उपयोग किया। इस प्रक्रिया के दौरान, जुरकैट कोशिकाओं और एमएससी ?…

Discussion

स्वचालित बफर एक्सचेंज प्रोटोकॉल वर्णित सरल और उपयोगकर्ता के अनुकूल है। फिर भी, इस प्रोटोकॉल में कुछ महत्वपूर्ण कदम हैं जो महत्वपूर्ण हैं और विशेष ध्यान देने की आवश्यकता है। हमारे अनुभव में, जब एमएससी …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

यह काम विक्टोरियन सरकार के परिचालन बुनियादी ढांचे के समर्थन कार्यक्रम, और आर्थिक विकास, नौकरियां, परिवहन और संसाधन विभाग द्वारा प्रदान किए गए विक्टोरियन सरकारी प्रौद्योगिकी वाउचर द्वारा समर्थित है । आरएल एक राष्ट्रीय स्वास्थ्य और चिकित्सा अनुसंधान परिषद कैरियर विकास फैलोशिप के प्राप्तकर्ता है । अल एक ऑस्ट्रेलियाई स्नातकोत्तर पुरस्कार के प्राप्तकर्ता है ।

Materials

20 ml Luer lock syringes BD 302830
20% Human serum albumin (HSA) CSL Behring AUST R 46283
4-(Dimethylamino)benzaldehyde Sigma-Aldrich 156477-25g
500ml IV saline bag Fresenius Kabi K690521
Antibiotic-Antimycotic Thermo Fisher Scientific 15240112
Automated cell counter (Countess) Thermo Fisher Scientific N/A
Cell counting chamber slides Thermo Fisher Scientific C10228
Cell stimulation cocktail (500x) Thermo Fisher Scientific 00-4970-93
Cell transfer bags Terumo T1BBT060CBB
CellTiter AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS) Promega G3582
Centrifuge Eppendorf 5810R
DMEM: F12 media Thermo Fisher Scientific 11320082
EnVision plate Reader Perkin Elmer N/A
Fetal bovine serum (FBS) Thermo Fisher Scientific 10099141
Human Interleukin 2 (IL2) Kit Perkin Elmer Al221C
Luer (female) fittings CPC LF41
PC laptop or PC tablet device ASUS N/A
Plate reader (SpectraMax i3) Molecular Device N/A
Recombinant Human IFN-γ PeproTech 300-02
Rotea counterflow centrifuge cell processing device Scinogy N/A
Rotea single-use processing kit Scinogy N/A
RPMI media Thermo Fisher Scientific 11875119
Surgical scissors ProSciTech 420SS
Trichloroacetic acide Sigma-Aldrich T6399-250g
Trypan Blue stain Thermo Fisher Scientific T10282
Trypsin digestion enzyme (TrypLE Express Enzyme) Thermo Fisher Scientific 12604013

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Li, A., Wilson, S., Fitzpatrick, I., Barabadi, M., Chan, S. T., Krause, M., Kusuma, G. D., James, D., Lim, R. Automated Counterflow Centrifugal System for Small-Scale Cell Processing. J. Vis. Exp. (154), e60423, doi:10.3791/60423 (2019).

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