Summary
自动化是电池制造中提高规模和成本管理的关键。本手稿描述了使用逆流离心细胞处理装置实现缓冲液交换和细胞浓度步骤的自动化，用于小规模生物处理。
Abstract
基因和基于细胞的疗法的成功商业化需要具有成本效益和可扩展性的制造过程。缓冲液交换和产品浓缩是大多数制造过程的基本组成部分。但是，在产品开发的早期阶段，这些步骤通常是手动执行的。用于缓冲区交换的手动死端离心是劳动密集型、成本高昂且不可扩展的。封闭的自动化系统可以有效地消除这一费力的步骤，但实施可能具有挑战性。在这里，我们描述了一种新开发的细胞处理设备，它适用于中小型细胞处理，旨在弥合手动处理与大规模自动化之间的差距。通过修改流速和离心速度，可轻松将该协议应用于各种细胞类型和过程。与手动工艺相比，我们的协议演示了高细胞恢复，处理时间更短。从自动化过程中恢复的细胞也保持其增殖率。该器件可作为模块化组件应用于封闭的制造工艺中，以适应缓冲液交换、细胞配方和冷冻保存等步骤。
Introduction
现代医学的格局已经迅速改变，最近发展的基因和细胞为基础的疗法（GCT）。作为翻译研究领域发展最快的领域之一，GCT 行业也面临着独特且前所未有的挑战。除了强大的临床结果外，高效和具有成本效益的制造工艺对于GCT的商业成功至关重要，这在小规模制造1中尤其难以实现。当每批细胞只为一个病人生产几剂，而不是数百或数千次时，时间、劳动力和质量保证的成本被放大了。与异体细胞疗法不同，其制造过程更类似于抗体和重组蛋白的产生，自体细胞疗法通常作为小规模手术1生产。作为生物制药制造中较新的现象，目前小规模细胞加工的选择相当有限。
缓冲液交换对细胞制造至关重要。它是从培养培养体中去除细胞并浓缩用于冷冻保存或输液的下游过程之一。目前，小型细胞制造通常采用与学术研究环境类似的工艺，并依靠专门的洁净室来维持无菌3。手动下游工艺通常使用台式离心机对细胞进行颗粒和重悬浮，以减小体积和交换缓冲液。这些开放式工艺成本高昂（即人工和洁净室维护），制造能力有限，不适合商业生产2、3。
实施自动化已提出作为一种解决方案，以提高制造效率和实现商业规模生产2。在细胞产品中，不能通过用于生物制剂的传统方法（如伽马辐照或终端末端过滤）实现无菌。相反，部署了一个自动封闭系统，以减少污染的风险，操作人员依靠洁净室来维持无菌性。流程自动化还解决了可伸缩性问题，要么让多个系统并行运行（横向扩展），要么增加单个设备的处理能力（向上扩展），从而最大限度地减少操作员之间的可变性。此外，对自体疗法的成本建模分析表明，自动化可以降低制造成本5，6。然而，在一项自动干细胞临床试验中，没有发现任何成本效益，其中使用了7个自动化制造平台，这表明自动化的成本优势可能取决于单个制造过程。
自动化可以引入到现有的制造过程中，有不同的策略。这可以通过实现完全集成的平台或基于模块化的处理链来实现。有几个完全集成的平台可用于自体细胞制造，如CliniMACS神童（米尔滕尼生物泰克），可可（奥克坦生物技术）和量子（特鲁莫BCT）。这些集成平台通常被描述为"一盒 GMP"，对基础设施的要求较低，易于操作。但是，完全集成设置的制造能力可能会受到系统连接的孵化器的限制。例如，神童的培养能力仅限于其400mL室8，量子盒的极限表面积设置为2.1m2（相当于120 T175烧瓶）7，这可能不足以为需要更高细胞剂量9，10的患者。此外，神童和昆腾有一个共同的属性，限制他们的使用：操作单元被一批细胞在整个细胞扩展期间，从而限制了每个单元11可以制造的批次数。模块化自动化方法是创建一个具有多个模块化单元的制造链，以模拟商业制造工艺12、13。这种方法将培养装置与细胞清洗装置分离开来，从而最大限度地提高了制造效率。理想的加工设备是适应和可扩展的制造需求12。
反流离心（CFC）技术，可以追溯到20世纪70年代，在细胞处理方面有着悠久的历史。它通过平衡离心力和反流力来实现细胞浓度和分离。通常，细胞悬浮液在恒定流速下从细胞室的窄端进入，同时受到离心力的影响（图1A）。流体的流动与离心力方向相反。这称为逆流力，在细胞室内形成渐变。反流力则随着细胞室从锥形细胞室尖端变宽而减小。密度越高，直径越大的细胞具有较高的沉降率，因此它们达到向锥形细胞室尖端的力平衡。较小的颗粒可能达到向造型室底部的平衡，或太小，无法保留在腔室中，将被冲走。CFC技术主要以其在加工血液化产品中的应用而闻名，例如为树突状细胞疗法15、16分离单核细胞。在缓冲液交换方面，氟氯化碳技术只应用于大规模制造17，尚未用于小规模的自体细胞疗法制造。
为了满足小型细胞制造需要，最近开发了一种自动化的氟氯化碳装置（见材料表）。自动化细胞处理装置使用逆流离心技术去除细胞碎片，促进缓冲液交换。该设备使用一次性试剂盒进行缓冲交换，该试剂盒可无菌连接到细胞转移袋，从而允许在无菌封闭系统中处理细胞。在这里，我们研究在自动协议中使用逆流离心装置在哺乳动物细胞培养中执行缓冲交换。在这项研究中，我们分别测试了使用Jurkat细胞和美位位细胞（MSCs）的缓冲交换协议，分别对非附着细胞和附着细胞类型进行建模。Jurkat细胞是永生的T细胞，常用于研究急性T细胞白血病19、20。MSCs是成人干细胞，已在人类临床试验中研究过各种疾病9。
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Protocol
1. 制备试剂和细胞进行缓冲液交换
- 在 2 类层流罩中准备缓冲器（参见材料表）。使用注射器和针头组件，从 500 mL 盐袋中取出 50 mL 的盐水溶液。用50 mL的20%人血清白蛋白（HSA）代替，使2%的HSA在盐水中，这将作为洗涤缓冲液。
- 从培养容器中取出细胞，并执行细胞计数，通过锥蓝色排除来确定起始细胞数量和生存能力。将细胞装入转包中。
注：在此协议中，Jurkat 细胞在 RPMI 中培养，MSC 在 DMEM：F12 中培养。两种介质均辅以10%胎儿牛血清（FBS）和1%抗生素-抗菌溶液。细胞在37°C培养，CO2为5%。对于MSC或粘附细胞，将消化酶（如胰蛋白酶）加入培养容器，以分离细胞，并在细胞分离后用培养基淬火。该协议使用了转移袋，因为细胞在培养容器中扩展。但是，如果细胞在细胞培养袋中培养，则可以通过无菌管焊接将其直接连接到一次性试剂盒。在此协议中，每次运行使用 3 x 107 Jurkat 单元或 1 x 107 MSC，其中细胞悬浮在 40 mL 的培养培养素中。- 如果有无菌管焊机将转用袋连接到一次性处理套件，则使用注射器和针头组件将细胞装入转用袋（参见材料表）。
- 或者，使用一把高压灭其要的剪刀切割连接管，连接管与转移袋相连约 10 厘米，并在管的末端添加一个母 Luer 连接器。使用注射器吸入细胞和介质，然后将注射器连接到 Luer 连接器，并将细胞装载到转接袋。
- 连接包含细胞的袋子，清洗含有步骤1.1中准备的500 mL洗涤缓冲液的缓冲液，将注射器收集到一次性试剂盒（图1B）。
注： 每个包的连接位置取决于程序中的设置。在此协议中，我们将废袋连接在位置 A 处，在位置 B 处清洗缓冲液，在位置 D 和 F 处清洗液袋，在位置 H 处收集注射器（图 1C）。
2. 自动缓冲交换协议程序
- 打开设备的图形用户界面 （GUI），然后按笔记本电脑或平板电脑上的"START"按钮。然后"打开"现有协议或按"新"以创建新协议。
- 使用"前进"和"向后"按钮导航每一步，选择要打开/关闭的阀门、离心速度、泵速度、泵方向和动作触发器。每个步骤的设置在表 1中汇总。然后保存协议。
3. 设置机器
- 将一次性处理套件放在机器上，并相应地挂上连接的袋子。按红色"停止/重置"按钮将所有阀门重置为默认关闭位置。
注：当门关闭时，机器将执行测试，以确保套件已正确放置，并且所有阀门均正常工作。 - 将 GUI 连接到处理设备，然后按"连接"按钮。然后下载保存的程序。当绿色的"播放"按钮亮起时，它表示协议已准备好启动。
- 打开转移袋管的手动夹具。
注：如果操作员忘记打开卡箍，设备将停止，压力传感器警告将出现。按"停止"按钮重置设备并打开卡箍以重新启动。
4. 自动缓冲交换
- 按"开始"以启动缓冲区交换程序。
注：要手动更改自动过程，请按"下一步"按钮移动到下一步，然后再达到"触发器"或按"暂停"以暂停进程。这将通过试剂盒循环电池，同时仅保持阀 J 和 K 打开（图 1C）。 - 在自动化步骤6（表1）结束时，当现在清空的袋子中的空气触发气泡传感器时，该过程将暂停。如果袋子确实是空的，按"下一步"将流程移动到下一步，或者按"暂停"以恢复处理，如果传感器是由线路中的气泡触发的。
5. 收集和取样细胞
- 自动处理完成后，关闭所有油管夹。打开门，将一次性套件从设备中取下。断开注射器以收集细胞以进行后续处理。对收集的细胞进行样本，进行细胞计数和活力检查（参见步骤 6.2）。
6. 流程验证
- 使用手动缓冲区交换协议执行控制实验。
- 离心细胞悬浮在200 x g下5分钟，丢弃上清液，用30 mL的细胞洗涤缓冲液重新悬浮细胞。在200 x g下再次将细胞悬浮液离心5分钟。丢弃上清液，用10 mL的细胞洗涤缓冲液重新悬浮细胞。
- 通过试青排排测定执行细胞计数，使用自动细胞计数器评估细胞活力。
- 执行 MTS 测定，在 2、24 和 48 小时量化细胞增殖。
注：MTS测定是按照制造商的说明在96孔组织培养板上进行的。缓冲液交换过程后，每孔的细胞培养基（包含10，000Jurkat细胞或1，500个）的100μL等分。在每个时间点，将20μL的MTS试剂加入每个井中，并在37°C下孵育2小时。使用板式读卡器在 490 nm 处评估吸光度。 - 执行功能测定，比较自动化过程与手动过程对Jurkat单元和MSC功能的影响。
- 培养Jurkat细胞在96孔板中，密度为1 x 106细胞/mL，在DMEM：F12培养基中，含有10%胎儿牛血清（FBS）的培养Jurkat细胞，用50纳克/mL磷脂12-乙酸酯（PMA）和1μg/mL电霉素（细胞刺激鸡尾酒）刺激，含有10%胎儿牛血清（FBS）24小时。 用5%的CO2在37°C下孵育细胞。
- 根据制造商的说明，使用基于珠的ELISA测定（见材料表）测量来自培养上清液的白素-2生产。
- 培养MSCs在12孔板的密度为10，000细胞/cm2在1mL的DMEM：F12介质含有10%FBS补充干扰素-50单位/mL48小时. 收集上清液的基努宁浓度测定，以测量依二苯胺2，3-二氧酶（IDO）酶活性MSCs的酶活性如前所述21。
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Representative Results
在此协议中，我们使用 Jurkat 单元和 MSC 作为代表性示例来演示自动缓冲区交换过程。在此过程中，Jurkat 电池和 MSC 共享相同的处理步骤，在离心力和泵速度方面存在差异，以控制流速（表 1）。图 2显示了摄像机拍摄的具有代表性的图像，说明流化细胞床在缓冲液交换过程中如何出现。通常，流化的细胞床将类似于图2A中的图像，其中细胞在圆锥的中间和朝前方积累，在室尖有一个小空间，其中细胞不会积累，细胞加载入口的开口可见。流化细胞床在引入不同粘度或密度的新缓冲液时，可进行压缩（图2B）。在此协议中，泵转速从 30~35 mL/min 降至 20 mL/min。一旦腔室充满新的缓冲液，泵速将恢复正常，以防止在造型室尖端的造粒细胞。高流速（图2C）可用于选择活细胞，因为死细胞更小更轻，可以通过增加流动速率被挤出腔室。
缓冲液交换的自动化过程是首先集中细胞，然后引入洗涤缓冲液，大约是流化细胞床体积的10倍。然后，细胞被配制到所需的体积。这三个处理步骤的设计遵循与手动缓冲区交换相同的原则。通常，双周期离心（200 x g，5分钟）用于进行手动缓冲液交换，其中细胞被颗粒浓缩，重新悬浮洗涤，然后再次离心，重新悬浮到最终体积。与手动流程相比，自动化流程的处理时间较短（图 3）。Jurkat细胞和MSC的手动和自动过程之间的恢复率相似，细胞的存活率不受该过程的影响（图4）。细胞质量通过细胞增殖（MTS测定）和细胞因子/酶生产得到验证。回收的细胞在手动和自动过程之间表现出类似的增殖率（图5A）。来自Jurkat细胞的白细胞-2和MSCs的IDO活性水平在两组之间也是可比的（图5B和5C）。
| 步骤编号 | 描述 | 打开阀 | 离心速度 （g） | 泵速（毫升/分钟） | 触发器 | |
| 1 | 从 B 到 A 的优质管 | A、B、K | 10 | 50 | 体积： 45 毫升 | |
| 2 | 从 A 到 B 填充气泡陷阱 | A、B、K | 100 | 50 （反向） | 体积： 10 毫升 | |
| 3 | 质管 A 到 D | A、D、K | 100 | 50 （反向） | 体积： 2 毫升 | |
| 4 | 优质管 J 到 K | J， K | 100 | 50 | 体积： 3 毫升 | |
| 5 | 称重传感器 = 初始起始 D 到 G | D， K， G | 1600 （朱尔卡特） 1500 （MSC） | 25 （朱尔卡特） 30 （MSC） | 体积： 100 毫升 | |
| 6 | 带气泡检测的称重传感器 [在检测到气泡/空管时，程序将暂停并等待操作员的命令，按"暂停"或"下一步"] | A、D、K | • 最后一步 | 30 （朱尔卡特） 35 （MSC） | 气泡传感器 D | |
| 7 | 端口 D 管上的剩余介质空 | A、D、K | • 最后一步 | • 最后一步 | 体积： 1.5 毫升 | |
| 8 | 洗涤细胞 1 | A、B、K | • 最后一步 | 20 | 体积： 20 毫升 | |
| 9 | 提高洗涤速度 | A、B、K | • 最后一步 | 35 | 定时器：5 秒速度斜坡 | |
| 10 | 洗涤细胞 2 | A、B、K | • 最后一步 | • 最后一步 | 体积： 20 毫升 | |
| 11 | 准备收获 | J， K | • 最后一步 | • 最后一步 | 定时器：2 秒 | |
| 12 | 将细胞回收输出并稀释至目标体积 | B， J， K | • 最后一步 | 60 （反向） | 体积： 10 毫升 | |
| 注意："= 最后一步"是 GUI 中离心速度和泵速的设置选项。 | ||||||
表 1：Jurkat 单元和 MSC 的自动缓冲区交换 GUI 设置。
图1：逆流离心细胞处理系统。（A） 说明反流离心原理的示意图.反流力存在于细胞室内的梯度中。当离心（灰箭）时，直径较大的细胞接收更高的沉积力，其中细胞达到力平衡，朝向室的窄端，形成流化的细胞床。细胞碎片和小颗粒太小，无法留在腔室中被冲走。（B） 逆流离心处理系统由处理装置和一次性处理套件组成。（C） 缓冲区交换协议的一次性套件配置。请点击此处查看此图的较大版本。
图2：细胞室中的流化细胞床。（A）中等化细胞床的代表性图像，低（B）和（C）高流速 .虚线表示腔内流化细胞床的区域。请点击此处查看此图的较大版本。
图3：Jurkat细胞和MSC的细胞处理时间与手动和自动处理的比较。（n = 3⁄4 在每个组中，数据以均值 = SD 表示）。请点击此处查看此图的较大版本。
图4：使用手动和自动处理比较Jurkat细胞和MSC的细胞活力和活细胞恢复。细胞存活 （A） 和活细胞恢复 （B） 通过使用自动细胞计数器的锥蓝色排除测定进行测量.在没有血清或只处理3 x 106或1 x 106细胞时，活细胞恢复减少。（n = 4+9，每组数据以均值 = SD 表示）。请点击此处查看此图的较大版本。
图5：细胞增殖和细胞功能从手动和自动处理。（A） 在缓冲液交换后 2、24 和 48 h 处对 Jurkat 细胞和 MSCs 进行 MTS 测定。回收的细胞的质量由来自Jurkat细胞的美乐素-2和MSCs（C）中的IDO活性进行量化。（n = 4–8，每组数据以均值 = SD 表示）。请点击此处查看此图的较大版本。
图6：流化细胞床以不同流速的稳定性。为每个单元格类型执行两个进程。在一个过程中，3 x 107 Jurkat 细胞或 1 x 107 MSC。在第二个过程中，使用了10倍的细胞数量。在这两个过程中，使用该协议中指明的离心速度（Jurkat细胞为1，600 x g，MSCs为1，500 x g），以不同的流速从端口A收集10 mL的细胞elutriate。测定了elutriate中的细胞数量，并呈格为腔室中加载的细胞总量的百分比。（n = 3，每个组，数据以平均值 = SD 表示）。请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
描述的自动缓冲区交换协议简单且用户友好。但是，此协议中有几个关键步骤至关重要，需要特别注意。根据我们的经验，在处理较大的细胞（如 MSC（平均直径 10-15 μm）时，每次运行应至少包括 1 x 107个细胞，以实现最佳细胞恢复（图 4B）。处理较小的细胞，如Jurkat细胞（平均直径为±10μm），需要大约3 x 107个细胞来实现一个稳定的流化细胞床（图4B）。当细胞数过低时，细胞更有可能从流化床中取出，这将影响最终的细胞恢复。此外，我们比较了当应用恒定的离心速度时不同泵速度的细胞损失率。在这里，我们观察到细胞损失随流速而增加（图6），这是由于流化床在较高的流速下越来越不稳定。但是，当将 10 倍的细胞数加载到腔室中时，细胞损失的百分比较低，这表明在处理大量电池时可以应用更高的泵速度，以便更快地处理。在该过程的第 5 步中，100 mL 的培养基从腔室重新循环回细胞转移袋，使流化床在体积减少和缓冲液交换之前形成并稳定下来。如果细胞浓度低（例如，低于0.2 x 106/mL），可能需要延长再循环步骤，以允许足够的细胞形成流化细胞床。同样，如果细胞浓度高，再循环步骤可以缩短。
洗涤缓冲液中血清的存在对细胞恢复也至关重要。先前的研究表明，在没有缓冲蛋白22，23的情况下，水动力应激会导致坏死细胞死亡。逆流离心系统的流动性相当复杂。在此协议中，当在没有血清的情况下执行该过程时，细胞恢复率下降到70%左右（图4B）。虽然确切的机制尚不清楚，但洗涤缓冲液中培养培养蛋白或白蛋白中血清的存在能够减轻对细胞的潜在机械损伤。对于需要无血清缓冲液的应用，羟乙基淀粉和dextran 40是非蛋白添加剂的例子，常用于细胞制造，以防止水动力应力24，25。
逆流离心技术已应用于大型生物制药制造和血液制品加工17.氟氯化碳技术在小规模细胞制造中的应用（即0.1~10 L）通常仅限于将单核细胞从抗化产物中分离，如Elutra（TerumoBCT）26，其中需要额外的人工干预来执行洗涤和浓缩步骤。其他小规模细胞处理平台包括基于膜过滤的缓冲交换系统，如LOVO（弗雷塞纽斯卡比）27和垂直离心分离，如Sepax（GE医疗保健）28。尽管很难在器件之间进行直接比较，但该反流离心器件的优点之一是其输出量非常小（最小为 5 mL），是现有单元处理平台中最小的输出量。小输出体积适用于诸如配制局部注射细胞29或新生儿输注30等应用。设备中嵌入的摄像头也是一项独特的功能，可在过程开发阶段提供流化细胞床的可视化。
CFC 技术的局限性之一是它对细胞的大小和密度敏感。在为不同的细胞类型设置缓冲交换协议时，此处介绍的协议应作为用户根据需求进行优化的指南，同时牢记其感兴趣的细胞的大小和细胞悬浮密度。尽管当前协议可用于处理多达 5 L 的介质，但处理时间将大大延长（即 1⁄2 小时）。值得注意的是，在目前的研究中，没有研究延长处理时间对细胞质量的影响。
未来的研究将评估处理速度和处理时间对细胞功能的影响，以确定设备的最大处理能力。此外，未来的研究可能会探索其他应用，如从冷冻保存产品中去除二甲基硫酸盐（DMSO）和选择性去除死细胞。
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Disclosures
SW、IF 和 DJ 是首席运营官、首席执行长和 Scinogy Pty Ltd. 的首席执行官。Scinogy 还提供对氟氯化碳装置的访问。
Acknowledgments
这项工作得到维多利亚州政府运营基础设施支助计划以及经济发展、就业、运输和资源部提供的维多利亚州政府技术券的支持。RL 是国家健康和医学研究委员会职业发展奖学金的获得者。AL 是澳大利亚研究生奖的获得者。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 20 ml Luer lock syringes | BD | 302830 | |
| 20% Human serum albumin (HSA) | CSL Behring | AUST R 46283 | |
| 4-(Dimethylamino)benzaldehyde | Sigma-Aldrich | 156477-25g | |
| 500ml IV saline bag | Fresenius Kabi | K690521 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Thermo Fisher Scientific | 15240112 | |
| Automated cell counter (Countess) | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| Cell counting chamber slides | Thermo Fisher Scientific | C10228 | |
| Cell stimulation cocktail (500x) | Thermo Fisher Scientific | 00-4970-93 | |
| Cell transfer bags | Terumo | T1BBT060CBB | |
| CellTiter AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS) | Promega | G3582 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| DMEM: F12 media | Thermo Fisher Scientific | 11320082 | |
| EnVision plate Reader | Perkin Elmer | N/A | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 10099141 | |
| Human Interleukin 2 (IL2) Kit | Perkin Elmer | Al221C | |
| Luer (female) fittings | CPC | LF41 | |
| PC laptop or PC tablet device | ASUS | N/A | |
| Plate reader (SpectraMax i3) | Molecular Device | N/A | |
| Recombinant Human IFN-γ | PeproTech | 300-02 | |
| Rotea counterflow centrifuge cell processing device | Scinogy | N/A | |
| Rotea single-use processing kit | Scinogy | N/A | |
| RPMI media | Thermo Fisher Scientific | 11875119 | |
| Surgical scissors | ProSciTech | 420SS | |
| Trichloroacetic acide | Sigma-Aldrich | T6399-250g | |
| Trypan Blue stain | Thermo Fisher Scientific | T10282 | |
| Trypsin digestion enzyme (TrypLE Express Enzyme) | Thermo Fisher Scientific | 12604013 |
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