Summary
A automação é fundamental para aumentar o dimensionamento e o gerenciamento de custos na fabricação de células. Este manuscrito descreve o uso de um dispositivo de processamento de células centrífugas de contrafluxo para automatizar as etapas de troca de buffer e concentração de células para o bioprocessamento em pequena escala.
Abstract
A comercialização bem-sucedida de terapias gênicas e celulares requer processos de fabricação que sejam econômicos e escaláveis. A troca de buffers e a concentração de produtos são componentes essenciais para a maioria dos processos de fabricação. No entanto, nos estágios iniciais do desenvolvimento do produto, essas etapas são muitas vezes executadas manualmente. A centrífuga manual sem saída para a troca de buffers é trabalhosa, cara e não escalável. Um sistema automatizado fechado pode efetivamente eliminar essa etapa trabalhosa, mas a implementação pode ser desafiadora. Aqui, descrevemos um dispositivo de processamento de células recém-desenvolvido que é adequado para processamento de células de pequena a média escala e visa preencher a lacuna entre processamento manual e automação em larga escala. Este protocolo pode ser facilmente aplicado a vários tipos e processos celulares, modificando a taxa de fluxo e a velocidade de centrífuga. Nosso protocolo demonstrou a recuperação elevada da pilha com uns tempos de processamento mais curtos em comparação ao processo manual. As células recuperadas do processo automatizado também mantiveram suas taxas de proliferação. O dispositivo pode ser aplicado como um componente modular em um processo de fabricação fechado para acomodar etapas tais como a troca do amortecedor, a formulação da pilha, e a criopreservação.
Introduction
A paisagem da medicina moderna transformou-se rapidamente através de desenvolvimentos recentes em terapias genéticas e celulares (GCT). Como um dos campos que mais cresce na pesquisa translacional, o setor gct também enfrenta desafios únicos e sem precedentes. Além de resultados clínicos robustos, processos de fabricação eficientes e econômicos são essenciais para o sucesso comercial da GCT, que é particularmente difícil de alcançar na fabricação de pequena escala1. O custo do tempo, do trabalho e das garantias de qualidade são ampliados quando cada lote de células produz apenas algumas doses para um paciente em vez de centenas ou milhares. Ao contrário das terapias de células alogênicas em que os processos de fabricação são mais semelhantes à produção de anticorpos e proteínas recombinantes, as terapias de células autólogas são tipicamente produzidas como operações de pequena escala1. Como um fenômeno relativamente novo na fabricação biofarmacêutica2,as opções para o processamento de células de pequena escala são atualmente bastante limitadas.
A troca de buffers é essencial para a fabricação de células. É um dos processos a jusante onde as células são removidas da mídia cultural e concentradas para criopreservação ou infusão. Atualmente, a fabricação de células de pequena escala muitas vezes aplica processos semelhantes aos do ambiente de pesquisa acadêmica e depende de salas limpas especializadas para manter a esterilidade3. Processos manuais a jusante costumam usar centrífugas bancadas para pelotas e resuspender as células para redução de volume e troca de buffer. Estes processos abertos são caros (ou seja, trabalho e manutenção de quartos limpos) e têm capacidade de fabricação limitada, que não são ideais para a produção comercial2,3.
A implementação da automação tem sido proposta como uma solução para melhorar a eficiência de fabricação e alcançar produções em escala comercial2. A esterilidade não pode ser alcançada em produtos à base de células através de métodos tradicionais utilizados para produtos biológicos, como irradiação gama ou filtragem terminal. Em vez disso, um sistema fechado automatizado é implantado para reduzir os riscos de contaminação e os operadores que dependem de salas limpas para manter a esterilidade4. A automação de processos também aborda a questão da escalabilidade por ter vários sistemas funcionando em paralelo (escala) ou aumentando a capacidade de processamento de um dispositivo individual (escala-up), o que, por sua vez, minimiza a variabilidade entre os operadores. Além disso, a análise de modelagem de custos de terapias autólogas sugere que a automação pode reduzir o custo de fabricação5,6. No entanto, nenhum benefício de custo foi encontrado em um ensaio clínico de células-tronco autólogas, onde uma plataforma de fabricação automatizada foi usada7,sugerindo que o benefício de custo da automação pode depender do processo de fabricação individual.
Existem diferentes estratégias nas quais a automação pode ser introduzida em um processo de fabricação existente. Isso pode ser alcançado através da implementação de uma plataforma totalmente integrada ou de uma cadeia de processamento modular. Existem várias plataformas totalmente integradas comercialmente disponíveis para fabricação de células autólogas, como CliniMACS Prodigy (Miltenyi Biotec), Cocoon (Octane Biotech) e Quantum (Terumo BCT). Essas plataformas integradas, que muitas vezes são descritas como "GMP-in-a-box", têm baixas demandas em infraestrutura e são fáceis de operar. No entanto, a capacidade de fabricação de uma configuração totalmente integrada pode ser restringida pela incubadora anexada ao sistema. Por exemplo, a capacidade de cultivo do Prodigy é limitada à sua câmara8 de 400 mL e o cartucho Quantum tem uma área de superfície limitante definida para 2,1 m2 (equivalente a 120 frascos T175)7, o que pode não ser suficiente para pacientes que necessitam de doses celulares mais altas9,10. Além disso, A Prodigy e a Quantum têm um atributo comum que limita seu uso: a unidade operacional é ocupada por um único lote de células durante todo o período de expansão celular, limitando assim o número de lotes que podem ser fabricados por cada unidade11. A abordagem modular para a automação é criar uma cadeia de fabricação com várias unidades modulares que simula o processo de fabricação comercial12,13. Esta aproximação, que separa o dispositivo da cultura do dispositivo de lavagem da pilha, pode desse modo maximizar a eficiência de fabricação. Um dispositivo de processamento ideal seria aquele que é adaptável e escalável às necessidades de fabricação12.
A tecnologia de centrífuga de contrafluxo (CFC), que remonta à década de 1970, teve uma longa história no processamento de células14. Ele atinge a concentração celular e separação, equilibrando a força centrífuga com uma força de contrafluxo. Normalmente, uma suspensão celular entra a partir da extremidade estreita de uma câmara celular uma taxa de fluxo constante, enquanto submetido a uma força centrífuga(Figura 1A). O fluxo do fluido é exercido na direção oposta à força centrífuga. Isto é referido como a força de contrafluxo, que forma um gradiente dentro da câmara celular. A força de contrafluxo diminui então à medida que a câmara celular se alarga para longe da ponta da câmara celular em forma de cone. Células com maior densidade e maior diâmetro têm uma maior taxa de sedimentação e, portanto, atingem o equilíbrio de força em direção à ponta da câmara celular em forma de cone. Partículas menores podem alcançar equilíbrio em direção à base da câmara ou ser pequenas demais para serem mantidas na câmara e serão lavadas. A tecnologia CFC é mais conhecida por sua aplicação no processamento de produtos de apherese sanguínea, como isolar monócitos para terapias de células dendríticas15,16. Em termos de troca de buffer, a tecnologia CFC só foi aplicada na fabricação em larga escala17 e ainda não foi usada para a fabricação de menor escala de terapias de células autólogas.
Para atender à necessidade de um dispositivo adequado para fabricação de células de pequena escala, um dispositivo CFC automatizado (Ver Tabela de Materiais),foi recentemente desenvolvido18. O dispositivo automatizado de processamento de células usa tecnologia de centrífuga de contrafluxo para remover detritos celulares e facilitar a troca de buffers. O dispositivo executa a troca do amortecedor com um jogo single-use que possa ser estéril-conectado a um saco de transferência da pilha, que permita que as pilhas sejam processadas dentro de um sistema estéril, incluido. Aqui, investigamos o uso de um dispositivo centrífuga de contrafluxo para realizar a troca de buffers em culturas celulares de mamíferos em protocolos automatizados. Neste estudo, testamos o protocolo de troca de buffer usando células Jurkat e células estromais mesenchymal (MSCs) para modelar tipos de células não aderentes e aderentes, respectivamente. As células Jurkat são células T imortalizadas frequentemente usadas para o estudo da leucemia aguda de células T19,20. Os MSCs são células-tronco adultas que têm sido estudadas em ensaios clínicos em humanos para uma ampla gama de doenças9.
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Protocol
1. Preparação de reagentes e células para troca de buffer
- Prepare amortecedores (ver Tabela de Materiais)em uma capa de fluxo laminar classe 2. Usando uma seringa e montagem de agulhas, retire 50 mL de solução saline de um saco shinhol de 500 mL. Substitua isso por 50 mL de 20% albumina soro humano (HSA) para fazer 2% HSA em soro fisiológico, que servirá como o tampão de lavagem.
- Retire as células dos vasos de cultura e realizar uma contagem celular para determinar a quantidade de células iniciais e viabilidade por exclusão trypan azul. Carregue as células em um saco de transferência.
NOTA: Neste protocolo as células Jurkat foram cultivadas em RPMI e MSCs foram cultivadas em DMEM:F12. Ambos os meios foram suplementados com soro bovino fetal de 10% (FBS) e solução antibiótico-antimicotic de 1%. As células foram cultivadas a 37 °C com 5% de CO2. Para MSCs ou células aderentes, adicione uma enzima de digestão (por exemplo, trippsina) nos vasos de cultura, a fim de separar as células, e saciar com a mídia cultural uma vez que as células são destacadas. Um saco de transferência foi usado neste protocolo porque as pilhas foram expandidas em embarcações da cultura. No entanto, se as células são cultivadas em um saco de cultura celular, ele pode ser diretamente conectado ao kit de uso único através de soldagem tubo estéril. Neste protocolo, foram utilizadas células 3 x 107 Jurkat ou 1 x 107 MSCs para cada corrida, onde as células foram suspensas em 40 mL de meios de comunicação culturais.- Carregue as células em um saco de transferência (ver Mesa de Materiais)usando uma seringa e montagem de agulhas se um soldador de tubo estéril estiver disponível para conectar o saco de transferência ao kit de processamento de uso único.
- Alternativamente, use um par de tesouras autoclaved para cortar o tubo de conexão com ao redor 10 cm restantes unido ao saco de transferência e adicione um conector fêmea de Luer à extremidade da tubulação. Use uma seringa para aspirar células e mídia, em seguida, conectar a seringa para o conector Luer e células de carga para o saco de transferência.
- Conecte o saco contendo as células, lave saco tampão contendo 500 mL de tampão de lavagem preparado na etapa 1.1, saco de resíduos e coleta de seringa para o kit de uso único(Figura 1B).
NOTA: A posição de conexão de cada saco depende das configurações do programa. Neste protocolo, conectamos o saco de resíduos na posição A, lavar tampão na posição B, saco de celular nas posições D e F, e seringa de coleta na posição H (Figura 1C).
2. Programa para protocolo automatizado de troca de buffer
- Abra a interface gráfica do usuário (GUI) do dispositivo e pressione o botão"START"em um PC ou tablet de laptop. Então "Abra" um protocolo existente ou pressione "Novo" para criar um novo.
- Use o botão"Forward"e"Backward"para navegar por cada etapa, selecione as válvulas para serem abertas/fechadas, velocidade centrífuga, velocidade da bomba, direção da bomba e gatilhos de ação. As configurações para cada etapa são resumidas na Tabela 1. Em seguida, salvar o protocolo.
3. Configuração da máquina
- Coloque o kit de processamento de uso único na máquina e pendure os sacos conectados em conformidade. Pressione o botão vermelho"Stop/Reset"para redefinir todas as válvulas na posição fechada padrão.
NOTA: A máquina realizará um teste quando a porta estiver fechada para garantir que o kit tenha sido colocado corretamente e que todas as válvulas estejam funcionando adequadamente. - Conecte o GUI ao dispositivo de processamento e pressione o botão"Connect". Em seguida, baixe o programa salvo. Quando o botão verde"Play"se ilumina, isso indica que o protocolo está pronto para começar.
- Abra os grampos manuais para a tubulação do saco de transferência.
NOTA: Se o operador se esquece de abrir os grampos, o dispositivo vai parar e o aviso do sensor de pressão aparecerá. Pressione o botão"Pare"para redefinir o dispositivo e abra os grampos para começar de novo.
4. Troca de buffer automatizada
- Press "Comece" a iniciar o programa de troca de buffer.
NOTA: Para alterar manualmente o processo automatizado, pressione o botão"Next"para passar para o próximo passo antes de chegar ao "Trigger" oupressione" Pausa " para colocar o processo em espera. Isso vai recircular as células através do kit, mantendo apenas válvulas J e K aberto (Figura 1C). - No final da automação passo 6(Tabela 1), o processo vai parar quando o ar no saco agora esvaziado desencadeia o sensor de bolha. Press "Next" para mover o processo para o próximo passo, se o saco está de fato vazio, oupressione" Pausa " para retomar o processamento, se o sensor foi acionado por uma bolha na linha.
5. Coletae e amostragem das células
- Quando o processo automatizado estiver concluído, feche todos os grampos de tubos. Abra a porta e tire o kit de uso único do dispositivo. Desligue a seringa para coletar as células para processos subsequentes. Tome uma amostra das células coletadas para uma contagem celular e verificação de viabilidade (ver passo 6.2).
6. Validação do processo
- Realize experimentos de controle usando um protocolo manual de troca de buffer.
- Suspensão celular centrífuga a 200 x g por 5 min. Descarte o supernatant e resuspenda as células com 30 mL de tampão de lavagem celular. Centrífuga a suspensão celular novamente a 200 x g por 5 min. Descarte o supernatant e resuspender as células com 10 mL de tampão de lavagem celular.
- Realizar a contagem celular através do ensaio de exclusão azul trypan para avaliar a viabilidade celular usando um contador de células automatizado.
- Realize um ensaio mts para quantificar a proliferação celular às 2, 24 e 48 h.
NOTA: O ensaio MTS foi realizado em uma placa de cultura de tecido de 96 poços de acordo com as instruções do fabricante. Um alibamento de 100 μL de meios da cultura da pilha (que contêm 10.000 pilhas de Jurkat ou 1.500) por o poço foi chapeado após o processo da troca do amortecedor. A cada ponto de tempo, 20 μL de reagentes MTS foram adicionados em cada poço e incubados por 2 h a 37 °C. A absorção foi avaliada em 490 nm usando um leitor de placa. - Realize ensaios funcionais para comparar o impacto do processo automatizado versus o processo manual nas células Jurkat e na função MSC.
- Células Culture Jurkat em uma placa de 96 poços a uma densidade de 1 x 106 células/mL estimuladas com 50 ng/mL phorbol 12-myristate 13-acetato (PMA) e 1 μg/mL ionomicina (coquetel de estimulação celular) na mídia DMEM:F12 contendo 10% de soro bovino fetal (FBS) por 24 h. Incubar as células a 37 °C com 5% de CO2.
- Medir a produção de interleucina-2 a partir de cultura supernatant usando bead-based ensaio ELISA (ver Tabela de Materiais)de acordo com as instruções do fabricante.
- MSCs cultura em uma placa de 12 poços na densidade de 10.000 células / cm2 em 1 mL de DMEM: F12 mídia contendo 10% FBS complementada com interferon-γ 50 unidades/mL para 48 h. Coletar supernatant para o ensaio de concentração de kynurenine para medir a atividade enzimática de indoleamina 2,3 dioxygenase (IDO) de MSCs como descrito anteriormente21.
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Representative Results
Neste protocolo, usamos células Jurkat e MSCs como exemplos representativos para demonstrar o processo automatizado de troca de buffers. Durante o processo, as células Jurkat e os MSCs compartilharam as mesmas etapas de processamento com diferenças na força centrífuga e na velocidade da bomba que controlam a taxa de fluxo(Tabela 1). A Figura 2 mostra imagens representativas capturadas pela câmera de como o leito celular fluido pode aparecer durante o processo de troca de buffer. Normalmente, o leito celular fluidizado se assemelhará à imagem na Figura 2A,onde as células se acumulam no meio e em direção à frente do cone com um pequeno espaço na ponta da câmara, onde as células não se acumulam e a abertura da entrada de carregamento celular é visível. A cama de pilha fluidizada pode ser comprimida(figura 2B)ao introduzir o amortecedor novo que está em uma viscosidade ou em uma densidade diferente. Neste protocolo, a velocidade da bomba foi reduzida de 30-35 mL/min para 20 mL/min no início da etapa de lavagem. Uma vez que a câmara foi enchida com o amortecedor novo, a velocidade da bomba foi retornada ao normal para impedir pilhas pelleting na ponta da câmara. Uma alta taxa de fluxo(Figura 2C)pode ser aplicada para selecionar para células vivas porque as células mortas são menores e mais leves e podem ser forçadas a sair da câmara, aumentando a taxa de fluxo.
O processo automatizado de troca tampão foi alcançado primeiro concentrando as células, em seguida, introduzindo o tampão de lavagem, que foi de cerca de 10x do volume do leito celular fluidizado. As células foram então formuladas para o volume desejado. Essas três etapas de processamento foram projetadas para seguir os mesmos princípios de uma troca manual de buffer. Normalmente, uma centrífuga de dois ciclos (200 x g,5 min) é usada para realizar a troca manual de buffer, na qual as células são inclinadas para se concentrar, resuspendidas para lavar, depois centrífugas novamente e resuspendidas para o volume final. O tempo de processamento dos processos automatizados foi menor em comparação com os manuais(Figura 3). A taxa de recuperação entre processos manuais e automatizados foi semelhante tanto para as células Jurkat quanto para os MSCs, e a viabilidade celular não foi afetada pelo processo(Figura 4). A qualidade celular foi verificada pela proliferação celular (ensaio MTS) e produção citocina/enzima. As células recuperadas apresentaram taxas de proliferação semelhantes entre o manual e os processos automatizados(Figura 5A). O nível de produção de interleucina-2 a partir de células Jurkat e atividade ido de MSCs também foram comparáveis entre os dois grupos (Figura 5B e 5C).
| Número da etapa | Descrição | Válvulas abertas | Velocidade centrífuga (g) | Velocidade da bomba (ml/min) | Gatilhos | |
| 1 | Tubulação principal de B a A | A, B, K | 10 | 50 | Volume: 45 ml | |
| 2 | Encha a armadilha da bolha de A a B | A, B, K | 100 | 50 (inverso) | Volume: 10 ml | |
| 3 | Tubulação principal A a D | A, D, K | 100 | 50 (inverso) | Volume: 2 ml | |
| 4 | Tubos prime J a K | J, K | 100 | 50 | Volume: 3 ml | |
| 5 | Células de carga - início inicial D a G | D, K, G | 1600 (Jurkat) 1500 (MSCs) | 25 (Jurkat) 30 (MSCs) | Volume: 100 ml | |
| 6 | Carregar células com bolha detectar [Na detecção de bolha / tubulação vazia, o programa vai fazer uma pausa e esperar o comando do operador, pressionar 'pausa' ou 'próximo'] | A, D, K | = último passo | 30 (Jurkat) 35 (MSCs) | Sensor de bolha D | |
| 7 | Meios restantes vazios no tubo da porta D | A, D, K | = último passo | = último passo | Volume: 1,5 ml | |
| 8 | Células de lavagem 1 | A, B, K | = último passo | 20 | Volume: 20 ml | |
| 9 | Aumentando a velocidade de lavagem | A, B, K | = último passo | 35 | Cronrizadores: 5 segundos de velocidade ramping | |
| 10 | Células de lavagem 2 | A, B, K | = último passo | = último passo | Volume: 20 ml | |
| 11 | Prepare-se para colher | J, K | = último passo | = último passo | Temporriz: 2 segundos | |
| 12 | Recuperar as células para a saída e diluir ao volume alvo | B, J, K | = último passo | 60 (Inverso) | Volume: 10 ml | |
| Nota: '= último passo' é uma opção de configuração para a velocidade de centrífuga e velocidade da bomba no GUI. | ||||||
Tabela 1: Configuração de GUI de troca de buffer automatizado para células Jurkat e MSCs.
Figura 1: Sistema de processamento de células centrífugas de contrafluxo. (A)Um diagrama esquemático ilustrando o princípio da centrífuga de contrafluxo. A força de contrafluxo está presente em um gradiente dentro da câmara celular. Enquanto centrífuga (seta cinzenta), células com diâmetros maiores recebem uma maior força de sedimentação, em que as células atingem o equilíbrio de força em direção à extremidade estreita da câmara, formando um leito celular fluidizado. Detritos celulares e pequenas partículas que são pequenas demais para permanecer na câmara são lavados. (B) O sistema de processamento centrífuga de contrafluxo consiste no dispositivo de processamento e no kit de processamento de uso único. (C)A configuração do kit de uso único para o protocolo de troca de buffer. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 2: Cama de célula fluidizada na câmara celular. Imagens representativas de um leito celular fluidizado (A)médio, (B) baixa, e (C)alta taxa de fluxo. A linha pontilhada indica a área do leito celular fluido dentro da câmara. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 3: Comparação do tempo de processamento celular das células Jurkat e MSCs com processamento manual e automatizado. (n = 3-4 em cada grupo, os dados são apresentados como média ± SD). Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 4: Comparação da viabilidade celular e recuperação de células vivas de células Jurkat e MSCs com processamento manual e automatizado. Viabilidade celular (A)e recuperação de células vivas(B)foram medidos por ensaio de exclusão azul trypan usando um contador de células automatizado. A recuperação de células vivas foi reduzida na ausência de soro ou quando apenas 3 x 106 ou 1 x 106 células foram processadas. (n = 4-9 em cada grupo, os dados são apresentados como média ± SD). Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 5: Proliferação celular e função celular do processamento manual e automatizado. (A) Ensaio MTS de células Jurkat e MSCs foram realizados em 2, 24 e 48 h após a troca tampão. A qualidade das células recuperadas foi quantificada pela produção interleucina-2 das células Jurkat (B),e da atividade da IDO em MSCs(C). (n = 4-8 em cada grupo, os dados são apresentados como média ± SD). Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 6: Estabilidade fluidizada da cama de pilha na várias taxas de fluxo. Dois processos foram realizados para cada tipo de célula. Em um processo, ou 3 x 107 células Jurkat ou 1 x 107 MSCs. No segundo processo, 10x o número de células foram utilizados. Em ambos os processos, 10 mL de elutriado celular foram coletados do porto A a várias taxas de fluxo usando a velocidade de centrífuga indicada neste protocolo (1.600 x g para células Jurkat e 1.500 x g para MSCs). O número de células no elutriado foi determinado e apresentado como percentual da quantidade total de células carregadas na câmara. (n = 3 para cada grupo, os dados são apresentados como média ± SD). Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
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Discussion
O protocolo automatizado de troca de buffer descrito é simples e amigável. No entanto, existem alguns passos-chave neste protocolo que são críticos e exigem especial atenção. Em nossa experiência, ao processar células maiores, como MSCs (diâmetro médio de 10 a 15 μm), cada corrida deve incluir pelo menos 1 x 107 células para alcançar a recuperação ideal de células(Figura 4B). O processamento de células menores, como as células Jurkat (média de ~ 10 μm de diâmetro), requer cerca de 3 x 107 células para alcançar um leito de células fluidizadas estáveis (Figura 4B). Quando o número de células é muito baixo, as células são mais propensos a ser removido do leito fluidoizado, o que afetará a recuperação final da célula. Além disso, comparamos as taxas de perda de células em diferentes velocidades de bomba quando uma velocidade centrífuga constante é aplicada. Aqui, observamos que a perda celular aumentou com a vazão(Figura 6),que se deve à crescente instabilidade do leito fluidoizado a taxas de fluxo mais elevadas. No entanto, a porcentagem de perda de celular foi menor quando 10x o número de células foram carregadas na câmara, o que sugere que uma maior velocidade de bomba pode ser aplicada ao processar um maior número de células para permitir um processamento mais rápido. Na etapa 5 do processo, 100 mL de meios de cultura foi recirculado da câmara de volta para o saco de transferência celular para permitir que o leito fluidizado para formar e estabilizar antes da redução de volume e troca tampão. Se a concentração celular for baixa (por exemplo, abaixode 0,2 x 10 6/mL), a etapa de recirculação pode precisar ser estendida para permitir que células suficientes formem o leito celular fluidizado. Da mesma forma, se a concentração celular é alta, o passo de recirculação pode ser encurtado.
A presença de soro no tampão de lavagem também é fundamental para a recuperação celular. Estudos anteriores mostraram que o estresse hidrodinâmico pode causar morte de células necóticas na ausência de proteínas tamponadas22,23. A dinâmica de fluxo do sistema centrífuga de contrafluxo é bastante complexa. Neste protocolo, as taxas de recuperação celular caíram para cerca de 70% quando o processo foi realizado na ausência de soro(Figura 4B). Embora o mecanismo exato não seja claro, a presença de soro na mídia cultural ou albumina em amortecedores de lavagem foi capaz de mitigar os potenciais danos mecânicos às células. Para aplicações que exigem amortecedores sem soro, amido hidroxyethyl e dextran 40 são exemplos de aditivos não proteicos que são frequentemente usados na fabricação de células para proteger contra o estresse hidrodinâmico24,25.
A tecnologia de centrífugade de contrafluxo tem sido usada na fabricação biofarmacêutica em grande escala e no processamento de produtossanguíneos 17. As aplicações da tecnologia CFC na fabricação de células de pequena escala (ou seja, 0,1-10 L) são muitas vezes limitadas a isolar células mononucleares de produtos de apheresis, como o Elutra (Terumo BCT)26, em que a intervenção manual adicional é necessária para realizar passos de lavagem e concentrado. Outras plataformas de processamento de células em pequena escala incluem sistemas de troca de buffer baseados em filtragem de membrana, como o LOVO (Fresenius Kabi)27 e a separação de centrífugavertical vertical, como a Sepax (GE Healthcare)28. Embora seja difícil realizar uma comparação direta entre dispositivos, uma das vantagens deste dispositivo centrífuga de contrafluxo é sua capacidade de fornecer volumes de saída muito pequenos (mínimo de 5 mL), que é o menor entre as plataformas de processamento de celular atualmente disponíveis. O pequeno volume de saída é adequado para aplicações como a formulação de células para injeções locais29 ou infusões para neonatos30. A câmera embutida no dispositivo também é uma característica única que fornece visualização do leito celular fluidizado durante a fase de desenvolvimento do processo.
Uma das limitações da tecnologia CFC é que ela é sensível ao tamanho e densidade das células. Ao configurar um protocolo de troca de buffer para um tipo de célula diferente, o protocolo apresentado aqui deve servir como uma diretriz para os usuários otimizarem de acordo com suas necessidades, tendo em mente o tamanho de suas células de interesse e a densidade de sua suspensão celular. Embora o protocolo atual seja utilizável para o processamento de até 5 L de mídia, o tempo de processamento será substancialmente estendido (ou seja, 1-2 h). É importante notar que o impacto do tempo de processamento prolongado na qualidade celular não foi examinado neste estudo atual.
Estudos futuros avaliarão o impacto da velocidade de processamento e do tempo de processamento na função celular para determinar a capacidade máxima de processamento do dispositivo. Além disso, estudos futuros podem explorar outras aplicações, como a remoção de dimetil sulfoxida (DMSO) de produtos criopreservados e remoção seletiva de células mortas.
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Disclosures
SW, IF e DJ são COO, CTO e CEO da Scinogy Pty. Ltd. O acesso ao dispositivo CFC também foi fornecido pela Scinogy.
Acknowledgments
Este trabalho é apoiado pelo Programa de Apoio à Infraestrutura Operacional do Governo vitoriano, e pelo Voucher de Tecnologia do Governo Vitoriano fornecido pelo Departamento de Desenvolvimento Econômico, Empregos, Transportes e Recursos. RL é o destinatário de um National Health and Medical Research Council Career Development Fellowship. Al é o destinatário de um Prêmio de Pós-Graduação Australiana.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 20 ml Luer lock syringes | BD | 302830 | |
| 20% Human serum albumin (HSA) | CSL Behring | AUST R 46283 | |
| 4-(Dimethylamino)benzaldehyde | Sigma-Aldrich | 156477-25g | |
| 500ml IV saline bag | Fresenius Kabi | K690521 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Thermo Fisher Scientific | 15240112 | |
| Automated cell counter (Countess) | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| Cell counting chamber slides | Thermo Fisher Scientific | C10228 | |
| Cell stimulation cocktail (500x) | Thermo Fisher Scientific | 00-4970-93 | |
| Cell transfer bags | Terumo | T1BBT060CBB | |
| CellTiter AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS) | Promega | G3582 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| DMEM: F12 media | Thermo Fisher Scientific | 11320082 | |
| EnVision plate Reader | Perkin Elmer | N/A | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 10099141 | |
| Human Interleukin 2 (IL2) Kit | Perkin Elmer | Al221C | |
| Luer (female) fittings | CPC | LF41 | |
| PC laptop or PC tablet device | ASUS | N/A | |
| Plate reader (SpectraMax i3) | Molecular Device | N/A | |
| Recombinant Human IFN-γ | PeproTech | 300-02 | |
| Rotea counterflow centrifuge cell processing device | Scinogy | N/A | |
| Rotea single-use processing kit | Scinogy | N/A | |
| RPMI media | Thermo Fisher Scientific | 11875119 | |
| Surgical scissors | ProSciTech | 420SS | |
| Trichloroacetic acide | Sigma-Aldrich | T6399-250g | |
| Trypan Blue stain | Thermo Fisher Scientific | T10282 | |
| Trypsin digestion enzyme (TrypLE Express Enzyme) | Thermo Fisher Scientific | 12604013 |
References
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