Summary
Otomasyon, hücre üretiminde yükseltme ve maliyet yönetiminin anahtarıdır. Bu el yazması, küçük ölçekli biyoişleme için arabellek değişimi ve hücre konsantrasyonu adımlarını otomatikleştirmek için bir karşı akış santrifüj hücre işleme cihazının kullanımını açıklar.
Abstract
Gen ve hücre bazlı tedavilerin başarılı bir şekilde ticarileştirilmesi, uygun maliyetli ve ölçeklenebilir üretim süreçleri gerektirir. Tampon değişimi ve ürün konsantrasyonu çoğu üretim süreci için gerekli bileşenlerdir. Ancak, ürün geliştirmenin erken aşamalarında, bu adımlar genellikle el ile gerçekleştirilir. Tampon değişimi için manuel çıkmaz santrifüj emek yoğun, pahalı ve ölçeklenebilir değildir. Kapalı otomatik bir sistem bu zahmetli adımı etkili bir şekilde ortadan kaldırabilir, ancak uygulama zor olabilir. Burada, küçük ve orta ölçekli hücre işleme için uygun olan ve manuel işleme ve büyük ölçekli otomasyon arasındaki boşluğu kapatmayı amaçlayan yeni geliştirilmiş bir hücre işleme cihazını tanımlıyoruz. Bu protokol, akış hızı ve santrifüj hızını değiştirerek çeşitli hücre tiplerine ve süreçlerine kolayca uygulanabilir. Protokolümüz, manuel işlemle karşılaştırıldığında daha kısa işlem süreleriyle yüksek hücre kurtarmasını gösterdi. Otomatik işlemden kurtarılan hücreler de çoğalma oranlarını korudu. Cihaz, arabellek değişimi, hücre formülasyonu ve kriyopreservation gibi adımları karşılamak için kapalı bir üretim sürecinde modüler bir bileşen olarak uygulanabilir.
Introduction
Modern tıbbın manzarası gen ve hücre temelli tedavilerdeki (GCT) son gelişmelerle hızla değişmiştir. Çeviri araştırmalarında en hızlı büyüyen alanlardan biri olan GCT sektörü, benzersiz ve eşi görülmemiş zorluklarla da karşı karşıyadır. Sağlam klinik sonuçlara ek olarak, verimli ve uygun maliyetli üretim süreçleri GCT ticari başarı için gereklidir, özellikle küçük ölçekli üretim elde etmek zordur1. Zaman maliyeti, işçilik, ve kalite güvenceleri hücrelerin her toplu sadece yüz veya binlerce yerine bir hasta için birkaç doz üretir büyütülür. Üretim süreçlerinin antikor ve rekombinant protein üretimine daha çok benzediği allojen hücre tedavilerinden farklı olarak, otolog hücre tedavileri genellikle küçük ölçeklioperasyonlar1 olarak üretilmektedir. Biyofarmasötik üretiminde nispeten yeni bir fenomen olarak2, küçük ölçekli hücre işleme seçenekleri şu anda oldukça sınırlıdır.
Arabellek değişimi hücre üretimi için gereklidir. Hücrelerin kültür medyasından çıkarıldığı ve kriyopreservation veya infüzyonu için yoğunlaştığı alt akım süreçlerinden biridir. Şu anda, küçük ölçekli hücre üretimi genellikle akademik araştırma ortamında benzer süreçler uygular ve sterilite korumak için özel temiz odalar güvenir3. Manuel downstream süreçleri genellikle hacim azaltma ve tampon değişimi için pelet ve yeniden hücreleri askıya benchtop santrifüjler kullanın. Bu açık süreçler pahalı (yani, işçilik ve temiz oda bakımı) ve ticari üretim için ideal olmayan sınırlı üretim kapasitesine sahip2,3.
Otomasyonun uygulanması, üretim verimliliğini artırmak ve ticari ölçekli üretimlere ulaşmak için bir çözüm olarak önerilmiştir2. Gama ışınlaması veya terminal uç filtrasyon gibi biyolojik yöntemlerle hücre bazlı ürünlerde sterilite elde edilemez. Bunun yerine, kontaminasyon risklerini azaltmak için otomatik kapalı bir sistem kurulur ve operatörler sterilite4korumak için temiz odalara güvenerek. Proses otomasyonu, aynı zamanda birden fazla sistem paralel çalışan (ölçeklendirme) ya da sırayla operatörler arasındaki değişkenliği en aza indirir bireysel bir cihazın işleme kapasitesini (ölçeklendirme) artırarak ölçeklenebilirlik sorunu giderir. Ayrıca, otolog tedavilerin maliyet modelleme analizi otomasyon üretim maliyetini azaltabilir düşündürmektedir5,6. Ancak, otomatik bir üretim platformu7kullanılan bir otolog kök hücre klinik çalışmada hiçbir maliyet avantajı bulundu 7 , otomasyon maliyet yararı bireysel üretim sürecine bağlı olabileceğini düşündürmektedir.
Otomasyonun mevcut bir üretim sürecine dahil edilebildiği farklı stratejiler vardır. Bu, tam entegre bir platform veya modüler tabanlı bir işlem zinciri uygulanarak elde edilebilir. CliniMACS Prodigy (Miltenyi Biotec), Cocoon (Oktan Biotech) ve Quantum (Terumo BCT) gibi otolog hücre üretimi için ticari olarak kullanılabilen birkaç tam entegre platform bulunmaktadır. Genellikle "GMP-in-a-box" olarak tanımlanan bu entegre platformlar, altyapı konusunda düşük taleplere sahiptir ve kullanımı kolaydır. Ancak, tam entegre bir kurulumun üretim kapasitesi sisteme bağlı kuluçka makinesi ile sınırlandırılabilir. Örneğin, Prodigy'nin kültür kapasitesi 400 mL haznesi8 ile sınırlıdır ve Quantum kartuşunun 2,1 m2 (120 T175 şişeye eşdeğer)olarakayarlanmış sınırlayıcı bir yüzey alanı vardır 7 , daha yüksek hücre dozları gerektiren hastalar için yeterli olmayabilir9,10. Ayrıca, Prodigy ve Quantum kullanımlarını sınırlayan ortak bir özelliğe sahiptir: operasyonel birim hücre genişletme dönemi boyunca tek bir hücre grubu tarafından işgal edilir, böylece her birim11tarafından imal edilebilen toplu iş sayısını sınırlandırır. Otomasyon için modüler yaklaşım ticari üretim süreci 12 simüle birden fazla modüler birimleri ile bir üretim zinciri oluşturmaktır12,13. Kültür cihazını hücre yıkama cihazından ayıran bu yaklaşım, böylece üretim verimliliğini en üst düzeye çıkarabilir. İdeal bir işleme cihazı uyarlanabilir ve üretim ihtiyacı12ölçeklenebilir biri olacaktır.
1970'li yıllara dayanan karşı akış santrifüj (CFC) teknolojisi, hücre işleme de uzun bir geçmişe sahip14. Santrifüj kuvvetini bir karşı akış kuvvetiyle dengeleyerek hücre konsantrasyonu ve ayrıştırma sağlar. Tipik olarak, bir hücre süspansiyonu bir hücre odasının dar ucundan sabit bir akış hızı altında bir santrifüj kuvvete maruz kalırken girer (Şekil 1A). Sıvının akışı santrifüj kuvvetine ters yönde yapılır. Buna, hücre odası içinde bir degrade oluşturan karşı akış kuvveti denir. Hücre odası koni şeklindeki hücre odasının ucundan genişledikçe karşı akış kuvveti azalır. Daha yüksek yoğunluklu ve daha büyük çapı olan hücreler daha yüksek bir sedimantasyon hızına sahiptir ler ve böylece koni şeklindeki hücre odasının ucuna doğru kuvvet dengesine ulaşırlar. Küçük parçacıklar haznetabanına doğru dengeye ulaşabilir veya haznede tutulamayacak kadar küçük olabilir ve yıkanır. CFC teknolojisi çoğunlukla dendritik hücre tedavileri için monosit izole gibi kan aferez ürünleri işleme uygulaması için bilinir15,16. Tampon değişimi açısından, CFC teknolojisi sadece büyük ölçekli üretim17 uygulanmıştır ve otolog hücre tedavileri küçük ölçekli üretim için henüz kullanılmak üzere.
Küçük ölçekli hücre üretimi için uygun bir cihaz ihtiyacını gidermek için, otomatik bir CFC cihazı (Malzemeler Tablosubakınız), son zamanlardageliştirilmiştir 18. Otomatik hücre işleme cihazı hücre enkaz kaldırmak ve tampon değişimi kolaylaştırmak için karşı akış santrifüj teknolojisini kullanır. Cihaz, hücrelerin steril, kapalı bir sistem içinde işlenmesini sağlayan hücre aktarım torbasına steril bağlanabilen tek kullanımlık bir kit ile tampon değişimi gerçekleştirir. Burada, otomatik protokollerde memeli hücre kültürlerinde tampon değişimi gerçekleştirmek için bir karşı akım santrifüj cihazının kullanımını araştırıyoruz. Bu çalışmada, nonadherent ve yapışık hücre tiplerini modellemek için Jurkat hücreleri ve mezenkimal stromal hücreleri (MSCs) kullanarak tampon değişim protokolünü test ettik. Jurkat hücreleri genellikle akut T hücreli lösemi19,20çalışma için kullanılan T hücreleri ölümsüzleştirilmiş vardır. MSC'ler, çok çeşitli hastalıklar için insan klinik çalışmalarında çalışılan yetişkin kök hücrelerdir9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Tampon değişimi için reaktiflerin ve hücrelerin hazırlanması
- Sınıf 2 laminar akış başlığında arabellekleri hazırlayın (Bkz. Malzeme Tablosu). Şırınga ve iğne tertibatı kullanarak, 500 mL tuzlu torbadan 50 mL tuzlu çözelti çıkarın. Bunu %20 insan serum albumininin (HSA) 50 mL'si ile değiştirin ve %2 hsa'yı tuzlu da yapın ve bu da yıkama tamponu görevi göreceksiniz.
- Hücreleri kültür damarlarından çıkarın ve trypan mavisi hariç tutularak başlangıç hücre miktarını ve canlılığını belirlemek için bir hücre sayısı gerçekleştirin. Hücreleri bir aktarım torbasına yükleyin.
NOT: Bu protokolde Jurkat hücreleri RPMI'de kültürlenmiş ve MsC'ler DMEM:F12'de kültürlendi. Her iki ortam da %10 fetal sığır serumu (FBS) ve %1 Antibiyotik-Antimikotik solüsyon ile desteklendi. Hücreler 37 °C'de %5 CO2ile kültürlendi. MSC'ler veya yapışık hücreler için, hücreleri ayırmak için kültür damarlarına bir sindirim enzimi (örneğin, tripsin) ekleyin ve hücreler ayrıldıktan sonra kültür ortamıyla söndürün. Bu protokolde bir transfer çantası kullanılmıştır çünkü hücreler kültür kaplarında genişletilmişti. Ancak, hücreler bir hücre kültür çantası kültürlü ise, doğrudan steril tüp kaynak yoluyla tek kullanımlık kiti bağlı olabilir. Bu protokolde, her çalışma için 3 x 107 Jurkat hücresi veya 1 x 107 MSC kullanılmıştır ve burada hücreler 40 mL kültür medyasında askıya alınmıştır.- Transfer torbasını tek kullanımlık işleme kitine bağlamak için steril bir tüp kaynakçısı varsa, hücreleri bir şırınga ve iğne terletmesi kullanarak bir transfer çantasına yükleyin (bkz.
- Alternatif olarak, transfer çantasına bağlı yaklaşık 10 cm kalan bağlantı tüpünü kesmek ve tüpün ucuna bir dişi Luer konektörü eklemek için bir çift otoklav makas kullanın. Hücreleri ve medyayı aspire etmek için bir şırınga kullanın, ardından şırıngayı Luer konektörüne bağlayın ve hücreleri transfer çantasına yükleyin.
- Hücreleri içeren torbayı bağlayın, adım 1.1'de hazırlanan 500 mL yıkama tamponu içeren tampon torbayı yıkayın, atık torbayı ve şırıngayı tek kullanımlık kitte toplayın(Şekil 1B).
NOT: Her çantanın bağlanma konumu programdaki ayarlara bağlıdır. Bu protokolde, atık torbayı A pozisyonunda, B pozisyonunda ki tamponu yıkayın, Hücre torbasını D ve F pozisyonlarında ve toplama şırıngasını H pozisyonunda(Şekil 1C)bağladık.
2. Otomatik arabellek değişim protokolü için program
- Aygıtın Grafik Kullanıcı Arabirimini (GUI) açın ve dizüstü bilgisayar veya tabletteki "START" düğmesine basın. Daha sonra "Open" varolan bir protokol veya yeni bir protokol oluşturmak için "Yeni" tuşuna basın.
- Her adımda gezinmek için "İleri" ve "Geri" düğmesini kullanın, açılacak/kapatılan vanaları, santrifüj hızını, pompa hızını, pompa yönünü ve eylem tetikleyicilerini seçin. Her adımın ayarları Tablo 1'deözetlenmiştir. O zaman protokolü kaydet.
3. Makinenin kurulumu
- Tek kullanımlık işleme kitini makineye yerleştirin ve bağlı çantaları buna göre asın. Tüm vanaları varsayılan kapalı konuma sıfırlamak için kırmızı "Dur/Sıfırla" düğmesine basın.
NOT: Kitin doğru yerleştirildiğinden ve tüm vanaların uygun şekilde çalıştığından emin olmak için kapı kapatıldığında makine bir test gerçekleştirecektir. - GUI'yi işleme cihazına bağlayın ve "Bağlan" düğmesine basın. Sonra kaydedilen programı indirin. Yeşil "Oynat" düğmesi yandığında, protokolün başlamaya hazır olduğunu gösterir.
- Transfer çantası borusu için manuel kelepçeleri açın.
NOT: Operatör kelepçeleri açmayı unutursa, cihaz durur ve basınç sensörü uyarısı görünür. Cihazı sıfırlamak ve kelepçeleri açmak için "Durdur" düğmesine basın ve yeniden başlamak için kelepçeleri açın.
4. Otomatik tampon değişimi
- Arabellek değişim programını başlatmak için "Başlat" tuşuna basın.
NOT: Otomatik işlemi el ile değiştirmek için " Tetik " düğmesine ulaşmadanönce bir sonraki adıma geçmek için "Next" düğmesine basın veya işlemi beklemeye almak için "Duraklat" tuşuna basın. Bu sadece J ve K vanaları açık tutarken kit aracılığıyla hücreleri yeniden sirküle edecek(Şekil 1C). - Otomasyon adım 6(Tablo 1)sonunda, şimdi boşaltılan torbadaki hava kabarcık sensörünü tetiklediğinde işlem duraklatılır. Çanta gerçekten boşsa işlemi bir sonraki adıma taşımak için "Next" tuşuna basın veya sensör satırdaki bir kabarcık tarafından tetiklenmişse işleme devam etmek için "Duraklat" tuşuna basın.
5. Hücrelerin toplanması ve örneklemi
- Otomatik işlem tamamlandığında, tüm boru kelepçelerini kapatın. Kapıyı açın ve tek kullanımlık kiti cihazdan alın. Sonraki işlemler için hücreleri toplamak için şırınga nın bağlantısını kesin. Hücre sayımı ve canlılık kontrolü için toplanan hücrelerin bir örneğini alın (bkz. adım 6.2).
6. İşlem doğrulaması
- El ile arabellek değiştirme protokolünü kullanarak denetim denemeleri gerçekleştirin.
- 5 dk. 200 x g santrifüj hücre süspansiyonu supernatant atın ve hücre yıkama tampon 30 mL ile hücreleri yeniden askıya. 5 dk. 200 x g'da tekrar hücre süspansiyonuna santrifüj edin.
- Otomatik bir hücre sayacı kullanarak hücre canlılığını değerlendirmek için trypan mavi dışlama tayini ile hücre sayımı gerçekleştirin.
- Hücre çoğalmasını 2, 24 ve 48 saat olarak ölçmek için bir MTS testi gerçekleştirin.
NOT: MTS titreci, üreticinin talimatlarına göre 96 kuyu doku kültür plakası üzerinde gerçekleştirilmiştir. Tampon değişim sürecinden sonra hücre kültürü medyasından (10.000 Jurkat hücresi veya 1.500'ü içeren) 100 μL aliquot'u kaplandı. Her zaman noktasında, her kuyuya 20°L MTS reaktif ilerler ve 37 °C'de 2 saat kuluçkaya yatırıldı. Absorbans bir plaka okuyucu kullanılarak 490 nm olarak değerlendirildi. - Otomatik işlemin manuel işlemle Jurkat hücreleri ve MSC işlevi üzerindeki etkisini karşılaştırmak için işlevsel tahliller yapın.
- DMEM:F12 media'da 50 ng/mL phorbol 12-myristate 13-myristate 13-asetat (PMA) ve 1 μg/mL iyomisin (hücre stimülasyon kokteyli) ile uyarılmış 1 x 106 hücre/mL yoğunlukta 96 kuyuluk bir plakada Kültür Jurkat hücreleri 24 saat için %10 fetal sığır serumu (FBS) içeren. Hücreleri %5 CO2ile 37 °C'de kuluçkaya yatırın.
- Üreticinin talimatlarına göre boncuk bazlı ELISA testini (Bkz. Malzeme Tablosu)kullanarak kültür supernatant'tan interlökin-2 üretimini ölçün.
- DMEM:F12 ortamının 1 mL'de 10.000 hücre/cm 2 yoğunluğunda 12 kuyu plakasında ki Kültür MSC'leri, 48 saat için interferon-γ 50 birim/mL ile desteklenmiş 10 adet fbs içeren ortam. İndoleamin 2,3-dioksijenase (IDO) enzim aktivitesini ölçmek için daha önce21msc'lerin enzim aktivitesini ölçmek için süpernatant toplayın .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu protokolde, otomatik arabellek değişim sürecini göstermek için Jurkat hücreleri ve MSC'leri temsili örnekler olarak kullandık. İşlem sırasında Jurkat hücreleri ve MSC'ler aynı işlem adımlarını, akış hızını kontrol eden santrifüj kuvvet ve pompa hızı farklılıkları ile paylaşmış(Tablo 1). Şekil 2, tampon değişim işlemi sırasında akışkan hücre yatağının nasıl görünebileceğine kamera tarafından çekilen temsili görüntüleri gösterir. Tipik olarak, akışkan hücre yatağı Şekil 2A'dakigörüntüye benzeyecektir, burada hücreler odanın ucunda küçük bir boşluk la birlikte koninin ortasında ve ön cephesinde birikir, burada hücreler birikmez ve hücre yükleme girişinin açılması görünür. Akışkan hücre yatağı, farklı bir viskozite veya yoğunlukta yeni tampon tanıtılırken sıkıştırılabilir(Şekil 2B). Bu protokolde pompa hızı yıkama basamanın başında 30-35 mL/dk'dan 20 mL/dk'ya düşürüldü. Oda yeni tamponla doldurulduktan sonra, pompa hızı, odanın ucundaki hücre yiylemesini önlemek için normale döndürüldü. Ölü hücreler daha küçük ve daha hafif olduğundan ve akış hızını artırarak haznedışına zorlanabildiği için canlı hücreler için yüksek akış hızı(Şekil 2C)uygulanabilir.
Tampon değişimi otomatik süreci ilk hücreleri konsantre, daha sonra yıkama tampon, akışkan hücre yatağıhacminin yaklaşık 10x tanıtıldı elde edildi. Hücreler daha sonra istenilen hacimde formüle edildi. Bu üç işleme adımı, el ile arabellek değişimiyle aynı ilkeleri izleyecek şekilde tasarlanmıştır. Tipik olarak, iki döngülü santrifüj (200 x g, 5 dk) hangi hücrelerin konsantre peletli, yıkama küçülme, sonra tekrar santrifüj ve son hacmine resuspended manuel tampon değişimi gerçekleştirmek için kullanılır. Otomatik leştirilmiş işlemlerin işlem süresi manuel işlemlere göre daha kısaydı(Şekil 3). Manuel ve otomatik işlemler arasındaki iyileşme hızı hem Jurkat hücreleri hem de MSC'ler için benzerdi ve hücre canlılığı işlemden etkilenmedi(Şekil 4). Hücre kalitesi hücre proliferasyonu (MTS tsay) ve sitokin/enzim üretimi ile doğrulandı. Kurtarılan hücreler manuel ve otomatik süreçler arasında benzer çoğalma oranları gösterdi(Şekil 5A). Jurkat hücrelerinden interlökin-2 üretim düzeyi ve MSC'lerin İDO aktivitesi de iki grup arasında karşılaştırılabilir(Şekil 5B ve 5C).
| Adım Numarası | Açıklama | Açık vanalar | Santrifüj hızı (g) | Pompa hızı (ml/dk) | Tetikleyiciler | |
| 1 | B'den A'ya asal boru | A, B, K | 10 | 50 | Hacim: 45 ml | |
| 2 | Kabarcık Kapanı A'dan B'ye Doldurun | A, B, K | 100 | 50 (ters) | Hacim: 10 ml | |
| 3 | A'dan D'ye asal boru | A, D, K | 100 | 50 (ters) | Hacim: 2 ml | |
| 4 | Asal tüp J'den K'ya | J, K | 100 | 50 | Hacim: 3 ml | |
| 5 | Yük hücreleri – ilk başlangıç D'den G'ye | D, K, G | 1600 (Jurkat) 1500 (MSCs) | 25 (Jurkat) 30 (MSCs) | Hacim: 100 ml | |
| 6 | Kabarcıklı yük hücreleri algılar [Kabarcık/ boş tüpün algılanmasında, program duraklar ve operatörün komutunu bekler, 'duraklat' veya 'sonraki' tuşuna basacaktır] | A, D, K | = son adım | 30 (Jurkat) 35 (MSCs) | Kabarcık sensörü D | |
| 7 | D bağlantı noktası tüpünde boş kalan ortam | A, D, K | = son adım | = son adım | Hacim: 1.5 ml | |
| 8 | Hücreleri yıkama 1 | A, B, K | = son adım | 20 | Hacim: 20 ml | |
| 9 | Yıkama hızını artırma | A, B, K | = son adım | 35 | Zamanlayıcı: 5 saniye hız rampası | |
| 10 | Hücreleri Yıka 2 | A, B, K | = son adım | = son adım | Hacim: 20 ml | |
| 11 | Hasat alahazırlanın | J, K | = son adım | = son adım | Zamanlayıcı: 2 saniye | |
| 12 | Hücreleri çıktıya geri kazanım ve hedef hacmine seyreltmek | B, J, K | = son adım | 60 (Ters) | Hacim: 10 ml | |
| Not: '= son adım' GUI'de hız ve pompa hızını santrifüj etmek için bir ayar seçeneğidir. | ||||||
Tablo 1: Jurkat hücreleri ve MSC'ler için otomatik arabellek değişimi GUI kurulumu.
Şekil 1: Karşı akım santrifüj hücre işleme sistemi. (A) Karşı akım santrifüj ilkesini gösteren şematik bir diyagram. Karşı akım kuvveti hücre odası içinde bir degrade de bulunur. Santrifüj (gri ok) iken, daha büyük çaplara sahip hücreler daha yüksek bir sedimantasyon kuvveti alırlar, bu da hücrelerin odanın dar ucuna doğru kuvvet dengesine ulaşarak akışkan bir hücre yatağı oluştururlar. Hücre enkazı ve odada kalamaz kadar küçük olan küçük parçacıklar yıkanır. (B) Karşı akım santrifüj işleme sistemi işleme cihazı ve tek kullanımlık işleme kitinden oluşur. (C) Arabellek değişim protokolü için tek kullanımlık kit yapılandırması. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Hücre odasında akışkan hücre yatağı. (A) orta, (B) düşük ve (C) yüksek akış hızı altında akışkan bir hücre yatağı temsil görüntüler. Noktalı çizgi oda içinde akışkan hücre yatağının alanını gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Jurkat hücrelerinin ve MSC'lerin hücre işleme süresinin manuel ve otomatik işleme ile karşılaştırılması. (n = 3-4 her grupta, veriler ortalama ± SD olarak sunulur). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Jurkat hücreleri ve MSC'lerin hücre canlılığı ve canlı hücre geri kazanımının manuel ve otomatik işleme ile karşılaştırılması. Hücre canlılığı(A) ve canlı hücre kurtarma(B)otomatik bir hücre sayacı kullanılarak trypan mavi dışlama tayı ile ölçüldü. Canlı hücre iyileşmesi serum yokluğunda veya sadece 3 x 106 veya 1 x 106 hücre işlendiğinde azaltıldı. (n = 4-9 her grupta, veriler ortalama ± SD olarak sunulur). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Manuel ve otomatik işleme hücre çoğalması ve hücre fonksiyonu. (A) Jurkat hücreleri ve MSCs MTS tsisken 2, 24 ve 48 h tampon değişimi sonra yapıldı. Kurtarılan hücrelerin kalitesi Jurkat hücrelerinden Interlökin-2 üretimi ile ölçüldü(B), ve MSC'lerde İDO aktivitesi(C). (n = 4-8 her grupta, veriler ortalama ± SD olarak sunulur). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: Çeşitli akış hızında akışkan hücre yatağı stabilitesi. Her hücre türü için iki işlem gerçekleştirildi. Bir işlemde, ya 3 x 107 Jurkat hücreleri veya 1 x 107 MSCs. İkinci işlemde, hücre sayısı 10x kullanılmıştır. Her iki işlemde de, bu protokolde belirtilen santrifüj hızı kullanılarak A limanından 10 mL hücre elutriatı çeşitli akış hızlarında toplanmıştır (Jurkat hücreleri için 1.600 x g ve MSC'ler için 1.500 x g). Elutriate hücre sayısı belirlendi ve odaya yüklenen hücrelerin toplam miktarının yüzdesi olarak sunuldu. (n = 3 her grup için, veriler ortalama ± SD olarak sunulur). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Açıklanan otomatik arabellek değiştirme protokolü basit ve kullanıcı dostudur. Yine de, bu protokolde kritik ve özellikle dikkat gerektiren birkaç önemli adım vardır. Deneyimlerimize göre, MSC'ler (ortalama çap 10-15 μm) gibi daha büyük hücreleri işlerken her çalışmada en az 1 x 107 hücre içermelidir(Şekil 4B). Jurkat hücreleri (ortalama ~10 μm çap) gibi daha küçük hücrelerin işlenmesi, kararlı bir akışkan hücre yatağı elde etmek için yaklaşık 3 x 107 hücre gerektirir(Şekil 4B). Hücre sayısı çok düşük olduğunda, hücrelerin akışkan yataktan çıkarılma olasılığı daha yüksektir, bu da son hücre iyileşmesini etkiler. Ayrıca, sabit bir santrifüj hızı uygulandığında farklı pompa hızlarında hücre kaybı oranlarını karşılaştırdık. Burada, akışkan yatağın daha yüksek akış hızında ki kararsızlığının artmasına bağlı olarak, hücre kaybının akış hızı(Şekil 6)ile arttığını gözlemledik. Ancak, hücre kaybı yüzdesi 10x hücre sayısı odasına yüklendiğinde daha düşüktü, bu da daha yüksek sayıda hücrenin daha hızlı işlenmesine izin verirken daha yüksek bir pompa hızının uygulanabileceğini düşündürmektedir. Sürecin 5. Hücre konsantrasyonu düşükse (örn. 0,2 x 106/mL'nin altında), akışkan hücre yatağını oluşturacak kadar hücre yemesine izin vermek için sirkülasyon adımının uzatılması gerekebilir. Aynı şekilde, hücre konsantrasyonu yüksekise, sirkülasyon adımı kısaltılabilir.
Yıkama tamponserum varlığı da hücre kurtarma için önemlidir. Önceki çalışmalar hidrodinamik stres tamponlama proteinlerin yokluğunda nekrotik hücre ölümüne neden olabileceğini göstermiştir22,23. Karşı akım santrifüj sisteminin akış dinamiği oldukça karmaşıktır. Bu protokolde serum yokluğunda işlem yapıldığında hücre iyileşme oranları %70 civarına düşmüştür (Şekil 4B). Mekanizması tam olarak bilinmemekle birlikte, kültür medyasında serum veya yıkama tamponlarında albumin bulunması hücrelerdeki potansiyel mekanik hasarı azaltmayı başardı. Serumsuz tamponlar gerektiren uygulamalar için, hidroksitil nişasta ve dextran 40 genellikle hidrodinamik strese karşı korumak için hücre üretiminde kullanılan olmayan protein katkı maddeleri örnekleridir24,25.
Karşı akım santrifüj teknolojisi büyük ölçekli biyofarmasötik üretim ve kan ürün işleme17kullanılmıştır. CFC teknolojisinin küçük ölçekli hücre üretimindeki uygulamaları (yani, 0.1-10 L) genellikle elutra (Terumo BCT)26gibi aferez ürünlerinden mononükleer hücrelerin izole etmesiyle sınırlıdır ve yıkama ve konsantre adımlar gerçekleştirmek için ek manuel müdahale gereklidir. Diğer küçük ölçekli hücre işleme platformları arasında LOVO (Fresenius Kabi)27 gibi membran filtrasyon tabanlı tampon değişim sistemleri ve Sepax (GE Healthcare)28gibi dikey santrifüj ayırma bulunmaktadır. Cihazlar arasında doğrudan bir karşılaştırma yapmak zor olsa da, bu karşı akım santrifüj cihazın avantajlarından biri, şu anda mevcut hücre işleme platformları arasında en küçük olan çok küçük çıkış hacimleri (minimum 5 mL) sunma kapasitesidir. Küçük çıkış hacmi yerel enjeksiyonlar için hücreleri formüle29 veya yenini30 içininfüzyon gibi uygulamalar için uygundur. Cihaza gömülü kamera aynı zamanda süreç geliştirme aşamasında akışkan hücre yatağının görselleştirilmesini sağlayan benzersiz bir özelliktir.
CFC teknolojisinin sınırlamalarından biri, hücrelerin büyüklüğüne ve yoğunluğuna duyarlı olmasıdır. Farklı bir hücre türü için bir arabellek değişim protokolü kurarken, burada sunulan protokol, kullanıcıların ihtiyaçlarına göre optimize etmeleri için bir kılavuz görevi göstermelidir, ilgi hücrelerinin boyutunu ve hücre süspansiyonlarının yoğunluğunu göz önünde bulundurun. Geçerli protokol 5 L'ye kadar ortam işlemek için kullanılabilir olsa da, işlem süresi önemli ölçüde uzatılır (örn. 1-2 saat). Bu çalışmada, uzun işlem süresinin hücre kalitesi üzerindeki etkisinin incelenmediğini belirtmek gerekir.
Gelecekteki çalışmalar, cihazın maksimum işlem kapasitesini belirlemek için işlem hızı nın ve işlem süresinin hücre fonksiyonu üzerindeki etkisini değerlendirecektir. Ayrıca, gelecekteki çalışmalar da kriyedik sülfoksitin (DMSO) kriyokorunmuş ürünlerden çıkarılması ve ölü hücrelerin seçici olarak çıkarılması gibi diğer uygulamaları inceleyebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
SW, IF ve DJ COO, CTO ve CEO'su Scinogy Pty. Ltd vardır. CFC cihazına erişim de Scinogy tarafından sağlanmıştır.
Acknowledgments
Bu çalışma Viktorya Hükümeti'nin Operasyonel Altyapı Destek Programı ve Ekonomik Kalkınma, İşler, Ulaştırma ve Kaynaklar Bakanlığı tarafından sağlanan Viktorya Hükümeti Teknoloji Fişi tarafından desteklenir. RL Ulusal Sağlık ve Tıbbi Araştırma Konseyi Kariyer Geliştirme Bursu alıcıdır. AL, Avustralya Lisansüstü Ödülü'nü kazanmıştır.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 20 ml Luer lock syringes | BD | 302830 | |
| 20% Human serum albumin (HSA) | CSL Behring | AUST R 46283 | |
| 4-(Dimethylamino)benzaldehyde | Sigma-Aldrich | 156477-25g | |
| 500ml IV saline bag | Fresenius Kabi | K690521 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Thermo Fisher Scientific | 15240112 | |
| Automated cell counter (Countess) | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| Cell counting chamber slides | Thermo Fisher Scientific | C10228 | |
| Cell stimulation cocktail (500x) | Thermo Fisher Scientific | 00-4970-93 | |
| Cell transfer bags | Terumo | T1BBT060CBB | |
| CellTiter AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS) | Promega | G3582 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| DMEM: F12 media | Thermo Fisher Scientific | 11320082 | |
| EnVision plate Reader | Perkin Elmer | N/A | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 10099141 | |
| Human Interleukin 2 (IL2) Kit | Perkin Elmer | Al221C | |
| Luer (female) fittings | CPC | LF41 | |
| PC laptop or PC tablet device | ASUS | N/A | |
| Plate reader (SpectraMax i3) | Molecular Device | N/A | |
| Recombinant Human IFN-γ | PeproTech | 300-02 | |
| Rotea counterflow centrifuge cell processing device | Scinogy | N/A | |
| Rotea single-use processing kit | Scinogy | N/A | |
| RPMI media | Thermo Fisher Scientific | 11875119 | |
| Surgical scissors | ProSciTech | 420SS | |
| Trichloroacetic acide | Sigma-Aldrich | T6399-250g | |
| Trypan Blue stain | Thermo Fisher Scientific | T10282 | |
| Trypsin digestion enzyme (TrypLE Express Enzyme) | Thermo Fisher Scientific | 12604013 |
References
- Lopes, A. G., Sinclair, A., Frohlich, B. Cost Analysis of Cell Therapy Manufacture: Autologous Cell Therapies, Part 1. BioProcess International. 16 (3), (2018).
- Hampson, B., Ceccarelli, J. Factories of the future: Can Patient-Specific Cell Therapies Get There from Here? BioProcess International. 14 (4), (2016).
- Preti, R., Daus, A., Hampson, B., Sumen, C. Mapping success for commercial cell therapy manufacturing. BioProcess International. 13 (9), 33-38 (2015).
- Heathman, T. R., et al. The translation of cell-based therapies: clinical landscape and manufacturing challenges. Regenerative Medicine. 10 (1), 49-64 (2015).
- Lipsitz, Y. Y., et al. A roadmap for cost-of-goods planning to guide economic production of cell therapy products. Cytotherapy. 19 (12), 1383-1391 (2017).
- Lopes, A. G., Sinclair, A., Frohlich, B. Cost Analysis of Cell Therapy Manufacture: Autologous Cell Therapies, Part 2. BioProcess International. 16 (4), 12-19 (2018).
- Hanley, P. J., et al. Efficient manufacturing of therapeutic mesenchymal stromal cells with the use of the Quantum Cell Expansion System. Cytotherapy. 16 (8), 1048-1058 (2014).
- Leong, W., Nakervis, B., Beltzer, J. Automation: what will the cell therapy laboratory of the future look like? Cell Gene Therapy Insights. 4 (9), 679-694 (2018).
- Galipeau, J., Sensebe, L. Mesenchymal Stromal Cells: Clinical Challenges and Therapeutic Opportunities. Cell Stem Cell. 22 (6), 824-833 (2018).
- Salmikangas, P., Kinsella, N., Chamberlain, P. Chimeric Antigen Receptor T-Cells (CAR T-Cells) for Cancer Immunotherapy - Moving Target for Industry? Pharmaceutical Research. 35 (8), 152 (2018).
- James, D. How short-term gain can lead to long-term pain. Cell Gene Therapy Insights. 3 (4), 271-284 (2017).
- Rafiq, Q. A., Thomas, R. J. The evolving role of automation in process development, manufacture of cell, gene-based therapies. Cell Gene Therapy Insights. 2 (4), 473-479 (2016).
- Rafiq, Q. A. Emerging Automated Approaches for Cell and Gene Therapy Manufacture. Cell Gene Therapy Insights. 4 (9), 911-914 (2018).
- Contreras, T. J., Jemionek, J. F., French, J. E., Shields, L. J. Human Granulocyte Isolation by Continuous Flow Centrifugation Leukapheresis and Counterflow Centrifugation Elutriation (CFCL/CCE). Transfusion. 19 (6), 695-703 (1979).
- Berger, T. G., et al. Efficient elutriation of monocytes within a closed system (Elutra™) for clinical-scale generation of dendritic cells. Journal of Immunological Methods. 298 (1), 61-72 (2005).
- Chen, Y., Hoecker, P., Zeng, J., Dettke, M. Combination of Cobe AutoPBSC and Gambro Elutra as a platform for monocyte enrichment in dendritic cell (DC) therapy: Clinical study. Journal of Clinical Apheresis. 23 (5), 157-162 (2008).
- Whitford, W. G. Continuous Processing in Pharmaceutical Manufacturing. Subramanian, G. , (2014).
- Scinogy. SMALL BATCH CELL SEPARATION, WASH & CONCENTRATION. , https://www.scinogy.com/projects (2019).
- Yu, D., et al. Targeting Jurkat T Lymphocyte Leukemia Cells by an Engineered Interferon-Alpha Hybrid Molecule. Cellular Physiology and Biochemistry. 42 (2), 519-529 (2017).
- Moharram, S. A., Shah, K., Kazi, J. U. T cell Acute Lymphoblastic Leukemia Cells Display Activation of Different Survival Pathways. Journal of Cancer. 8 (19), 4124 (2017).
- Ling, W., et al. Mesenchymal stem cells use IDO to regulate immunity in tumor microenvironment. Cancer Research. 74 (5), 1576-1587 (2014).
- Tanzeglock, T., Soos, M., Stephanopoulos, G., Morbidelli, M. Induction of mammalian cell death by simple shear and extensional flows. Biotechnology and Bioengineering. 104 (2), 360-370 (2009).
- Aguado, B. A., Mulyasasmita, W., Su, J., Lampe, K. J., Heilshorn, S. C. Improving viability of stem cells during syringe needle flow through the design of hydrogel cell carriers. Tissue engineering. Part A. 18 (7-8), 806-815 (2012).
- Zhu, F., et al. Hydroxyethyl starch as a substitute for dextran 40 for thawing peripheral blood progenitor cell products. Cytotherapy. 17 (12), 1813-1819 (2015).
- Schwandt, S., Korschgen, L., Peters, S., Kogler, G. Cord blood collection and processing with hydroxyethyl starch or non-hydroxyethyl starch. Cytotherapy. 18 (5), 642-652 (2016).
- Stroncek, D. F., et al. Counter-flow elutriation of clinical peripheral blood mononuclear cell concentrates for the production of dendritic and T cell therapies. Journal of Translational Medicine. 12, 241 (2014).
- Mfarrej, B., et al. Pre-clinical assessment of the Lovo device for dimethyl sulfoxide removal and cell concentration in thawed hematopoietic progenitor cell grafts. Cytotherapy. 19 (12), 1501-1508 (2017).
- Abonnenc, M., Pesse, B., Tissot, J. D., Barelli, S., Lion, N. Automatic washing of thawed haematopoietic progenitor cell grafts: a preclinical evaluation. Vox Sanguinis. 112 (4), 367-378 (2017).
- Panes, J., et al. Expanded allogeneic adipose-derived mesenchymal stem cells (Cx601) for complex perianal fistulas in Crohn's disease: a phase 3 randomised, double-blind controlled trial. Lancet. 388 (10051), 1281-1290 (2016).
- Lim, R., et al. First-In-Human Administration of Allogeneic Amnion Cells in Premature Infants With Bronchopulmonary Dysplasia: A Safety Study. Stem Cells Translational Medicine. 7 (9), 628-635 (2018).
