Summary
자동화는 셀 제조에서 업스케일링 및 비용 관리의 핵심입니다. 이 원고는 소규모 바이오 프로세싱을 위한 완충교환 및 세포 농도 단계를 자동화하기 위한 카운터플로우 원심 세포 처리 장치의 사용을 설명합니다.
Abstract
유전자 및 세포 기반 치료법의 성공적인 상용화에는 비용 효율적이고 확장 가능한 제조 공정이 필요합니다. 버퍼 교환 및 제품 농도는 대부분의 제조 공정에 필수적인 구성 요소입니다. 그러나 제품 개발의 초기 단계에서이러한 단계는 종종 수동으로 수행됩니다. 버퍼 교환을 위한 수동 막다른 원심분리는 노동 집약적이고 비용이 많이 들며 확장이 가능하지 않습니다. 폐쇄된 자동화 시스템은 이러한 까다로운 단계를 효과적으로 제거할 수 있지만 구현이 어려울 수 있습니다. 여기서는 중소 규모 셀 처리에 적합한 새로 개발된 셀 처리 장치를 설명하고 수동 처리와 대규모 자동화 사이의 격차를 해소하는 것을 목표로 합니다. 이 프로토콜은 유속 및 원심분리 속도를 수정하여 다양한 세포 유형 및 프로세스에 쉽게 적용할 수 있습니다. 우리의 프로토콜은 수동 프로세스에 비해 짧은 처리 시간과 높은 세포 복구를 입증했다. 자동화된 공정으로부터 회수된 세포는 또한 그들의 증식속도를 유지했다. 이 장치는 완충물 교환, 세포 제형 및 냉동 보존과 같은 단계를 수용하기 위해 밀폐 된 제조 공정에서 모듈 식 구성 요소로 적용 할 수 있습니다.
Introduction
현대 의학의 풍경은 유전자와 세포 기반 치료 (GCT)의 최근 발전을 통해 빠르게 변화하고있다. 번역 연구에서 가장 빠르게 성장하는 분야 중 하나인 GCT 부문은 독특하고 전례 없는 도전에 직면하고 있습니다. 견고한 임상 결과 외에도 효율적이고 비용 효율적인 제조 공정은 소규모 제조1에서달성하기 어려운 GCT의 상업적 성공에 필수적입니다. 세포의 각 배치가 수백 또는 수천 대신 한 환자에 대한 몇 가지 복용량을 생산할 때 시간, 노동 및 품질 보증의 비용이 확대됩니다. 제조 과정이 항체 및 재조합 단백질의 생산에 더 가깝다는 동종 세포 치료와는 달리, 자가 세포 치료는 일반적으로 소규모 수술1로생산된다. 바이오 의약품 제조2에서비교적 새로운 현상으로, 소규모 전지 처리에 대한 옵션은 현재 매우 제한적입니다.
버퍼 교환은 셀 제조에 필수적입니다. 그것은 세포가 배양 배지에서 제거되고 동결 보존 또는 주입을 위해 집중되는 다운스트림 프로세스 의 한개입니다. 현재 소규모 세포 제조는 학술 연구 환경에서와 유사한 프로세스를 적용하는 경우가 많으며 불임 유지를 위해 전문 클린 룸에의존합니다 3. 수동 다운스트림 프로세스는 종종 벤치탑 원심분리기를 사용하여 볼륨 감소 및 버퍼 교환을 위해 펠릿 및 재중단 셀을 사용합니다. 이러한 개방 공정은 비용이 많이 들고 (즉, 노동 및 클린 룸 유지 보수) 및 상업 생산2,3에적합하지 않은 제한된 제조 능력을 가지고있다.
자동화 구현은 제조 효율성을 개선하고 상업적 규모의 생산을 달성하기위한 솔루션으로 제안되었다2. 감마 조사 또는 말단 여과와 같은 생물학적 제제에 사용되는 전통적인 방법을 통해 세포 기반 제품에서는 멸균을 달성할 수 없습니다. 대신, 오염 위험을 줄이기 위해 자동 폐쇄 시스템을 구축하고 운영자는 멸균을 유지하기 위해 클린 룸에 의존4. 또한 공정 자동화는 여러 시스템을 병렬로 실행(확장) 또는 개별 장치의 처리 용량(확장)을 증가시켜 운영자 간의 가변성을 최소화함으로써 확장성 문제를 해결합니다. 또한, 자가 치료의 비용 모델링 분석은 자동화가제조5,6의비용을 줄일 수 있음을 시사한다. 그러나 자동화 된 제조플랫폼이7을 사용한 자가 줄기 세포 임상 시험에서는 비용 이점이 발견되지 않았으며 자동화의 비용 이점은 개별 제조 공정에 따라 달라질 수 있음을 시사합니다.
자동화를 기존 제조 공정에 도입할 수 있는 여러 가지 전략이 있습니다. 이는 완전히 통합된 플랫폼 또는 모듈식 기반 처리 체인을 구현하여 달성할 수 있습니다. CliniMACS 프로디지(밀텐이 바이오텍), 코쿤(옥탄 생명공학), 퀀텀(테루모 BCT)과 같은 자가 세포 제조에 상용화된 여러 완전히 통합된 플랫폼이 있습니다. "GMP-in-a-box"라고도 하는 이러한 통합 플랫폼은 인프라에 대한 요구가 적고 운영이 용이합니다. 그러나, 완전히 통합된 설치의 제조 능력은 시스템에 부착된 인큐베이터에 의해 제한될 수 있다. 예를 들어, 신동체의 배양 능력은 400 mL 챔버8로 제한되고 양자 카트리지는 2.1m2(120 T175 플라스크에 해당)로 설정된 제한표면적을 가지며, 이는 더 높은 세포 용량을 필요로 하는 환자에게 는9,10. 추가적으로, 신동 및 양자는 그들의 사용을 제한하는 공통 특성을 갖는다: 작동 단위는 세포 확장 기간 내내 세포의 단일 배치에 의해 점유되고, 따라서 각단위(11)에의해 제조될 수 있는 배치의 수를 제한한다. 자동화에 대한 모듈식 접근 방식은 상용 제조 공정12,13을시뮬레이션하는 여러 모듈형 단위로 제조 체인을 만드는 것입니다. 이러한 접근법은 배양 장치를 셀 세척 장치로부터 분리하여, 제조 효율을 극대화할 수 있다. 이상적인 가공 장치는12의제조 요구에 적응하고 확장 할 수있는 장치일 것입니다.
1970년대로 거슬러 올라가는 카운터플로우 원심분리(CFC) 기술은 세포 처리14에서오랜 역사를 가지고 있습니다. 원심력과 역류력의 균형을 맞추어 세포 농도와 분리를 달성합니다. 전형적으로, 세포 현탁액은 원심력을 행하면서 일정한 유량 하에서 셀 챔버의 좁은 말단으로부터 유입된다(도1A). 유체의 흐름은 원심력과 반대 방향으로 가해집니다. 이를 반류력이라고 하며, 이는 세포 챔버 내에서 그라데이션을 형성한다. 그런 다음 세포 챔버가 원뿔 모양 의 셀 챔버의 끝에서 멀리 넓어짐에 따라 카운터플로우력이 감소합니다. 밀도가 높고 직경이 큰 세포는 침전 속도가 더 높으며, 따라서 원뿔 모양의 세포 챔버의 끝을 향해 힘 평형에 도달합니다. 더 작은 입자는 챔버의 기지를 향해 평형에 도달하거나 챔버에 유지되기에는 너무 작을 수 있으며 멀리 씻겨질 것입니다. CFC 기술은 수지상 세포 치료법15,16에대한 단핵구를 분리하는 것과 같은 혈액 apheresis 제품 처리에 주로 응용되는 것으로 알려져 있다. 완충교환의 관점에서, CFC 기술은 대규모 제조17에만 적용되었으며, 자가 세포 치료의 소규모 제조에 아직 사용되지 않았습니다.
소규모 셀 제조에 적합한 장치의 필요성을 해결하기 위해 자동화된 CFC 장치(재료 표참조)가 최근18개개발되었습니다. 자동화된 셀 처리 장치는 역류 원심분리 기술을 사용하여 세포 이물질을 제거하고 버퍼 교환을 용이하게 합니다. 이 장치는 세포 전달 백에 멸균될 수 있는 일회용 키트로 버퍼 교환을 수행하여 세포를 멸균된 밀폐된 시스템 내에서 처리할 수 있습니다. 여기서, 우리는 자동화된 프로토콜에서 포유류 세포 배양물에서 완충교환을 수행하기 위해 역류 원심 장치의 사용을 조사한다. 이 연구에서는, 우리는 각각 비부착 및 부착 세포 모형을 모델링하기 위하여 Jurkat 세포 및 중간엽 기질 세포 (중간엽 기질 세포)를 사용하여 완충교환 프로토콜을 시험했습니다. Jurkat 세포는 급성 T 세포 백혈병19,20의연구에 자주 사용되는 불멸의 T 세포이다. 중msC는 광범위한 질병에 대한 인체 임상 시험에서 연구된 성인용줄기세포9.
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Protocol
1. 버퍼 교환을위한 시약 및 셀 의 준비
- 클래스 2 층류 흐름 후드에서 버퍼 준비(재료 표참조). 주사기와 바늘 조립체를 사용하여 500 mL 식염수 백에서 식염수 50mL를 제거합니다. 이를 50 mL의 20% 인간 혈청 알부민(HSA)으로 대체하여 식염수로 2% HSA를 만들어 세척 완충제 역할을 합니다.
- 배양 혈관으로부터 세포를 제거하고 세포 수를 수행하여 트라이판 블루 배제에 의한 시작 세포 수량 및 생존 가능성을 결정한다. 셀을 전사 백에 로드합니다.
참고: 이 프로토콜에서 Jurkat 세포는 RPMI에서 배양되었고, MC는 DMEM:F12에서 배양되었다. 두 매체 모두 10% 태아 소 혈청(FBS)과 1% 항생제 항균제를 보충하였다. 세포는 37°C에서 5%CO2로배양하였다. 중간 나무 또는 부착 세포의 경우, 세포를 분리하기 위해 배양 용기에 소화 효소 (예를 들어, 트립신)를 추가하고 세포가 분리되면 배양 배지로 담금질하십시오. 세포가 배양 혈관에서 확장되었기 때문에 전사 백이 이 프로토콜에서 사용되었다. 그러나, 세포가 세포 배양 백에서 배양되는 경우, 멸균 튜브 용접을 통해 일회용 키트에 직접 연결될 수 있다. 이 프로토콜에서, 3 x 107 Jurkat 세포 또는 1 x 107 MBC는 각 실행에 사용되었고, 여기서 세포는 배양 배지의 40 mL에서 중단되었다.- 멸균 튜브 용접기를 사용하여 전사 백을 일회용 처리 키트에 연결할 수 있는 경우 이송 백(재료 표참조)에 로드 셀을 넣습니다.
- 또는, 한 쌍의 오토클레이브 가위를 사용하여 연결 튜브를 약 10cm 가이면 이송 백에 부착하고 튜브 끝에 암컷 루어 커넥터를 추가합니다. 주사기를 사용하여 셀과 매체를 흡인한 다음 주사기를 Luer 커넥터에 연결하고 로드 셀을 전사 백에 연결합니다.
- 세포를 함유하는 봉투를 연결하고, 1.1단계에서 제조된 500 mL의 세척 완충액을 함유하는 워시 버퍼 백을, 폐백, 및 주사기를 1회사용 키트에 수집한다(도1B).
참고: 각 가방의 연결 위치는 프로그램의 설정에 따라 다릅니다. 이 프로토콜에서는 폐기물 백을 위치 A에서, B 위치에서 세척 버퍼, 위치 D 및 F의 셀 백, 위치 H에서의 수집 주사기를 연결했습니다(도1C).
2. 자동화된 버퍼 교환 프로토콜 프로그램
- 장치의 그래픽 사용자 인터페이스(GUI)를 열고 랩톱 PC 또는 태블릿에서"START"버튼을 누릅니다. 그런 다음 " 기존 프로토콜을열거나"New" 를 눌러 새 프로토콜을 만듭니다.
- "앞으로"및"뒤로"버튼을 사용하여 각 단계를 탐색하고, 열릴 밸브, 원심 속도, 펌프 속도, 펌프 방향 및 동작 트리거를 선택합니다. 각 단계에 대한 설정은 표 1에요약되어 있습니다. 그런 다음 프로토콜을 저장합니다.
3. 기기 설정
- 일회용 가공 키트를 기계에 놓고 연결된 가방을 그에 따라 걸어 두세요. 빨간색"정지/재설정"버튼을 눌러 모든 밸브를 기본 닫힌 위치로 재설정합니다.
참고: 도어가 닫히면 장비가 올바르게 배치되고 모든 밸브가 적절하게 작동하는지 확인하기 위해 기계가 테스트를 수행합니다. - GUI를 처리 장치에 연결하고"연결"버튼을 누릅니다. 그런 다음 저장된 프로그램을 다운로드합니다. 녹색 "재생" 버튼이 켜지면 프로토콜을 시작할 준비가 된 것을 나타냅니다.
- 전사 백 튜브의 수동 클램프를 엽니다.
참고: 운전자가 클램프를 여는 것을 잊어버리면 장치가 멈추고 압력 센서 경고가 나타납니다. "중지"버튼을 눌러 장치를 재설정하고 클램프를 열어 다시 시작합니다.
4. 자동 버퍼 교환
- 버퍼 교환 프로그램을 시작하려면 "시작을시작합니다.
참고: 자동화된 프로세스를 수동으로 변경하려면"다음"버튼을 눌러 다음 단계로 이동한 후"트리거"또는"일시 중지"를눌러 프로세스를 보류합니다. 이렇게 하면 키트를 통해 세포를 재순환시키고 밸브 J와 K만 열어 두게됩니다(그림 1C). - 자동화 단계 6(표1)의끝에서, 이제 비워진 백의 공기가 버블 센서를 트리거하면 프로세스가 일시 중지됩니다. 가방이실제로 비어있는 경우 다음 단계로 프로세스를 이동하려면 다음 " 를 누르거나"일시 중지"를눌러 센서가 라인의 거품에 의해 트리거된 경우 처리를 다시 시작합니다.
5. 세포 수집 및 샘플링
- 자동화 된 프로세스가 완료되면 모든 튜브 클램프를 닫습니다. 도어를 열고 일회용 키트를 장치에서 꺼내십시오. 주사기를 분리하여 후속 프로세스에 대한 셀을 수집합니다. 세포 수 및 생존 가능성 검사를 위해 수집된 셀의 샘플을 취합니다(단계 6.2 참조).
6. 프로세스 검증
- 수동 버퍼 교환 프로토콜을 사용하여 제어 실험을 수행합니다.
- 원심분리기 세포 현탁액을 200 x g에서 5 분 동안. 상판액을 버리고 30 mL의 세포 세척 버퍼로 세포를 다시 중단하십시오. 세포 현탁액을 200 x g에서 5 분 동안 다시 원심 분리. 상급제를 버리고 10 mL의 세포 세척 버퍼로 세포를 다시 중단시다.
- trypan 청색 배제 분석기를 통해 세포 카운팅을 수행하여 자동화된 세포 카운터를 사용하여 세포 생존 가능성을 평가합니다.
- 2, 24 및 48 시간에서 세포 증식을 정량화하기 위해 MTS 분석기를 수행합니다.
참고: MTS 분석기는 제조자의 지시에 따라 96개의 웰 조직 배양 판에서 수행되었다. 100 μL 세포 배양 배지(10,000 Jurkat 세포 또는 1,500를 함유하는)를 완충 교환 과정 후에 도금하였다. 매 시점에서, 20 μL의 MTS 시약이 각 웰에 첨가되고 37°C에서 2시간 동안 배양하였다. 흡광도는 플레이트 리더를 사용하여 490 nm에서 평가되었다. - 기능적 검사를 수행하여 자동화된 프로세스와 Jurkat 세포 및 MSC 기능에 대한 수동 프로세스의 영향을 비교합니다.
- 배양 Jurkat 세포는 DMEM:F12 배지에서 1x106 세포/mL의 밀도로 자극된 50 ng/mL phorbol 12-myristate 13-아세테이트(PMA) 및 1 μg/mL 이오노마이신(cell sinomycin)을 DMEM:F12 배지에서 10% 페탈 소 혈청(20%)을 함유한다. 5%CO2로37 °C에서 세포를 배양합니다.
- 제조사의 지시에 따라 비드 계 ELISA 분석(재료 표참조)을 사용하여 배양 상급에서 인터류핀-2 생산을 측정합니다.
- 12웰 플레이트에서 10,000개의 세포/cm2의 밀도에서 DMEM:F12 배지를 함유하는 10% FBS를 함유하는 10% FBS를 함유하는 48시간 동안 인터페론-γ 50 단위/mL을 함유하고 있다.
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Representative Results
이 프로토콜에서는 Jurkat 셀과 MSC를 대표적인 예로 사용하여 자동화된 버퍼 교환 프로세스를 시연했습니다. 이 과정에서 Jurkat 셀과 MCS는 유속을 제어하는 원심력과 펌프 속도의 차이로 동일한 처리 단계를 공유했습니다(표1). 도 2는 완충교환 과정에서 유동화된 셀 베드가 어떻게 나타날 수 있는지에 대해 카메라에 의해 포착된 대표적인 이미지를 나타낸다. 일반적으로 유동화 된 세포 베드는 세포가챔버 의 끝에 작은 공간으로 원뿔의 중간과 앞쪽으로 축적되는 그림 2A의이미지와 유사하며 세포가 축적되지 않고 셀 로딩 입구의 개구부가 표시됩니다. 유동화된 셀 베드는 상이한 점도 또는 밀도에 있는 새로운 완충액을 도입할 때 압축될 수있다(도 2B). 이 프로토콜에서는 세척 단계를 시작할 때 펌프 속도를 30-35mL/min에서 20mL/min으로 낮췄습니다. 챔버가 새로운 완충제으로 채워지면, 펌프 속도는 챔버의 끝에서 펠릿 세포를 방지하기 위해 정상으로 복귀하였다. 높은 유량(도2C)은죽은 세포가 작고 가볍고 유량을 증가시킴으로써 챔버 밖으로 강제 유출될 수 있기 때문에 살아있는 세포에 대해 선택에 적용될 수 있다.
완충교환의 자동화된 과정은 먼저 세포를 집중시킨 다음 유동화된 세포 층의 부피의 약 10배인 세척 버퍼를 도입함으로써 달성되었습니다. 세포를 원하는 부피로 제형화하였다. 이 세 가지 처리 단계는 수동 버퍼 교환과 동일한 원칙을 따르도록 설계되었습니다. 일반적으로 2 사이클 원심 분리 (200 x g, 5 분)는 세포가 농축하기 위해 펠릿되고 세척하기 위해 다시 중단 된 다음 원심 분리를 다시 하고 최종 부피로 다시 중단되는 수동 버퍼 교환을 수행하는 데 사용됩니다. 자동화된 프로세스의 처리 시간은 수동 처리에 비해 짧습니다(그림3). 수동 및 자동화 된 프로세스 사이의 회수율은 Jurkat 세포와 중간 세포 모두에 대해 유사했으며, 세포 생존율은 프로세스에 의해 영향을받지 않았습니다(그림 4). 세포 품질은 세포 증식(MTS 분석) 및 사이토카인/효소 생산에 의해 확인되었다. 회수된 세포는 매뉴얼과 자동화된 공정 사이에 유사한 증식률을보였다(도 5A). 유르카트 세포로부터의 인터류핀-2 생산 수준과 중간반응의 IDO 활성도 두 그룹 간에 비교되었다(도5B 및 5C).
| 단계 번호 | 설명 | 개방형 밸브 | 원심분리기 속도 (g) | 펌프 속도(ml/분) | 트리거 | |
| 1 | B에서 A로의 프라임 튜빙 | A, B, K | 10 | 50 | 용량: 45 ml | |
| 2 | A에서 B로 버블 트랩 채우기 | A, B, K | 100 | 50(역방향) | 용량: 10 ml | |
| 3 | 프라임 튜빙 A에서 D까지 | A, D, K | 100 | 50(역방향) | 볼륨: 2 ml | |
| 4 | 프라임 튜빙 J - K | J, K | 100 | 50 | 볼륨: 3 ml | |
| 5 | 로드 셀 - 초기 시작 D에서 G까지 | D, K, G | 1600 (유르캇) 1500 (자이C) | 25 (저캇) 30 (중전적 인 자전자 배치) | 용량: 100 ml | |
| 6 | 버블 감지가 있는 로드 셀 [버블/빈 튜브 감지 시, 프로그램은 운영자의 명령을 일시 중지하고 기다렸다가 '일시 중지' 또는 '다음'을 누릅니다.] | A, D, K | = 마지막 단계 | 30 (저캇) 35 (자이C) | 버블 센서 D | |
| 7 | 포트 D 튜브의 빈 나머지 용지 | A, D, K | = 마지막 단계 | = 마지막 단계 | 볼륨: 1.5 ml | |
| 8 | 세척 셀 1 | A, B, K | = 마지막 단계 | 20 | 용량: 20 ml | |
| 9 | 세탁 속도 증가 | A, B, K | = 마지막 단계 | 35 | 타이머: 5초 속도 램핑 | |
| 10 | 세척 셀 2 | A, B, K | = 마지막 단계 | = 마지막 단계 | 용량: 20 ml | |
| 11 | 수확 준비 | J, K | = 마지막 단계 | = 마지막 단계 | 타이머: 2초 | |
| 12 | 셀을 회수하여 출력하고 목표 볼륨으로 희석 | B, J, K | = 마지막 단계 | 60 (역) | 용량: 10 ml | |
| 참고: '= 마지막 단계'는 GUI에서 원심 분리 속도와 펌프 속도를 위한 설정 옵션입니다. | ||||||
표 1: Jurkat 셀 및 MC에 대한 자동 버퍼 교환 GUI 설정.
그림 1: 카운터플로우 원심 세포 처리 시스템. (A)역류 원심분리의 원리를 보여주는 회로도다. 역류력은 셀 챔버 내의 그라데이션에 존재한다. 원심 분리 (회색 화살표)동안, 더 큰 직경을 가진 세포는 세포가 챔버의 좁은 끝을 향해 힘 평형에 도달하는 더 높은 침전력을 수신하여 유동세포 층을 형성합니다. 챔버에 남아 너무 작은 세포 파편과 작은 입자는 멀리 세척됩니다. (B)카운터플로우 원심 처리 시스템은 처리 장치와 일회용 처리 키트로 구성됩니다. (C)버퍼 교환 프로토콜에 대한 일회용 키트 구성입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 세포 챔버내의 유동화 된 세포 층. 유동형 세포 층의 대표적인 이미지(A)배지,(B)낮고,(C)높은 유량. 점선은 챔버 내의 유동화된 셀 베드의 면적을 나타낸다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: Jurkat 셀 및 MC의 셀 처리 시간을 수동 및 자동 처리와 비교합니다. (n = 각 그룹에서 3-4, 데이터는 평균 ± SD로 제시된다). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 수동 및 자동 처리로 Jurkat 세포 및 MFC의 세포 생존 가능성 및 라이브 셀 회수 비교. 세포생존가능성(A)및 라이브 셀회수(B)는자동화된 세포 카운터를 사용하여 트라이판 블루 배제 분석으로 측정하였다. 살아있는 세포 회수는 혈청이 없거나 단지 3 x 106 또는 1 x 106 세포를 처리했을 때 감소되었다. (n = 각 그룹에서 4-9, 데이터는 평균 ± SD로 제시된다). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 수동 및 자동 처리에서 세포 증식 및 셀 기능. (A)유르카트 세포 및 미세포의 MTS 분석은 완충교환 후 2, 24, 및 48시간에서 수행하였다. 회수된 세포의 질은 주르카트 세포(B)로부터의 인터류킨-2생산에 의해 정량화되었고,중간(C)에서의IDO 활성을 정량화하였다. (n = 각 그룹에서 4-8, 데이터는 평균 ± SD로 제시된다). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 6: 다양한 유량에서 유동화된 세포 층 안정성. 각 세포 유형에 대해 2개의 공정을 수행하였습니다. 한 프로세스에서 3 x 107 Jurkat 셀 또는 1 x 107 MC. 두 번째 공정에서는 셀 수를 10배 사용했습니다. 두 공정 에서, 10 mL의 세포 elutriate는 이 프로토콜에 표시된 원심 분리 속도를 사용하여 다양한 유량으로 포트 A로부터 수집되었습니다(Jurkat 세포의 경우 1,600 x g, MCS의 경우 1,500 x g). 용리화액 내의 세포 수를 결정하고 챔버에 적재된 총 세포량의 백분율로 제시하였다. (n = 3 각 그룹에 대해, 데이터는 평균 ± SD로 제시된다). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
설명된 자동화된 버퍼 교환 프로토콜은 간단하고 사용자 친화적입니다. 그럼에도 불구하고 이 프로토콜에는 중요하고 특별한 주의가 필요한 몇 가지 주요 단계가 있습니다. 우리의 경험에서, MCS와 같은 더 큰 세포를 가공할 때 (평균 직경 10-15 μm) 각 실행은 최적 세포 회수를 달성하기 위하여 적어도 1 x 107 셀을 포함해야 합니다(그림 4B). Jurkat 세포 (평균 ~ 10 μm 직경)와 같은 작은 세포를 처리하는 것은 안정적인 유동 세포 베드를 달성하기 위해 약 3 x 107 셀이 필요합니다(그림 4B). 세포 수가 너무 낮으면, 세포는 최종 세포 회복에 영향을 미칠 유동침대에서 제거될 확률이 높습니다. 또한 일정한 원심 속도를 적용할 때 다양한 펌프 속도로 셀 손실률을 비교했습니다. 여기서, 유량(도6)에따라 세포 손실이 증가하는 것을 관찰했는데, 이는 더 높은 유량에서 유동층의 불안정성 증가에 기인한다. 그러나, 셀 손실의 비율은 10배 의 셀 수를 챔버내로 적재했을 때 더 낮았으며, 이는 더 많은 수의 셀을 처리할 때 더 높은 펌프 속도를 적용할 수 있음을 시사한다. 공정의 5단계에서, 100 mL의 배양 배지를 챔버로부터 다시 세포 전달 백으로 재순환하여 유체화된 침대가 부피 감소 및 완충 교환 전에 형성및 안정화될 수 있도록 했다. 세포 농도가 낮은 경우(예를 들어, 0.2 x10 6/mL 이하), 재순환 단계는 유동화된 세포 베드를 형성하기에 충분한 세포를 허용하도록 확장되어야 할 수 있다. 마찬가지로, 세포 농도가 높으면 재순환 단계가 단축될 수 있다.
세척 버퍼에 혈청의 존재는 세포 회복에 매우 중요합니다. 이전 연구는 유체 역학적 스트레스가 완충 단백질22,23의부재에서 괴사 세포 죽음을 일으킬 수 있음을 보여 주었다. 카운터 플로우 원심 시스템의 흐름 역학은 매우 복잡합니다. 이 프로토콜에서, 세포 회수율은 혈청의 부재에서 수행된 과정일 때 약 70%로떨어졌다(도 4B). 정확한 메커니즘은 명확하지 않지만, 세척 완충제에서 배양 배지 또는 알부민에서 혈청의 존재는 세포에 대한 잠재적 기계적 손상을 완화할 수 있었다. 혈청이 없는 완충제를 필요로 하는 적용의 경우, 하이드록스예틸 전분 및 덱스터n 40은 유체역학적 스트레스로부터 보호하기 위해 세포 제조에 자주 사용되는 비단백질 첨가제의 예이다24,25.
반역원심분리 기술은 대규모 바이오의약품 제조 및 혈액제품가공(17)에사용되고 있다. 소규모 전지 제조(즉, 0.1-10L)에서 CFC 기술의 적용은 종종 세척 및 농축 단계를 수행하기 위해 추가적인 수동 개입이 필요한 Elutra(Terumo BCT)26와같은 apheresis 제품으로부터 단핵 세포를 분리하는 것으로 제한됩니다. 다른 소규모 세포 처리 플랫폼은 LOVO(Fresenius Kabi)27과 같은 멤브레인 여과 기반 완충교환 시스템 및 Sepax(GE Healthcare)28와같은 수직 원심분리를 포함한다. 장치 간의 직접 비교는 어렵지만 이 카운터플로우 원심 장치의 장점 중 하나는 현재 사용 가능한 셀 처리 플랫폼 중 가장 작은 매우 작은 출력 볼륨(최소 5mL)을 제공할 수 있는 용량입니다. 작은 출력 부피는 국소 주사(29)를위한 세포 를 공식화하거나 신생아(30)를위한주입과 같은 응용 프로그램에 적합합니다. 장치에 내장된 카메라는 공정 개발 단계에서 유동화된 셀 베드를 시각화하는 독특한 기능입니다.
CFC 기술의 한계 중 하나는 세포의 크기 및 밀도에 민감하다는 것입니다. 다른 세포 유형에 대한 버퍼 교환 프로토콜을 설정할 때 여기에 제시된 프로토콜은 사용자가 관심 있는 셀의 크기와 셀 현탁액의 밀도를 염두에 두고 사용자의 필요에 따라 최적화할 수 있는 지침역할을 해야 합니다. 현재 프로토콜은 최대 5L의 미디어를 처리하는 데 사용할 수 있지만 처리 시간이 상당히 연장됩니다(즉, 1-2시간). 세포 질에 연장된 처리 시간의 충격이 이 현재 연구 결과에서 검토되지 않았다는 것을 주의하는 것이 중요합니다.
향후 연구는 장치의 최대 처리 용량을 결정하기 위해 셀 기능에 대한 처리 속도와 처리 시간의 영향을 평가합니다. 또한, 향후 연구는 저온 보존 제품에서 디메틸 설폭사이드 (DMSO)의 제거 및 죽은 세포의 선택적 제거와 같은 다른 응용 프로그램을 탐구 할 수있다.
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Disclosures
SW, IF, DJ는 COO, CTO, 그리고 Scinogy Pty. Ltd.의 CEO입니다. CFC 장치에 대한 액세스도 Scinogy에 의해 제공되었습니다.
Acknowledgments
이 작업은 빅토리아 정부의 운영 인프라 지원 프로그램과 경제 개발, 일자리, 운송 및 자원부에서 제공하는 빅토리아 정부 기술 바우처에 의해 지원됩니다. RL은 국가 보건 및 의학 연구 위원회 경력 개발 펠로우십의 수혜자입니다. AL은 호주 대학원 상을 받는 사람입니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 20 ml Luer lock syringes | BD | 302830 | |
| 20% Human serum albumin (HSA) | CSL Behring | AUST R 46283 | |
| 4-(Dimethylamino)benzaldehyde | Sigma-Aldrich | 156477-25g | |
| 500ml IV saline bag | Fresenius Kabi | K690521 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Thermo Fisher Scientific | 15240112 | |
| Automated cell counter (Countess) | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| Cell counting chamber slides | Thermo Fisher Scientific | C10228 | |
| Cell stimulation cocktail (500x) | Thermo Fisher Scientific | 00-4970-93 | |
| Cell transfer bags | Terumo | T1BBT060CBB | |
| CellTiter AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS) | Promega | G3582 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| DMEM: F12 media | Thermo Fisher Scientific | 11320082 | |
| EnVision plate Reader | Perkin Elmer | N/A | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 10099141 | |
| Human Interleukin 2 (IL2) Kit | Perkin Elmer | Al221C | |
| Luer (female) fittings | CPC | LF41 | |
| PC laptop or PC tablet device | ASUS | N/A | |
| Plate reader (SpectraMax i3) | Molecular Device | N/A | |
| Recombinant Human IFN-γ | PeproTech | 300-02 | |
| Rotea counterflow centrifuge cell processing device | Scinogy | N/A | |
| Rotea single-use processing kit | Scinogy | N/A | |
| RPMI media | Thermo Fisher Scientific | 11875119 | |
| Surgical scissors | ProSciTech | 420SS | |
| Trichloroacetic acide | Sigma-Aldrich | T6399-250g | |
| Trypan Blue stain | Thermo Fisher Scientific | T10282 | |
| Trypsin digestion enzyme (TrypLE Express Enzyme) | Thermo Fisher Scientific | 12604013 |
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