Summary
אוטומציה היא המפתח לשינוי קנה מידה וניהול עלויות בייצור תאים. כתב יד זה מתאר את השימוש בהתקן זרימת תאים צנטריפוגליים לאוטומציה של החלפת מאגר ושלבי הריכוז של התא לצורך ביוביוטינג בקנה מידה קטן.
Abstract
מסחור מוצלח של גנים וטיפולים מבוססי תאים דורש תהליכי ייצור יעילים ומדרגיים. המרת מאגר וריכוז המוצר הם רכיבים חיוניים עבור רוב תהליכי הייצור. עם זאת, בשלבים המוקדמים של פיתוח המוצר, שלבים אלה מבוצעים לעתים קרובות באופן ידני. צנטריפוגה מבוי סתום ידני עבור חילופי מאגרים היא אינטנסיבית לעבודה, יקרה ולא מדרגית. מערכת אוטומטית סגורה יכולה לבטל ביעילות את שלב העמל הזה, אך ההטמעה יכולה להיות מאתגרת. כאן, אנו מתארים מכשיר חדש לעיבוד תאים מפותח המתאים לעיבוד תאים קטנים עד בינונית בקנה מידה ומטרתו לגשר על הפער בין עיבוד ידני ואוטומציה בקנה מידה גדול. פרוטוקול זה ניתן להחיל בקלות על סוגי תאים שונים ותהליכים על ידי שינוי קצב הזרימה ומהירות צנטריפוגה. הפרוטוקול שלנו הפגין שחזור תאים גבוה עם זמני עיבוד קצרים בהשוואה לתהליך הידני. תאים ששוחזרו מהתהליך האוטומטי שמרו גם על שיעורי ההתפשטות שלהם. ניתן להחיל את ההתקן כרכיב מודולרי בתהליך ייצור סגור כדי להתאים לשלבים כגון חילופי מאגרים, ניסוח תאים והקפאה קריוגנית.
Introduction
הנוף של הרפואה המודרנית השתנה במהירות באמצעות ההתפתחויות האחרונות בגנים ובטיפולים מבוססי תא (GCT). כאחד התחומים הגדלים המהיר ביותר במחקר הטרנסלטיטי, המגזר GCT גם מתמודד עם אתגרים ייחודיים וחסרי תקדים. בנוסף התוצאות הקליניות חזקים, יעיל וחסכוני תהליכי הייצור חיוניים הצלחה מסחרית של GCT, אשר קשה במיוחד להשיג בקנה מידה קטן של ייצור1. עלות הזמן, העבודה, הבטחות איכות מוגדלים כאשר כל קבוצה של תאים מייצרת רק כמה מינונים עבור מטופל אחד במקום מאות או אלפים. בניגוד לטיפולים בתאי האלוגנאית בהם תהליכי הייצור הם יותר דומה לייצור של נוגדנים וחלבונים רקומביננטי, הטיפולים בתאי האוטוולוגי מיוצרים בדרך כלל כפעולות בקנה מידה קטן1. כתופעה חדשה יחסית בייצור ביופרמקולוגיה2, אפשרויות עיבוד תא בקנה מידה קטן מוגבלות כיום.
החלפת מאגר חיונית לייצור תאים. זהו אחד התהליכים במורד הזרם שבו התאים מוסרים ממדיית התרבות ומרוכז עבור קריוגנית או אינפוזיה. כיום, ייצור תאים בקנה מידה קטן מחיל לעתים קרובות תהליכים דומים לאלה בהגדרת המחקר האקדמי ומסתמך על חדרים נקיים מיוחדים כדי לשמור על עקרות3. תהליכי במורד הזרם ידני להשתמש בצנטריפוגות שחקן הראש כדי גלולה להשעות את התאים להפחתת נפח והחלפת מאגר. התהליכים הפתוחים הללו יקרים (כלומר, עבודה ותחזוקה בחדר נקי) ויש להם יכולת ייצור מוגבלת, שאינם אידיאליים לייצור מסחרי2,3.
יישום האוטומציה הוצע כפתרון לשיפור יעילות הייצור והשגת הפקות בקנה מידה מסחרי2. אין אפשרות להשיג עקרות במוצרים מבוססי-תא באמצעות שיטות מסורתיות המשמשות למוצרי ביולוגי, כגון הקרנה גאמה או סינון קצה מסוף. במקום זאת, מערכת סגורה אוטומטית נפרס כדי להפחית את הסיכונים של זיהום ואופרטורים המתבססים על חדרים נקיים כדי לשמור על עקרות4. אוטומציה של תהליך גם מטפלת בנושא המדרגיות על-ידי הפעלת מערכות מרובות הפועלות במקביל (היקף) או הגדלת קיבולת העיבוד של התקן בודד (היקף), אשר בתורו ממזער את השונות בין אופרטורים. יתרה מזאת, ניתוח מודל העלות של טיפולים עצמיים עולה כי אוטומציה עשויה להפחית את העלות של ייצור5,6. עם זאת, אין תועלת בעלות נמצא בתא גזע אוטוולוגי בניסוי קליני שבו פלטפורמת ייצור אוטומטית שימש7, רומז כי העלות היתרון של האוטומציה עשויה להיות תלויה בתהליך הייצור הפרטני.
קיימות אסטרטגיות שונות שבהן ניתן להציג אוטומציה בתהליך ייצור קיים. ניתן להשיג זאת גם על ידי יישום פלטפורמה משולבת מלאה או שרשרת עיבוד מודולרית מודולרי. קיימות מספר פלטפורמות משולבות באופן מלא הזמינות מסחרית עבור ייצור תאים אוטוולוגי, כגון הפלא של הדיג (Miltenyi Biotec), קוקון (ביוטכנולוגיה), ו קוונטום (טרמו BCT). פלטפורמות משולבות אלה, המתוארות לעתים קרובות כ-GMP-in-box, הן בעלי דרישות נמוכות לגבי תשתיות והן קלות לתפעול. עם זאת, יכולת הייצור של התקנה משולבת מלאה עשויה להיות מוגבלת על-ידי החממה המצורפת למערכת. לדוגמה, יכולת ה-culturing של הפרודיג'י מוגבלת לחדר 400 mL שלו8 ולמחסנית הקוונטית יש שטח מוגבל למשטח שהוגדר ל-2.1 m2 (שווה ערך ל 120 T175 מבחנות)7, שייתכן שלא יספיק למטופלים המחייבים מינונים גבוהים יותר של תאים9,10. בנוסף, הפלא והקוונטים יש תכונה נפוצה המגבילה את השימוש בהם: היחידה המבצעית מאוכלס על ידי קבוצה אחת של תאים לאורך תקופת התרחבות התא, ובכך להגביל את מספר הקבוצות שניתן לייצר על ידי כל יחידה11. הגישה המודולארית לאוטומציה היא יצירת שרשרת ייצור עם יחידות מודולריות מרובות המדמה את תהליך הייצור המסחרי12,13. גישה זו, אשר מפרידה את מכשיר התרבות ממכשיר הכביסה התא, יכול ובכך למקסם את יעילות הייצור. התקן עיבוד אידיאלי יהיה אחד כי הוא הסתגלות ומדרגי לייצור צרכים12.
הטכנולוגיה הצנטריפוגה (CFC), שתחילתה בשנות ה-70, היתה היסטוריה ארוכה בעיבוד תאים14. היא משיגה ריכוז והפרדה של תאים על-ידי איזון כוח צנטריפוגלי עם כוח זרימה נגדית. בדרך כלל, השעיית תא נכנס מהקצה הצר של תא התא תחת קצב זרימה קבוע תוך נתון לכוח צנטריפוגלי (איור 1א). זרימת הנוזל מופעל בכיוון ההפוך אל הכוח הצנטריפוגלי. הדבר נקרא כוח הזרימה הנגדית, היוצר מעבר צבע בתוך תא התא. כוח הזרימה הנגדית פוחת כאשר תא התא מתרחב מקצה תא התא המעוצב בצורת חרוט. תאים עם צפיפות גבוהה יותר קוטר גדול יותר יש קצב משקעי גבוה יותר, ולכן הם מגיעים כוח שיווי משקל לכיוון קצה של תא בצורת חרוט. חלקיקים קטנים יותר עלולים להגיע לשיווי האיזון כלפי בסיס החדר, או להיות קטנים מדי כדי להישמר בחדר והוא יישטף. הטכנולוגיה CFC ידועה בעיקר היישום שלה בעיבוד מוצרי apheresis כגון בידוד מונוציטים עבור טיפולים סלולריים הדנדריטים15,16. במונחים של חילופי מאגר, הטכנולוגיה CFC הוחלה רק בייצור בקנה מידה גדול17 ועדיין לשמש לייצור בקנה מידה קטן יותר של טיפולים אוטוולוגיים.
כדי לטפל בצורך בהתקן מתאים לייצור תאים בקנה מידה קטן, התקן CFC אוטומטי (ראה טבלת חומרים), פותח לאחרונה18. מכשיר העיבוד האוטומטי של התא משתמש בטכנולוגיה צנטריפוגה של זרימה נגדית כדי להסיר פסולת תאים ולהקל על החלפת מאגר. המכשיר מבצע חילופי מאגר עם ערכת שימוש יחיד שניתן לתקן באמצעות שקית העברת תאים, דבר המאפשר עיבוד תאים בתוך מערכת סטרילית ותחומה. כאן, אנו חוקרים את השימוש במכשיר מתקן צנטריפוגלי לבצע חילופי מאגרים בתרביות תאים של מיונקים בפרוטוקולים אוטומטיים. במחקר זה, בדקנו את פרוטוקול חילופי מאגר באמצעות תאים ויוקאט ותאי סטרומה mesenchymal (MSCs) כדי לדגמן סוגים שאינם מחסיד ותאי תאים, בהתאמה. התאים של ג'ורקאט הם תאים מונצח לעתים קרובות משמש למחקר של לוקמיה תא T חריפה19,20. MSCs הם תאי גזע למבוגרים אשר נחקרו בניסויים קליניים אנושיים עבור מגוון רחב של מחלות9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת ריאגנטים ותאים להחלפת מאגר
- הכן מאגרים (ראה טבלת חומרים) במכסה זרימה למינארי בדרגה 2. באמצעות מזרק מחט הרכבה, להסיר 50 mL של פתרון מלוחים משקית מלוחים 500 mL. להחליף את זה עם 50 mL של 20% סרום האדם (HSA) לעשות 2% HSA ב מלוחים, אשר ישמש את המאגר לשטוף.
- הסר את התאים מכלי התרבות ובצע ספירת תאים כדי לקבוע את כמות התאים והכדאיות ההתחלתית על-ידי החרגת כחול מטריפי. טען את התאים לשקית העברה.
הערה: בפרוטוקול זה התאים של ג'ורקאט היו מתורבתים ב-RPMI ו-MSCs היו מתורבתים ב-Dמאמ: F12. שני התקשורת התבצעה בתוספת של 10% סרום בפרה עוברית (FBS) ו 1% אנטיביוטי-Antimycotic פתרון. תאים היו מתורבתים ב 37 ° c עם 5% CO2. עבור תאים MSCs או מחסיד, הוסף אנזים עיכול (למשל, טריפסין) לכלי התרבות כדי לנתק את התאים, וכיבוי מדיית התרבות ברגע שהתאים מנותקים. בפרוטוקול זה נעשה שימוש בשקית העברה כי התאים הורחבו בכלי התרבות. עם זאת, אם התאים הם מתורבתים בשקית של תרבות התא, זה יכול להיות מחובר ישירות לקיט לשימוש יחיד באמצעות ריתוך צינור סטרילי. בפרוטוקול זה, או 3 x 107 כיוקט תאים או 1 x 107 MSCs שימשו עבור כל לרוץ, שבו תאים הושעו ב 40 mL של מדיית התרבות.- לטעון תאים לתוך שק העברה (ראה טבלת חומרים) באמצעות מזרק הרכבה מחט אם רתך צינור סטרילי זמין לחבר את שק העברת לערכת עיבוד השימוש היחיד.
- לחלופין, השתמש בזוג מספריים אוטוקלשים כדי לחתוך את הצינור המחבר עם בערך 10 ס מ שנשאר מחובר לשקית העברת ולהוסיף מחבר Luer נקבה לסוף אבובים. השתמש במזרק לניקוי תאים ומדיה, ולאחר מכן חבר את המזרק למחבר Luer וטען תאים לשקית ההעברה.
- לחבר את התיק המכיל את התאים, לשטוף את התיק מאגר המכיל 500 mL של מאגר לשטוף הכין בשלב 1.1, שקית פסולת, ואיסוף מזרק אל הערכה לשימוש יחיד (איור 1B).
הערה: המיקום המחבר של כל תיק תלוי בהגדרות בתוכנית. בפרוטוקול זה, חיברתי את שקית הפסולת בתנוחה א', שטוף מאגר במיקום B, שקית תא במיקום D ו-F, ומזרק לאוסף במיקום H (איור 1ג).
2. תוכנית לפרוטוקול חילופי מאגרים אוטומטיים
- פתח את ממשק המשתמש הגרפי (GUI) של המכשיר ולחץ על כפתור "כוכבT" במחשב נייד או מחשב לוח. לאחר מכן "פתח" פרוטוקול קיים או לחץ על "חדש" כדי ליצור אחד חדש.
- השתמש בלחצן "קדימה" ו-"לאחור" כדי לנווט בכל שלב, בחר את השסתומים שייפתחו/נסגרו, מהירות צנטריפוגליים, מהירות המשאבה, כיוון המשאבה וגורמי פעולה. ההגדרות עבור כל שלב מסוכמות בטבלה 1. . אז שמור את הפרוטוקול
3. התקנת המכונה
- הציבו את ערכת העיבוד החד במחשב ותלו את השקיות המחוברות בהתאם. לחץ על כפתור "עצור/איפוס" האדום כדי לאפס את כל השסתומים לתוך המיקום הסגור המוגדר כברירת מחדל.
הערה: המכונה תבצע מבחן כאשר הדלת סגורה כדי להבטיח את הקיט הוצב כראוי וכי כל השסתומים פועלים כראוי. - חבר את GUI למכשיר עיבוד ולחץ על "חיבור" כפתור. לאחר מכן הורד את התוכנית שנשמרה. כאשר הכפתור "Play" הירוק נדלק, הוא מצביע על כך שהפרוטוקול מוכן להתחיל.
- פתח את התפסים ידנית עבור אבובים שק העברה.
הערה: אם המפעיל שוכח לפתוח את התפסים, ההתקן יפסיק והאזהרה לחיישני הלחץ תופיע. לחץ על כפתור "לעצור" כדי לאפס את המכשיר ולפתוח את התפסים כדי להתחיל מחדש.
4. החלפת מאגר אוטומטית
- לחץ על 'התחל' כדי ליזום את תוכנית חילופי המאגרים.
הערה: כדי לשנות באופן ידני את התהליך האוטומטי, לחץ על כפתור "הבא" כדי לעבור לשלב הבא לפני שהגיע "ההדק" או לחץ על "השהה" כדי לשים את התהליך בהמתנה. פעולה זו תאחד את התאים באמצעות הערכה תוך שמירה על שסתומים בלבד J ו-K פתוח (איור 1ג). - בסוף שלב אוטומציה 6 (טבלה 1), התהליך יהיה להשהות כאשר האוויר בשקית רוקנה עכשיו מפעיל את חיישן הבועה. לחץ על "הבא" כדי להעביר את התהליך לשלב הבא אם התיק הוא אכן ריק, או ללחוץ על "השהה" כדי לחדש את העיבוד אם החיישן הופעל על ידי בועה בשורה.
5. איסוף ודיגום התאים
- כאשר התהליך האוטומטי הוא סיים, לסגור את כל התפסים אבובים. פתח את הדלת ולקח את הערכה לשימוש יחיד מתוך המכשיר. נתק את המזרק כדי לאסוף את התאים לתהליכים הבאים. קח דגימה של התאים שנאספו עבור ספירת תאים ובדיקת הכדאיות (ראה שלב 6.2).
6. אימות תהליך
- בצע ניסויים בבקרת באמצעות פרוטוקול חילופי מאגרים ידני.
- תא צנטריפוגה מושעה ב 200 x g עבור 5 דקות. לבטל את supernatant ולהשעות את התאים עם 30 מ ל של מאגר שטיפת תאים. צנטריפוגה את ההשעיה התא שוב ב 200 x g עבור 5 דקות. למחוק את הסופרנטאנט ולהשעות מחדש את התאים עם 10 מ ל של מאגר שטיפת תאים.
- בצעו ספירת תאים באמצעות מחלת ההדרה הכחולה כדי להעריך את הכדאיות בתאים באמצעות מונה תאים אוטומטי.
- בצע שיטת MTS כדי לכמת את התפשטות התא ב 2, 24, ו 48 h.
הערה: השימוש ב-MTS בוצע על צלחת תרבות הרקמה 96 בהתאם להוראות היצרן. A 100 μl סדרת מחלקים של מדיית תרבות התא (המכיל 10,000 בתאים או 1,500) לבאר היו מצופים לאחר תהליך החלפת המאגר. בכל פעם, 20 μL של MTS מריאגנטים נוספו לתוך כל היטב מודבטים עבור 2 h ב 37 ° c. הספיגה הוערך ב 490 ננומטר באמצעות קורא לוחית. - לבצע מאמר פונקציונלי להשוות את ההשפעה של התהליך האוטומטי לעומת התהליך הידני על התאים והפונקציה MSC.
- התרבות בתאים ב96-צלחת בצפיפות של 1 x 106 תאים/mL מגורה עם 50 Ng/ml פורבול 12-myristate 13-אצטט (pma) ו-1 μg/ml איקונמיצין (קוקטייל גירוי התא) ב-dmem: מדיה F12 המכיל 10% סרום בפרה עוברית (fbs) עבור 24 h. מודדת התאים ב 37 ° c עם 5% CO2.
- מדידת הייצור interleukin-2 מן התרבות supernatant באמצעות מבוסס חרוז מבוססי אליסה (ראה טבלת חומרים) על פי הוראות היצרן.
- תרבות MSCs בצלחת 12 היטב בצפיפות של 10,000 תאים/cm2 ב 1 מ ל של Dמאמ: מדיה F12 המכיל 10% fbs שיושלם עם אינטרפרון-γ 50 יחידות/mL עבור 48 h. לאסוף supernatant על היכולת ריכוז kynurenine למדוד האינאמין 2, 3-diחמצון (עידו) פעילות אנזים של MSCs כפי שתוארה בעבר21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
בפרוטוקול זה, השתמשנו בתאים של ג'ורקאט ובMSCs כדוגמאות מייצגות כדי להדגים את תהליך החלפת המאגר האוטומטי. במהלך התהליך, שיתפו התאים של ג'ורקאט ו-MSCs את אותם שלבי עיבוד עם הבדלים בכוח צנטריפוגלי ובמהירות המשאבה השולטים בקצב הזרימה (שולחן 1). איור 2 מראה תמונות הנציגה שנתפסו על ידי המצלמה של איך מיטת התאים fluidized עשוי להופיע במהלך תהליך חילופי מאגר. בדרך כלל, המיטה התאים flu, ידמה את התמונה באיור 2A, שבו התאים לצבור באמצע לכיוון הקדמי של החרוט עם שטח קטן בקצה החדר, שבו התאים לא מצטברים ואת הפתיחה של מפרץ הטעינה התא גלוי. המיטה תא fluidized עשוי להיות דחוס (איור 2ב) כאשר מציגים מאגר חדש כי הוא בצמיגות או צפיפות שונים. בפרוטוקול זה, מהירות המשאבה הורדה מ-30-35 mL/min ל-20 mL/min בתחילת שלב הכביסה. ברגע שהחדר היה מלא במאגר החדש, מהירות המשאבה הוחזרה לשגרה כדי למנוע מתאי הפלטינג בקצה החדר. ניתן להחיל שיעור זרימה גבוה (איור 2ג) כדי לבחור בתאים חיים מכיוון שתאים מתים קטנים יותר וקלים יותר וניתן לכפות אותם מתוך התא על-ידי הגדלת קצב הזרימה.
התהליך האוטומטי של חילופי מאגר הושגה על ידי התמקדות הראשון את התאים, ולאחר מכן החדרת מאגר לשטוף, אשר היה סביב 10x של נפח של מיטה תא פלואידיל. התאים גובשה לאחר מכן לאמצעי האחסון הרצוי. שלושת שלבי העיבוד האלה תוכננו כדי לעקוב אחר אותם עקרונות כמו החלפת מאגר ידנית. בדרך כלל, צנטריפוגה שני מחזור (200 x g, 5 דקות) משמש כדי לבצע חילופי מאגר ידני, שבו תאים מסוימים להתרכז, מושעה לשטוף, ואז centrifuged שוב ומושעה לנפח הסופי. זמן העיבוד של התהליכים האוטומטיים היה קצר יותר בהשוואה לאלה הידניים (איור 3). שיעור ההחלמה בין תהליכים ידניים ואוטומטיים היו דומים הן לתאים ולMSCs, ויכולת הכדאיות של התא לא הושפעה מהתהליך (איור 4). איכות התא אומתה על ידי תפוצת תאים (שיטת MTS) ו cy, ייצור אנזימים. התאים המשוחזרים הראו שיעורי התפשטות דומים בין המדריך לבין התהליכים האוטומטיים (איור 5א). רמת הייצור של interleukin-2 מתאי ויוקאט ו עידו הפעילות של MSCs היו גם דומות בין שתי הקבוצות (איור 5ב ו -5ג).
| מספר שלב | תיאור/ | שסתומים פתוחים | מהירות צנטריפוגה (גר') | מהירות משאבה (ml/דקה) | גורמים | |
| 1 | צינורות פריים מ-ב' ל | A, B, K | 10 | 50 | אמצעי אחסון: 45 ml | |
| 2 | מילוי בועה השמנה מ A ל-B | A, B, K | 100 | 50 (הפוך) | נפח: 10 מ ל | |
| 3 | צינורות ראשוניים ל-D | א, ד, ק | 100 | 50 (הפוך) | נפח: 2 מ ל | |
| 4 | צינורות הממשלה J to K | ג'יי, קיי | 100 | 50 | אמצעי אחסון: 3 מ ל | |
| מיכל 5 | טען תאים – התחלה הראשונית D כדי G | D, K, G | 1600 (MSCs) 1500 | 25 (MSCs) | אמצעי אחסון: 100 ml | |
| 6 | טען תאים עם בועה לזהות [באיתור של בועה/אבובים ריקים, התוכנית תושהה ולחכות הפקודה של המפעיל, לחץ על ' השהה ' או ' הבא '] | א, ד, ק | = הצעד האחרון | 30 35 (MSCs) | חיישן בועה D | |
| 7 | ריקון המדיה הנותרת בשפופרת D של היציאה | א, ד, ק | = הצעד האחרון | = הצעד האחרון | אמצעי אחסון: 1.5 ml | |
| 8 | שטוף תאים 1 | A, B, K | = הצעד האחרון | 20 | נפח: 20 מ ל | |
| 9 | מהירות הכביסה | A, B, K | = הצעד האחרון | 35 | טיימר: 5 שניות מהירות הפינג | |
| 10 | לשטוף את התאים 2 | A, B, K | = הצעד האחרון | = הצעד האחרון | נפח: 20 מ ל | |
| 11 | היכונו לקציר | ג'יי, קיי | = הצעד האחרון | = הצעד האחרון | טיימר: 2 שניות | |
| 12 | לשחזר תאים פלט לדלל את עוצמת היעד | בי, ג'יי, קיי | = הצעד האחרון | 60 (הפוך) | נפח: 10 מ ל | |
| הערה: ' = השלב האחרון ' הוא אפשרות הגדרה עבור מהירות תפרידו ומהירות משאבה ב-GUI. | ||||||
טבלה 1: התקנה אוטומטית של החלפת מאגר GUI עבור תאים של ג'ורקאט וMSCs.
איור 1: זרימה נגדית של מערכת עיבוד תאים צנטריפוגליים. (א) תרשים סכמטי הממחיש את עקרון צנטריפוגה הזרימה הנגדית. כוח הזרימה הנגדית נמצא. במעבר בתוך תא התא בעוד שתפרידו (חץ אפור), תאים בעלי קטרים גדולים יותר מקבלים כוח משקעי גבוה יותר, שבו התאים מגיעים לשיווי משקל כנגד הקצה הצר של החדר, ויוצרים מיטת תא פלודילית. פסולת תא וחלקיקים קטנים שקטנים מדי מכדי להישאר בחדר נשטפים. (ב) מערכת עיבוד צנטריפוגליים של זרימת הנגד מורכבת מהתקן העיבוד ומערכת העיבוד החד. (ג) תצורת ערכת השימוש היחיד עבור פרוטוקול חילופי המאגרים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: מיטת התאים הפלואידית בתא התא. תמונות מייצגות של מיטת תא פלואידיל תחת (א) בינוני, (ב) נמוך, ו (ג) קצב זרימה גבוה. הקו המנוקד מציין את אזור מיטת התא הפלואידיל בתוך התא. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: השוואת זמן עיבוד התאים של התאים והMSCs באמצעות עיבוד ידני ואוטומטי. (n = 3 – 4 בכל קבוצה, נתונים מוצגים כממוצע ± SD). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: השוואת הכדאיות של התאים ושחזור התא החי של התאים והMSCs באמצעות עיבוד ידני ואוטומטי. הכדאיות שלהתאים (A) ושחזורהתאים החיים (B) נמדדו על-ידי שיטת אי-הכללה כחולה של טריפה באמצעות מונה תאים אוטומטי. שחזור התאים החיים הופחת בהעדר סרום או כאשר רק 3 x 106 או 1 x 106 תאים עובדו. (n = 4 – 9 בכל קבוצה, נתונים מוצגים כממוצע ± SD). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: התפשטות התא ופונקציית התא מעיבוד ידני ואוטומטי. (א) MTS של תאים וMSCs בוצעו ב -2, 24, ו 48 h לאחר החלפת מאגר. איכות התאים המשוחזרות היתה משוכמת על ידי ייצור אינטרלוקין -2 מתאי ג'ורקאט (B) ופעילות עידו ב MSCs (ג). (n = 4 – 8 בכל קבוצה, נתונים מוצגים כממוצע ± SD). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: מיטת התאים פלואידיאד יציבות בקצב זרימה שונים. בוצעו שני תהליכים עבור כל סוג תא. בתהליך אחד, או 3 x 107 כיוקט תאים או 1 x 107 MSCs. בתהליך השני, 10x מספר התאים שימשו. בשני התהליכים, 10 מ ל של משחרני תאים נאסף מנמל A בקצבי זרימה שונים באמצעות מהירות תפרידו המצוין בפרוטוקול זה (1,600 x g עבור התאים של ג'ורקאט ו1,500 x g עבור MSCs). מספר התאים באלוטריאט נקבע והוצג כאחוז מהסכום הכולל של התאים הטעונים בחדר. (n = 3 עבור כל קבוצה, נתונים מוצגים כממוצע ± SD). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרוטוקול חילופי המאגרים האוטומטיים המתואר הוא פשוט וידידותי למשתמש. עם זאת, קיימים מספר צעדי מפתח בפרוטוקול זה הקריטיים ודורשים תשומת לב מיוחדת. בניסיון שלנו, בעת עיבוד תאים גדולים כגון MSCs (קוטר ממוצע 10 – 15 μm) כל הפעלה צריכה לכלול לפחות 1 x 107 תאים כדי להשיג שחזור תאים אופטימלי (איור 4B). עיבוד תאים קטנים יותר, כגון תאים של ג'ורקאט (ממוצע ~ 10 יקרומטר קוטר), דורש סביב 3 x 107 תאים כדי להשיג מיטה תא פלואידיזד יציבה (איור 4ב). כאשר מספר התאים נמוך מדי, סביר להניח שתאים יוסרו מהמיטה הפלואידיל, אשר ישפיעו על שחזור התא הסופי. בנוסף, השוונו את שיעורי הפסד התא במהירויות משאבה שונות כאשר מוחל מהירות צנטריפוגלית קבועה. כאן, הבחנו כי אובדן התאים גדל עם קצב הזרימה (איור 6), שנובע מחוסר היציבות הגוברת של המיטה הפלודיפית בקצבי זרימה גבוהים יותר. עם זאת, אחוז הפסד התא היה נמוך יותר כאשר 10x מספר התאים נטענו לתוך התא, המרמז כי ניתן להחיל מהירות משאבה גבוהה יותר בעת עיבוד מספר גדול יותר של תאים כדי לאפשר עיבוד מהיר יותר. בשלב 5 של התהליך, 100 mL של מדיית התרבות היתה מחוזרת מהתא חזרה לשקית העברת התאים כדי לאפשר למיטה flu, ליצור ולייצב לפני הפחתת נפח והחלפת מאגר. אם ריכוז התאים נמוך (לדוגמה, מתחת 0.2 x 106/mL), ייתכן שיהיה צורך להרחיב את השלב הארוך כדי לאפשר מספיק תאים כדי ליצור את מיטת התאים הפלואידיל. באופן דומה, אם ריכוז התאים גבוה, ניתן לתקצר את שלב החיסון העצמי.
הנוכחות של סרום במאגר לשטוף הוא גם קריטי להתאוששות התא. מחקרים קודמים הראו כי לחץ הידרודינמי יכול לגרום למוות של תאים נקרוטיים בהעדר אגירת חלבונים22,23. הזרימה הדינמית של מערכת ההזרמה הגלית מורכבת למדי. בפרוטוקול זה, שיעורי שחזור התא ירדו לאזור 70% כאשר התהליך בוצע בהעדר סרום (איור 4ב). למרות המנגנון המדויק אינו ברור, הנוכחות של סרום במדיה תרבות או אלבומין במאגרי הכביסה היה מסוגל להמתיק את הנזק המכני הפוטנציאלי לתאים. עבור יישומים הדורשים מאגרים ללא סרום, עמילן הידרוליקסיל ו תוספי 40 הם דוגמאות של תוספים שאינם חלבון המשמשים לעתים קרובות בייצור תאים כדי להגן מפני לחץ הידרודינמי24,25.
הטכנולוגיה הצנטריפוגה של זרימה נגדית שימש בייצור ביופרמקולוגיה בקנה מידה גדול ועיבוד מוצר דם17. היישומים של טכנולוגיית CFC בייצור תאים בקנה מידה קטן (כלומר, 0.1 – 10 L) מוגבלים בדרך כלל לבידוד תאים מוננוברורים ממוצרי apheresis כגון האלוטרה (Terumo BCT)26, שבה התערבות ידנית נוספת נדרשת לבצע כביסה ולמקד את הצעדים. פלטפורמות אחרות בקנה מידה קטן לעיבוד תאים כוללים מערכות מבוססות סינון ממברנה המבוססת על החלפת מאגר כגון LOVO (Fresenius Kabi)27 ו צנטריפוגה הפרדה אנכית כגון שירותי הבריאות (GE)28. למרות שקשה לבצע השוואה ישירה בין התקנים, אחד היתרונות של מכשיר זה של זרימה נגדית הוא יכולתו לספק אמצעי אחסון קטנים מאוד (מינימום 5 מ ל), שהוא הקטן ביותר בין פלטפורמות עיבוד התא הזמינות כעת. נפח הפלט הקטן מתאים ליישומים כגון גיבוש תאים עבור זריקות מקומיות של29 או חליטות עבור neonates30. המצלמה המוטבעת במכשיר היא גם תכונה ייחודית המספקת ויזואליזציה של מיטת התא flu, במהלך השלב פיתוח תהליך.
אחת המגבלות של טכנולוגיית CFC היא שהיא רגישה לגודל ולצפיפות של התאים. בעת הגדרת פרוטוקול חילופי מאגר עבור סוג תא שונה, הפרוטוקול המוצג כאן צריך לשמש כמנחה למשתמשים למטב בהתאם לצרכיהם, לזכור את גודל תאי העניין שלהם ואת הצפיפות של השעיית התא שלהם. למרות הפרוטוקול הנוכחי הוא שמיש לעיבוד עד 5 L של מדיה, הזמן עיבוד יהיה מורחב באופן משמעותי (כלומר, 1 – 2 h). חשוב לציין כי ההשפעה של זמן עיבוד מורחב על איכות התא לא נבדק במחקר נוכחי זה.
מחקרים עתידיים יעריכו את ההשפעה של מהירות עיבוד וזמן עיבוד על תפקוד התא כדי לקבוע את קיבולת העיבוד המקסימלית של המכשיר. יתר על כן, מחקרים עתידיים עשויים לחקור יישומים אחרים כגון הסרת diמתיל סולפוקסיד (DMSO) מ cryopreserved מוצרים והסרה סלקטיבית של תאים מתים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
SW, IF, ו-DJ הם סמנכ ל תפעול, סמנכ ל ומנכ Scinogy Pty. Ltd. הגישה למכשיר CFC סיפקה גם את Scinogy.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכת על ידי תוכנית התמיכה המבצעית של הממשלה הויקטוריאנית, ושובר הטכנולוגיה הממשלתית הויקטוריאנית שסיפק המחלקה לפיתוח כלכלי, משרות, תחבורה ומשאבים. RL היא המקבלת של מלגת פיתוח קריירה של מועצת הבריאות הלאומית והמחקר הרפואי. אל הוא המקבל של פרס לתארים מתקדמים באוסטרליה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 20 ml Luer lock syringes | BD | 302830 | |
| 20% Human serum albumin (HSA) | CSL Behring | AUST R 46283 | |
| 4-(Dimethylamino)benzaldehyde | Sigma-Aldrich | 156477-25g | |
| 500ml IV saline bag | Fresenius Kabi | K690521 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Thermo Fisher Scientific | 15240112 | |
| Automated cell counter (Countess) | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| Cell counting chamber slides | Thermo Fisher Scientific | C10228 | |
| Cell stimulation cocktail (500x) | Thermo Fisher Scientific | 00-4970-93 | |
| Cell transfer bags | Terumo | T1BBT060CBB | |
| CellTiter AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS) | Promega | G3582 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| DMEM: F12 media | Thermo Fisher Scientific | 11320082 | |
| EnVision plate Reader | Perkin Elmer | N/A | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 10099141 | |
| Human Interleukin 2 (IL2) Kit | Perkin Elmer | Al221C | |
| Luer (female) fittings | CPC | LF41 | |
| PC laptop or PC tablet device | ASUS | N/A | |
| Plate reader (SpectraMax i3) | Molecular Device | N/A | |
| Recombinant Human IFN-γ | PeproTech | 300-02 | |
| Rotea counterflow centrifuge cell processing device | Scinogy | N/A | |
| Rotea single-use processing kit | Scinogy | N/A | |
| RPMI media | Thermo Fisher Scientific | 11875119 | |
| Surgical scissors | ProSciTech | 420SS | |
| Trichloroacetic acide | Sigma-Aldrich | T6399-250g | |
| Trypan Blue stain | Thermo Fisher Scientific | T10282 | |
| Trypsin digestion enzyme (TrypLE Express Enzyme) | Thermo Fisher Scientific | 12604013 |
References
- Lopes, A. G., Sinclair, A., Frohlich, B. Cost Analysis of Cell Therapy Manufacture: Autologous Cell Therapies, Part 1. BioProcess International. 16 (3), (2018).
- Hampson, B., Ceccarelli, J. Factories of the future: Can Patient-Specific Cell Therapies Get There from Here? BioProcess International. 14 (4), (2016).
- Preti, R., Daus, A., Hampson, B., Sumen, C. Mapping success for commercial cell therapy manufacturing. BioProcess International. 13 (9), 33-38 (2015).
- Heathman, T. R., et al. The translation of cell-based therapies: clinical landscape and manufacturing challenges. Regenerative Medicine. 10 (1), 49-64 (2015).
- Lipsitz, Y. Y., et al. A roadmap for cost-of-goods planning to guide economic production of cell therapy products. Cytotherapy. 19 (12), 1383-1391 (2017).
- Lopes, A. G., Sinclair, A., Frohlich, B. Cost Analysis of Cell Therapy Manufacture: Autologous Cell Therapies, Part 2. BioProcess International. 16 (4), 12-19 (2018).
- Hanley, P. J., et al. Efficient manufacturing of therapeutic mesenchymal stromal cells with the use of the Quantum Cell Expansion System. Cytotherapy. 16 (8), 1048-1058 (2014).
- Leong, W., Nakervis, B., Beltzer, J. Automation: what will the cell therapy laboratory of the future look like? Cell Gene Therapy Insights. 4 (9), 679-694 (2018).
- Galipeau, J., Sensebe, L. Mesenchymal Stromal Cells: Clinical Challenges and Therapeutic Opportunities. Cell Stem Cell. 22 (6), 824-833 (2018).
- Salmikangas, P., Kinsella, N., Chamberlain, P. Chimeric Antigen Receptor T-Cells (CAR T-Cells) for Cancer Immunotherapy - Moving Target for Industry? Pharmaceutical Research. 35 (8), 152 (2018).
- James, D. How short-term gain can lead to long-term pain. Cell Gene Therapy Insights. 3 (4), 271-284 (2017).
- Rafiq, Q. A., Thomas, R. J. The evolving role of automation in process development, manufacture of cell, gene-based therapies. Cell Gene Therapy Insights. 2 (4), 473-479 (2016).
- Rafiq, Q. A. Emerging Automated Approaches for Cell and Gene Therapy Manufacture. Cell Gene Therapy Insights. 4 (9), 911-914 (2018).
- Contreras, T. J., Jemionek, J. F., French, J. E., Shields, L. J. Human Granulocyte Isolation by Continuous Flow Centrifugation Leukapheresis and Counterflow Centrifugation Elutriation (CFCL/CCE). Transfusion. 19 (6), 695-703 (1979).
- Berger, T. G., et al. Efficient elutriation of monocytes within a closed system (Elutra™) for clinical-scale generation of dendritic cells. Journal of Immunological Methods. 298 (1), 61-72 (2005).
- Chen, Y., Hoecker, P., Zeng, J., Dettke, M. Combination of Cobe AutoPBSC and Gambro Elutra as a platform for monocyte enrichment in dendritic cell (DC) therapy: Clinical study. Journal of Clinical Apheresis. 23 (5), 157-162 (2008).
- Whitford, W. G. Continuous Processing in Pharmaceutical Manufacturing. Subramanian, G. , (2014).
- Scinogy. SMALL BATCH CELL SEPARATION, WASH & CONCENTRATION. , https://www.scinogy.com/projects (2019).
- Yu, D., et al. Targeting Jurkat T Lymphocyte Leukemia Cells by an Engineered Interferon-Alpha Hybrid Molecule. Cellular Physiology and Biochemistry. 42 (2), 519-529 (2017).
- Moharram, S. A., Shah, K., Kazi, J. U. T cell Acute Lymphoblastic Leukemia Cells Display Activation of Different Survival Pathways. Journal of Cancer. 8 (19), 4124 (2017).
- Ling, W., et al. Mesenchymal stem cells use IDO to regulate immunity in tumor microenvironment. Cancer Research. 74 (5), 1576-1587 (2014).
- Tanzeglock, T., Soos, M., Stephanopoulos, G., Morbidelli, M. Induction of mammalian cell death by simple shear and extensional flows. Biotechnology and Bioengineering. 104 (2), 360-370 (2009).
- Aguado, B. A., Mulyasasmita, W., Su, J., Lampe, K. J., Heilshorn, S. C. Improving viability of stem cells during syringe needle flow through the design of hydrogel cell carriers. Tissue engineering. Part A. 18 (7-8), 806-815 (2012).
- Zhu, F., et al. Hydroxyethyl starch as a substitute for dextran 40 for thawing peripheral blood progenitor cell products. Cytotherapy. 17 (12), 1813-1819 (2015).
- Schwandt, S., Korschgen, L., Peters, S., Kogler, G. Cord blood collection and processing with hydroxyethyl starch or non-hydroxyethyl starch. Cytotherapy. 18 (5), 642-652 (2016).
- Stroncek, D. F., et al. Counter-flow elutriation of clinical peripheral blood mononuclear cell concentrates for the production of dendritic and T cell therapies. Journal of Translational Medicine. 12, 241 (2014).
- Mfarrej, B., et al. Pre-clinical assessment of the Lovo device for dimethyl sulfoxide removal and cell concentration in thawed hematopoietic progenitor cell grafts. Cytotherapy. 19 (12), 1501-1508 (2017).
- Abonnenc, M., Pesse, B., Tissot, J. D., Barelli, S., Lion, N. Automatic washing of thawed haematopoietic progenitor cell grafts: a preclinical evaluation. Vox Sanguinis. 112 (4), 367-378 (2017).
- Panes, J., et al. Expanded allogeneic adipose-derived mesenchymal stem cells (Cx601) for complex perianal fistulas in Crohn's disease: a phase 3 randomised, double-blind controlled trial. Lancet. 388 (10051), 1281-1290 (2016).
- Lim, R., et al. First-In-Human Administration of Allogeneic Amnion Cells in Premature Infants With Bronchopulmonary Dysplasia: A Safety Study. Stem Cells Translational Medicine. 7 (9), 628-635 (2018).
