Summary
Automatisierung ist der Schlüssel zum Upscaling und Kostenmanagement in der Zellfertigung. Dieses Manuskript beschreibt den Einsatz eines Gegenstromzentrifugalzellverarbeitungsgeräts zur Automatisierung des Pufferaustauschs und der Zellkonzentrationsschritte für die kleinräumige Bioverarbeitung.
Abstract
Eine erfolgreiche Kommerzialisierung von Gen- und zellbasierten Therapien erfordert kostengünstige und skalierbare Herstellungsprozesse. Pufferaustausch und Produktkonzentration sind wesentliche Komponenten für die meisten Fertigungsprozesse. In den frühen Stadien der Produktentwicklung werden diese Schritte jedoch häufig manuell ausgeführt. Die manuelle Sackgassenzentrifufugation für den Pufferaustausch ist arbeitsintensiv, kostspielig und nicht skalierbar. Ein geschlossenes automatisiertes System kann diesen mühsamen Schritt effektiv eliminieren, aber die Implementierung kann eine Herausforderung sein. Hier beschreiben wir ein neu entwickeltes Zellverarbeitungsgerät, das sich für die kleine bis mittlere Zellverarbeitung eignet und die Lücke zwischen manueller Verarbeitung und großflächiger Automatisierung überbrücken soll. Dieses Protokoll kann einfach auf verschiedene Zelltypen und Prozesse angewendet werden, indem die Durchflussrate und die Zentrifugationsgeschwindigkeit geändert werden. Unser Protokoll zeigte eine hohe Zellwiederherstellung mit kürzeren Verarbeitungszeiten im Vergleich zum manuellen Prozess. Zellen, die sich aus dem automatisierten Prozess erholten, hielten auch ihre Proliferationsraten aufrecht. Das Gerät kann als modulare Komponente in einem geschlossenen Fertigungsprozess eingesetzt werden, um Schritte wie Pufferaustausch, Zellformulierung und Kryokonservierung aufzunehmen.
Introduction
Die Landschaft der modernen Medizin hat sich durch die jüngsten Entwicklungen in Gen- und Zelltherapien (GCT) rasant verändert. Als eines der am schnellsten wachsenden Bereiche der Translationsforschung steht auch der GCT-Sektor vor einzigartigen und beispiellosen Herausforderungen. Neben robusten klinischen Ergebnissen sind effiziente und kostengünstige Herstellungsverfahren entscheidend für den wirtschaftlichen Erfolg von GCT, der in der Kleinfertigung besonders schwer zu erreichen ist1. Die Kosten für Zeit, Arbeit und Qualitätssicherung werden erhöht, wenn jede Zellcharge nur wenige Dosen für einen Patienten anstatt für Hunderte oder Tausende produziert. Im Gegensatz zu allogenen Zelltherapien, bei denen die Herstellungsverfahren eher der Produktion von Antikörpern und rekombinanten Proteinen ähneln, werden autologe Zelltherapien typischerweise als kleinräumige Operationen produziert1. Als relativ neues Phänomen in der biopharmazeutischen Fertigung2sind die Möglichkeiten für die Zellverarbeitung in kleinem Maßstab derzeit recht begrenzt.
Der Pufferaustausch ist für die Zellfertigung unerlässlich. Es ist einer der nachgelagerten Prozesse, bei denen Zellen aus Kulturmedien entfernt und zur Kryokonservierung oder Infusion konzentriert werden. Derzeit wendet die Herstellung von Kleinzellen häufig Ähnliche Prozesse an wie im akademischen Forschungsumfeld und setzt auf spezialisierte Reinräume, um die Sterilität zu erhalten3. Manuelle nachgelagerte Prozesse verwenden häufig Tischzentrifugen, um Zellen zur Volumenreduzierung und Pufferaustausch zu besinnen und wieder auszusetzen. Diese offenen Prozesse sind kostspielig (d.h. Arbeits- und Reinraumpflege) und haben eine begrenzte Fertigungskapazität, die nicht ideal für die kommerzielle Produktion2,3sind.
Die Implementierung von Automatisierung wurde als Lösung zur Verbesserung der Fertigungseffizienz und zur Erreichung kommerzieller Produktionenvorgeschlagen 2. Sterilität kann in zellbasierten Produkten nicht durch traditionelle Methoden für Biologika wie Gammabestrahlung oder Endendfiltration erreicht werden. Stattdessen wird ein automatisiertes geschlossenes System eingesetzt, um das Risiko von Kontaminationen zu reduzieren, und Betreiber, die auf Reinräume angewiesen sind, um die Sterilität zu erhalten4. Die Prozessautomatisierung behebt auch das Problem der Skalierbarkeit, indem entweder mehrere Systeme parallel ausgeführt werden (Scale-out) oder die Verarbeitungskapazität eines einzelnen Geräts erhöht wird (Scale-up), wodurch die Variabilität zwischen den Operatoren minimiert wird. Darüber hinaus legt die Kostenmodellierungsanalyse autologer Therapiennahe, dass die Automatisierung die Herstellungskosten 5,6reduzieren kann. In einer autologen klinischen Stammzellstudie, in der eine automatisierte Fertigungsplattform verwendet wurde, wurde jedoch kein Kostenvorteil festgestellt7, was darauf hindeutet, dass der Kostenvorteil der Automatisierung vom einzelnen Herstellungsprozess abhängen kann.
Es gibt verschiedene Strategien, mit denen Automatisierung in einen bestehenden Fertigungsprozess eingeführt werden kann. Dies kann entweder durch die Implementierung einer vollständig integrierten Plattform oder einer modular enden basierten Verarbeitungskette erreicht werden. Es gibt mehrere voll integrierte Plattformen, die für die autologe Zellherstellung kommerziell erhältlich sind, wie CliniMACS Prodigy (Miltenyi Biotec), Cocoon (Octane Biotech) und Quantum (Terumo BCT). Diese integrierten Plattformen, die oft als "GMP-in-a-box" bezeichnet werden, haben geringe Anforderungen an die Infrastruktur und sind einfach zu bedienen. Die Fertigungskapazität eines vollständig integrierten Setups kann jedoch durch den an das System angeschlossenen Inkubator eingeschränkt werden. Beispielsweise ist die Kultivierungskapazität von Prodigy auf seine 400 ml Kammer8 begrenzt und die Quantum-Patrone hat eine begrenzunge Oberfläche von 2,1m2 (entspricht 120 T175-Kolben)7, was für Patienten, die höhere Zelldosenbenötigen, möglicherweisenicht ausreicht 9,10. Darüber hinaus haben Prodigy und Quantum ein gemeinsames Attribut, das ihre Verwendung einschränkt: Die Betriebseinheit wird während des gesamten Zellexpansionszeitraums von einer einzigen Charge nutzbesetzt, wodurch die Anzahl der Chargen begrenzt wird, die von jeder Einheit11hergestellt werden können. Der modulare Automatisierungsansatz besteht darin, eine Fertigungskette mit mehreren modularen Einheiten zu schaffen, die den kommerziellen Fertigungsprozess simuliert12,13. Dieser Ansatz, der das Kulturgerät vom Zellwaschgerät trennt, kann dadurch die Fertigungseffizienz maximieren. Ein ideales Verarbeitungsgerät wäre ein, das anpassungsfähig und skalierbar an Fertigungsanforderungen12ist.
Die CFC-Technologie (Counterflow Zentrifufugation), die bis in die 1970er Jahre zurückreicht, hat eine lange Geschichte in der Zellverarbeitung14. Es erreicht Zellkonzentration und Trennung durch Ausgleich der Zentrifugalkraft mit einer Gegenströmungskraft. Typischerweise tritt eine Zellsuspension vom schmalen Ende einer Zellkammer unter einer konstanten Durchflussrate ein, während sie einer Zentrifugalkraft ausgesetzt ist (Abbildung 1A). Der Fluss der Flüssigkeit wird in entgegengesetzter Richtung zur Fliehkraft ausgeübt. Dies wird als Gegenstromkraft bezeichnet, die einen Gradienten innerhalb der Zellkammer bildet. Die Gegenströmungskraft nimmt dann ab, wenn sich die Zellkammer von der Spitze der kegelförmigen Zellkammer wegweitet. Zellen mit höherer Dichte und größerem Durchmesser haben eine höhere Sedimentationsrate und erreichen so das Kraftgleichgewicht zur Spitze der kegelförmigen Zellkammer. Kleinere Partikel können das Gleichgewicht zur Basis der Kammer erreichen oder zu klein sein, um in der Kammer zurückgehalten zu werden und werden weggewaschen. Die FCKW-Technologie ist vor allem für ihre Anwendung in der Verarbeitung von Blutapherese-Produkten bekannt, wie die Isolierung von Monozyten für dendritische Zelltherapien15,16. Im Hinblick auf den Pufferaustausch wurde die FCKW-Technologie nur in der Großfertigung17 eingesetzt und muss noch für die kleinere Herstellung von autologen Zelltherapien eingesetzt werden.
Um dem Bedarf an einem geeigneten Gerät für die Herstellung kleiner Zellen gerecht zu werden, wurde kürzlich ein automatisiertes FCKW-Gerät (siehe Materialtabelle)entwickelt. Das automatisierte Zellverarbeitungsgerät nutzt die Gegenflusszentrifugationstechnologie, um Zellablagerungen zu entfernen und den Pufferaustausch zu erleichtern. Das Gerät führt einen Pufferaustausch mit einem Einweg-Kit durch, das steril mit einem Zelltransferbeutel verbunden werden kann, wodurch die Zellen in einem sterilen, geschlossenen System verarbeitet werden können. Hier untersuchen wir den Einsatz eines Gegenstromzentrifugalgeräts zur Durchführung eines Pufferaustauschs in Säugetierzellkulturen in automatisierten Protokollen. In dieser Studie testeten wir das Pufferaustauschprotokoll mit Jurkat-Zellen und mesenchymalen Stromalzellen (MSCs), um nicht haftende bzw. anhaftende Zelltypen zu modellieren. Jurkat-Zellen sind verewigte T-Zellen, die häufig für die Untersuchung der akuten T-Zell-Leukämie19,20verwendet werden. MSCs sind adulte Stammzellen, die in klinischen Studien am Menschen für eine Vielzahl von Krankheiten untersucht wurden9.
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Protocol
1. Herstellung von Reagenzien und Zellen für den Pufferaustausch
- Vorbereiten von Puffern (siehe Materialtabelle)in einer laminaren Strömungshaube der Klasse 2. Mit einer Spritze und Nadelbaugruppe 50 ml Salinelösung aus einem 500 ml-Salinebeutel entfernen. Ersetzen Sie dies durch 50 ml 20% humanes Serumalbumin (HSA), um 2% HSA in Saline zu bilden, was als Waschpuffer dient.
- Entfernen Sie die Zellen aus den Kulturgefäßen, und führen Sie eine Zellanzahl aus, um die Anfangszellenmenge und Lebensfähigkeit durch Trypan-Blauausschluss zu bestimmen. Laden Sie die Zellen in einen Transferbeutel.
HINWEIS: In diesem Protokoll wurden Jurkat-Zellen in RPMI und MSCs in DMEM:F12 kultiviert. Beide Medien wurden mit 10% fetalem Rinderserum (FBS) und 1% Antimykotischen Lösungen ergänzt. Die Zellen wurden bei 37 °C mit 5%CO2kultiviert. Bei MSCs oder anhaftenden Zellen fügen Sie ein Verdauungsenzym (z. B. Trypsin) in die Kulturgefäße ein, um die Zellen zu lösen, und löschen Sie mit Kulturmedien, sobald die Zellen getrennt sind. In diesem Protokoll wurde ein Transferbeutel verwendet, da die Zellen in Kulturgefäßen erweitert wurden. Wenn die Zellen jedoch in einem Zellkulturbeutel kultiviert werden, kann es über steriles Rohrschweißen direkt mit dem Einweg-Kit verbunden werden. In diesem Protokoll wurden entweder 3 x 107 Jurkat-Zellen oder 1 x 107 MSCs für jeden Durchlauf verwendet, wobei Zellen in 40 ml Kulturmedien suspendiert wurden.- Laden Sie Zellen in einen Transferbeutel (siehe Materialtabelle)mit einer Spritze und einer Nadelbaugruppe, wenn ein steriler Rohrschweißer zur Verfügung steht, um den Transferbeutel mit dem Einweg-Verarbeitungskit zu verbinden.
- Alternativ können Sie das Verbindungsrohr mit ca. 10 cm Restanstrich an der Transfertasche mit einer Autoklavenschere schneiden und am Ende des Schlauches einen weiblichen Luer-Stecker hinzufügen. Verwenden Sie eine Spritze, um Zellen und Medien zu aspirieren, schließen Sie die Spritze dann an den Luer-Stecker an und laden Sie Zellen mit dem Transferbeutel.
- Schließen Sie den Beutel mit den Zellen, den Waschpufferbeutel mit 500 ml Waschpuffer in Schritt 1.1, Abfallbeutel und Sammelspritze an das Einweg-Kit an (Abbildung 1B).
HINWEIS: Die Verbindungsposition jedes Beutels hängt von den Einstellungen im Programm ab. In diesem Protokoll haben wir den Abfallbeutel an Position A, Waschpuffer an Position B, Zellbeutel an Den Positionen D und F und Sammelspritze an Position H (Abbildung 1C) angeschlossen.
2. Programm für automatisiertes Pufferaustauschprotokoll
- Öffnen Sie die grafische Benutzeroberfläche (GUI) des Geräts und drücken Sie die "START"-Taste auf einem Laptop-PC oder Tablet. Öffnen Sie dann "einvorhandenes Protokoll oder drücken Sie "Neu", um ein neues zu erstellen.
- Verwenden Sie die Schaltfläche "Vorwärts" und "Rückwärts", um durch jeden Schritt zu navigieren, wählen Sie die zu öffnenden/geschlossenen Ventile, die Zentrifugalgeschwindigkeit, die Pumpengeschwindigkeit, die Pumpenrichtung und die Aktionsauslöser aus. Die Einstellungen für jeden Schritt sind in Tabelle 1zusammengefasst. Speichern Sie dann das Protokoll.
3. Einrichten der Maschine
- Legen Sie das Einweg-Verarbeitungskit auf die Maschine und hängen Sie die angeschlossenen Beutel entsprechend auf. Drücken Sie die rote Taste "Stop/Reset", um alle Ventile in die standardmäßig geschlossene Position zurückzusetzen.
HINWEIS: Die Maschine führt einen Test durch, wenn die Tür geschlossen ist, um sicherzustellen, dass das Kit richtig platziert wurde und dass alle Ventile ordnungsgemäß funktionieren. - Schließen Sie die GUI an das Verarbeitungsgerät an und drücken Sie die Schaltfläche "Verbinden". Laden Sie dann das gespeicherte Programm herunter. Wenn die grüne"Play"-Taste leuchtet, zeigt sie an, dass das Protokoll startbereit ist.
- Öffnen Sie die manuellen Klemmen für den Transferbeutelschlauch.
HINWEIS: Wenn der Bediener vergisst, die Klemmen zu öffnen, stoppt das Gerät und die Warnung des Drucksensors wird angezeigt. Drücken Sie die Taste "Stopp", um das Gerät zurückzusetzen und die Klemmen zu öffnen, um erneut zu starten.
4. Automatisierter Pufferaustausch
- Drücken Sie "Start", um das Pufferaustauschprogramm zu initiieren.
HINWEIS: Um den automatisierten Prozess manuell zu ändern, drücken Sie die Taste"Nächster", um zum nächsten Schritt zu wechseln, bevor Sie denTriggererreichen, oder drücken Sie "Pause", um den Prozess in Schach zu halten. Dadurch werden die Zellen durch das Kit umgewälzt, während nur die Ventile J und K geöffnet bleiben (Abbildung 1C). - Am Ende von Automatisierungsschritt 6 (Tabelle 1) wird der Prozess angehalten, wenn Luft im nun geleerten Beutel den Blasensensor auslöst. Drücken Sie "Weiter", um den Prozess auf den nächsten Schritt zu verschieben, wenn der Beutel tatsächlich leer ist, oder drücken Sie "Pause", um die Verarbeitung fortzusetzen, wenn der Sensor durch eine Blase in der Linie ausgelöst wurde.
5. Sammeln und Abtasten der Zellen
- Wenn der automatisierte Prozess abgeschlossen ist, schließen Sie alle Rohrklemmen. Öffnen Sie die Tür und nehmen Sie das Einweg-Kit aus dem Gerät. Trennen Sie die Spritze, um die Zellen für nachfolgende Prozesse zu sammeln. Nehmen Sie eine Probe der gesammelten Zellen für eine Zellanzahl und Lebensfähigkeitsprüfung (siehe Schritt 6.2).
6. Prozessvalidierung
- Führen Sie Steuerungsexperimente mit einem manuellen Pufferaustauschprotokoll durch.
- Zentrifugenzellsuspension bei 200 x g für 5 min. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie die Zellen mit 30 ml Zellwaschpuffer wieder auf. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension für 5 min wieder bei 200 x g. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie die Zellen mit 10 ml Zellwaschpuffer wieder auf.
- Führen Sie die Zellzählung über den Trypan-Blau-Ausschluss-Assay durch, um die Zelllebensfähigkeit mithilfe eines automatisierten Zellzählers zu bewerten.
- Führen Sie einen MTS-Test durch, um die Zellproliferation bei 2, 24 und 48 h zu quantifizieren.
HINWEIS: Der MTS-Assay wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers auf einer 96-Well-Gewebekulturplatte durchgeführt. Nach dem Pufferaustauschprozess wurden 100 L Aliquot zellkulturmedien (mit 10.000 Jurkat-Zellen oder 1.500) pro Bohrgut plattiert. Zu jedem Zeitpunkt wurden in jedem Brunnen 20 L MTS-Reagenzien zugegeben und für 2 h bei 37 °C inkubiert. Die Absorption wurde mit einem Plattenleser bei 490 nm bewertet. - Führen Sie funktionale Assays durch, um die Auswirkungen des automatisierten Prozesses mit dem manuellen Prozess auf die Jurkat-Zellen und die MSC-Funktion zu vergleichen.
- Kultur Jurkat-Zellen in einer 96-Well-Platte mit einer Dichte von 1 x 106 Zellen/ml stimuliert mit 50 ng/ml Phorbol 12-Myristate 13-Acetat (PMA) und 1 g/mL-Ionomycin (Zellstimulationscocktail) in DMEM:F12-Medien mit 10% fetalem Rinderserum (FBS) für 24 h. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C mit 5%CO2.
- Messen Sie die Interleukin-2-Produktion von Kulturüberstand mit perlenbasiertem ELISA-Assay (siehe Materialtabelle)gemäß den Anweisungen des Herstellers.
- Kultur MSCs in einer 12-Well-Platte bei der Dichte von 10.000 Zellen/cm2 in 1 ml DMEM:F12-Medien, die 10% FBS enthalten, ergänzt enden mit Interferon-50 Einheiten/ml für 48 h. Sammeln Überstand für den Kynurenin-Konzentrationstest zur Messung der Indollin-2,3-Dioxygenase (IDO)-Enzymaktivität von MSCs wie zuvor beschrieben21.
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Representative Results
In diesem Protokoll haben wir Jurkat-Zellen und MSCs als repräsentative Beispiele verwendet, um den automatisierten Pufferaustauschprozess zu demonstrieren. Während des Prozesses teilten Jurkat-Zellen und MSCs die gleichen Verarbeitungsschritte mit Unterschieden in der Zentrifugalkraft und Pumpengeschwindigkeit, die die Durchflussmenge steuern (Tabelle 1). Abbildung 2 zeigt repräsentative Bilder, die von der Kamera aufgenommen wurden, wie das wirbelgebundene Zellbett während des Pufferaustauschprozesses aussehen kann. Typischerweise ähnelt das wirbelierte Zellbett dem Bild in Abbildung 2A, wo sich Zellen in der Mitte und zur Vorderseite des Kegels mit einem kleinen Raum an der Spitze der Kammer ansammeln, wo sich Zellen nicht ansammeln und die Öffnung des Zelleinlasses sichtbar ist. Das wirbelgebundene Zellbett kann komprimiert werden (Abbildung 2B), wenn ein neuer Puffer eingeführt wird, der sich in einer anderen Viskosität oder Dichte befindet. In diesem Protokoll wurde die Pumpendrehzahl zu Beginn des Waschschritts von 30–35 ml/min auf 20 ml/min gesenkt. Sobald die Kammer mit dem neuen Puffer gefüllt wurde, wurde die Pumpengeschwindigkeit wieder normalisiert, um Pelletzellen an der Spitze der Kammer zu verhindern. Eine hohe Durchflussrate (Abbildung 2C) kann angewendet werden, um für lebende Zellen auszuwählen, da abgestorbene Zellen kleiner und leichter sind und durch Erhöhung der Durchflussrate aus der Kammer herausgedrängt werden können.
Der automatisierte Prozess des Pufferaustauschs wurde erreicht, indem zunächst die Zellen konzentriert und dann der Waschpuffer eingeführt wurde, der etwa das 10-fache des Volumens des Wirbelschichtbettes betrug. Die Zellen wurden dann auf das gewünschte Volumen formuliert. Diese drei Verarbeitungsschritte wurden so konzipiert, dass sie den gleichen Prinzipien wie ein manueller Pufferaustausch folgen. Typischerweise wird eine Zwei-Zyklus-Zentrifugation (200 x g, 5 min) verwendet, um einen manuellen Pufferaustausch durchzuführen, bei dem Zellen zum Konzentrieren pelletiert, zum Waschen resuspendiert, dann wieder zentrifugiert und auf das endgültige Volumen resuspendiert werden. Die Bearbeitungszeit der automatisierten Prozesse war kürzer als die manuellen (Abbildung 3). Die Wiederherstellungsrate zwischen manuellen und automatisierten Prozessen war sowohl für Jurkat-Zellen als auch für MSCs ähnlich, und die Zelllebensfähigkeit wurde durch den Prozess nicht beeinträchtigt (Abbildung 4). Die Zellqualität wurde durch Zellproliferation (MTS-Assay) und Zytokin/Enzymproduktion überprüft. Die zurückgewonnenen Zellen zeigten ähnliche Proliferationsraten zwischen dem manuellen und den automatisierten Prozessen (Abbildung 5A). Der Grad der Interleukin-2-Produktion aus Jurkat-Zellen und die IDO-Aktivität von MSCs waren ebenfalls zwischen den beiden Gruppen vergleichbar (Abbildung 5B und 5C).
| Schrittnummer | Beschreibung | Offene Ventile | Zentrifugengeschwindigkeit (g) | Pumpendrehzahl (ml/min) | Trigger | |
| 1 | Prime-Schläuche von B nach A | A, B, K | 10 | 50 | Volumen: 45 ml | |
| 2 | Gefüllte Blasenfalle von A nach B | A, B, K | 100 | 50 (umgekehrt) | Volumen: 10 ml | |
| 3 | Prime Tubing A bis D | A, D, K | 100 | 50 (umgekehrt) | Volumen: 2 ml | |
| 4 | Prime Schlauch J bis K | J, K | 100 | 50 | Volumen: 3 ml | |
| 5 | Wägezellen – Erststart D bis G | D, K, G | 1600 (Jurkat) 1500 (MSCs) | 25 (Jurkat) 30 (MSCs) | Volumen: 100 ml | |
| 6 | Wägezellen mit Blasenerkennung [Bei der Erkennung von Blasen-/Leerrohren hält das Programm an und wartet auf den Befehl des Operators, drückt 'pause' oder 'next'] | A, D, K | = letzter Schritt | 30 (Jurkat) 35 (MSCs) | Blasensensor D | |
| 7 | Leere verbleibende Medien an Port-D-Rohr | A, D, K | = letzter Schritt | = letzter Schritt | Volumen: 1,5 ml | |
| 8 | Waschzellen 1 | A, B, K | = letzter Schritt | 20 | Volumen: 20 ml | |
| 9 | Ramping-Up-Waschgeschwindigkeit | A, B, K | = letzter Schritt | 35 | Timer: 5 Sekunden Geschwindigkeitsrampe | |
| 10 | Waschzellen 2 | A, B, K | = letzter Schritt | = letzter Schritt | Volumen: 20 ml | |
| 11 | Bereiten Sie sich auf die Ernte vor | J, K | = letzter Schritt | = letzter Schritt | Timer: 2 Sekunden | |
| 12 | Wiederherstellen von Zellen zur Ausgabe und Verdünnung auf Zielvolumen | B, J, K | = letzter Schritt | 60 (Rückwärts) | Volumen: 10 ml | |
| Hinweis: '= letzter Schritt' ist eine Einstellungsoption für Zentrifugierungsgeschwindigkeit und Pumpengeschwindigkeit in der GUI. | ||||||
Tabelle 1: Automatisierte Pufferaustausch-GUI-Einrichtung für Jurkat-Zellen und MSCs.
Abbildung 1: Gegenstrom zentrifugalzellverarbeitendes System. (A) Ein schematisches Diagramm, das das Prinzip der Gegenflusszentrifugation veranschaulicht. Die Gegenströmungskraft ist in einem Gradienten innerhalb der Zellkammer vorhanden. Während der Zentrifugierung (grauer Pfeil) erhalten Zellen mit größeren Durchmessern eine höhere Sedimentationskraft, bei der die Zellen das Kraftgleichgewicht zum schmalen Ende der Kammer erreichen und ein wirbeltes Zellbett bilden. Zellreste und kleine Partikel, die zu klein sind, um in der Kammer zu bleiben, werden weggespült. (B) Das Gegenstromzentrifugalverarbeitungssystem besteht aus der Verarbeitungsvorrichtung und dem Einweg-Verarbeitungskit. (C) Die Single-Use-Kit-Konfiguration für das Pufferaustauschprotokoll. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Fluidisiertes Zellbett in der Zellkammer. Repräsentative Bilder eines wirbelierten Zellbetts unter (A) mittel, (B) niedrig und (C) hohe Durchflussrate. Die gepunktete Linie zeigt den Bereich des wirbelgebundenen Zellbetts innerhalb der Kammer an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Vergleich der Zellverarbeitungszeit von Jurkat-Zellen und MSCs mit manueller und automatisierter Verarbeitung. (n = 3–4 in jeder Gruppe werden die Daten als Mittelwert sD dargestellt). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Vergleich der Zelllebensfähigkeit und der Wiederherstellung von Jurkat-Zellen und MSCs durch manuelle und automatisierte Verarbeitung. Die Zelllebensfähigkeit (A) und die Wiederherstellung von Lebenden Zellen (B) wurden durch Trypan-Blau-Ausschluss-Assay mit einem automatisierten Zellzähler gemessen. Die Wiederherstellung von Lebendzellen wurde in Ermangelung von Serum oder bei der Verarbeitung von 3 x 106 oder 1 x 106 Zellen reduziert. (n = 4–9 in jeder Gruppe werden die Daten als Mittelwert sD dargestellt). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Zellproliferation und Zellfunktion aus manueller und automatisierter Verarbeitung. (A) MTS-Assay von Jurkat-Zellen und MSCs wurden bei 2, 24 und 48 h nach Pufferaustausch durchgeführt. Die Qualität der zurückgewonnenen Zellen wurde durch Die Interleukin-2-Produktion aus Jurkat-Zellen (B )und IDO-Aktivität in MSCs (C) quantifiziert. (n = 4–8 in jeder Gruppe werden die Daten als Mittelwert sD dargestellt). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 6: Fluidisierte Zellbettstabilität bei unterschiedlicher Durchflussrate. Für jeden Zelltyp wurden zwei Prozesse durchgeführt. In einem Prozess entweder 3 x 107 Jurkat-Zellen oder 1 x 107 MSCs. Im zweiten Prozess wurde die 10-fache Anzahl der Zellen verwendet. In beiden Prozessen wurden 10 ml Zellelutriat aus Port A mit verschiedenen Durchflussraten mit der in diesem Protokoll angegebenen Zentrifugengeschwindigkeit (1.600 x g für Jurkat-Zellen und 1.500 x g für MSCs) gesammelt. Die Anzahl der Zellen im Elutriate wurde bestimmt und als Prozentsatz der Gesamtmenge der in der Kammer geladenen Zellen dargestellt. (n = 3 für jede Gruppe werden die Daten als Mittelwert sD dargestellt). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Das beschriebene automatisierte Pufferaustauschprotokoll ist einfach und benutzerfreundlich. Dennoch gibt es einige wichtige Schritte in diesem Protokoll, die kritisch sind und besondere Aufmerksamkeit erfordern. Nach unserer Erfahrung sollte jeder Durchlauf bei der Verarbeitung größerer Zellen wie MSCs (durchschnittlicher Durchmesser 10–15 m) mindestens 1 x 107 Zellen umfassen, um eine optimale Zellwiederherstellung zu erreichen (Abbildung 4B). Die Verarbeitung kleinerer Zellen, wie z. B. Jurkat-Zellen (durchschnittlich 10 m Durchmesser), erfordert etwa 3 x 107 Zellen, um ein stabiles wirbeliertes Zellbett zu erreichen (Abbildung 4B). Wenn die Zellzahl zu niedrig ist, werden Zellen eher aus dem Wirbelbett entfernt, was sich auf die endgültige Zellwiederherstellung auswirkt. Darüber hinaus haben wir Zellverlustraten bei unterschiedlichen Pumpengeschwindigkeiten verglichen, wenn eine konstante Zentrifugalgeschwindigkeit angewendet wird. Hier stellten wir fest, dass der Zellverlust mit der Durchflussrate zunahm (Abbildung 6), was auf die zunehmende Instabilität des Wirbelbettes bei höheren Durchflussraten zurückzuführen ist. Der Prozentsatz des Zellverlusts war jedoch geringer, als die Anzahl der Zellen in die Kammer geladen wurde, was darauf hindeutet, dass eine höhere Pumpengeschwindigkeit bei der Verarbeitung einer größeren Anzahl von Zellen angewendet werden kann, um eine schnellere Verarbeitung zu ermöglichen. In Schritt 5 des Prozesses wurden 100 ml Kulturmedien aus der Kammer zurück in den Zelltransferbeutel zurückgeführt, damit sich das Wirbelbett vor Volumenreduktion und Pufferaustausch bilden und stabilisieren kann. Wenn die Zellkonzentration niedrig ist (z. B. unter 0,2 x 106/ml), muss der Rezirkulationsschritt möglicherweise verlängert werden, um genügend Zellen zur Bildung des wirbelgebundenen Zellbetts zu ermöglichen. Ebenso kann bei hoher Zellkonzentration der Rezirkulationsschritt verkürzt werden.
Das Vorhandensein von Serum im Waschpuffer ist auch für die Zellwiederherstellung von entscheidender Bedeutung. Frühere Studien haben gezeigt, dass hydrodynamischer Stress den nekrotischen Zelltod ohne Pufferproteine verursachen kann22,23. Die Strömungsdynamik des Gegenstromzentrifugalsystems ist recht komplex. In diesem Protokoll sanken die Zellwiederherstellungsraten auf etwa 70 %, wenn der Prozess ohne Serum durchgeführt wurde (Abbildung 4B). Obwohl der genaue Mechanismus nicht klar ist, war das Vorhandensein von Serum in Kulturmedien oder Albumin in Waschpuffern in der Lage, die potenziellen mechanischen Schäden an den Zellen zu mildern. Für Anwendungen, die serumfreie Puffer benötigen, sind Hydroxyethylstärke und Dextran 40 Beispiele für Nicht-Protein-Additive, die häufig in der Zellherstellung zum Schutz vor hydrodynamischer Belastung24,25verwendet werden.
Die Antiflow-Zentrifugationstechnologie wurde in der biopharmazeutischen Großproduktion und Der Blutproduktverarbeitungeingesetzt 17. Die Anwendungen der FCKW-Technologie in der Zellfertigung in kleinem Maßstab (d. h. 0,1–10 L) beschränken sich häufig auf die Isolierung mononukleantinZellen von Aphereseprodukten wie dem Elutra (Terumo BCT)26, bei dem zusätzliche manuelle Eingriffe erforderlich sind, um Wasch- und Konzentratschritte durchzuführen. Weitere kleine Zellverarbeitungsplattformen sind Membranfiltrations-basierte Pufferaustauschsysteme wie das LOVO (Fresenius Kabi)27 und die vertikale Zentrifugationstrennung wie der Sepax (GE Healthcare)28. Obwohl es schwierig ist, einen direkten Vergleich zwischen Geräten durchzuführen, ist einer der Vorteile dieses Gegenstromzentrifugalgeräts seine Fähigkeit, sehr kleine Ausgangsvolumina (mindestens 5 ml) zu liefern, was die kleinste unter den derzeit verfügbaren Zellverarbeitungsplattformen ist. Das geringe Ausgangsvolumen eignet sich für Anwendungen wie das Formulieren von Zellen für lokale Injektionen29 oder Infusionen für Neonate30. Die in das Gerät eingebettete Kamera ist auch eine einzigartige Funktion, die die Visualisierung des wirbelgebundenen Zellbetts während der Prozessentwicklungsphase ermöglicht.
Eine der Einschränkungen der FCKW-Technologie ist, dass sie empfindlich auf die Größe und Dichte der Zellen reagiert. Beim Einrichten eines Pufferaustauschprotokolls für einen anderen Zelltyp sollte das hier vorgestellte Protokoll als Richtschnur für Benutzer dienen, um ihre Bedürfnisse zu optimieren, wobei die Größe ihrer Zellen von Interesse und die Dichte ihrer Zellsuspension zu berücksichtigen sind. Obwohl das aktuelle Protokoll für die Verarbeitung von bis zu 5 L Medien nutzbar ist, verlängert sich die Verarbeitungszeit erheblich (d. h. 1–2 h). Es ist wichtig zu beachten, dass die Auswirkungen der verlängerten Verarbeitungszeit auf die Zellqualität in dieser aktuellen Studie nicht untersucht wurden.
Zukünftige Studien werden die Auswirkungen der Verarbeitungsgeschwindigkeit und Verarbeitungszeit auf die Zellfunktion bewerten, um die maximale Verarbeitungskapazität des Geräts zu bestimmen. Darüber hinaus können in zukünftigen Studien andere Anwendungen wie die Entfernung von Dimethylsulfoxid (DMSO) aus kryokonservierten Produkten und die selektive Entfernung abgestorbener Zellen untersucht werden.
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Disclosures
SW, IF und DJ sind COO, CTO und CEO von Scinogy Pty. Ltd. Der Zugriff auf das CFC-Gerät wurde ebenfalls von Scinogy bereitgestellt.
Acknowledgments
Diese Arbeit wird durch das Operational Infrastructure Support Program der viktorianischen Regierung und den Technologiegutschein der viktorianischen Regierung unterstützt, der vom Department of Economic Development, Jobs, Transport and Resources bereitgestellt wird. RL ist Träger eines National Health and Medical Research Council Career Development Fellowship. AL ist Träger des Australian Postgraduate Award.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 20 ml Luer lock syringes | BD | 302830 | |
| 20% Human serum albumin (HSA) | CSL Behring | AUST R 46283 | |
| 4-(Dimethylamino)benzaldehyde | Sigma-Aldrich | 156477-25g | |
| 500ml IV saline bag | Fresenius Kabi | K690521 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Thermo Fisher Scientific | 15240112 | |
| Automated cell counter (Countess) | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| Cell counting chamber slides | Thermo Fisher Scientific | C10228 | |
| Cell stimulation cocktail (500x) | Thermo Fisher Scientific | 00-4970-93 | |
| Cell transfer bags | Terumo | T1BBT060CBB | |
| CellTiter AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS) | Promega | G3582 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| DMEM: F12 media | Thermo Fisher Scientific | 11320082 | |
| EnVision plate Reader | Perkin Elmer | N/A | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 10099141 | |
| Human Interleukin 2 (IL2) Kit | Perkin Elmer | Al221C | |
| Luer (female) fittings | CPC | LF41 | |
| PC laptop or PC tablet device | ASUS | N/A | |
| Plate reader (SpectraMax i3) | Molecular Device | N/A | |
| Recombinant Human IFN-γ | PeproTech | 300-02 | |
| Rotea counterflow centrifuge cell processing device | Scinogy | N/A | |
| Rotea single-use processing kit | Scinogy | N/A | |
| RPMI media | Thermo Fisher Scientific | 11875119 | |
| Surgical scissors | ProSciTech | 420SS | |
| Trichloroacetic acide | Sigma-Aldrich | T6399-250g | |
| Trypan Blue stain | Thermo Fisher Scientific | T10282 | |
| Trypsin digestion enzyme (TrypLE Express Enzyme) | Thermo Fisher Scientific | 12604013 |
References
- Lopes, A. G., Sinclair, A., Frohlich, B. Cost Analysis of Cell Therapy Manufacture: Autologous Cell Therapies, Part 1. BioProcess International. 16 (3), (2018).
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